Name: Medición de los niveles de mRNA con el tiempo durante la levadura S. cerevisiae por respuesta hipóxica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Aprende a medir niveles de mRNA durante la respuesta hipóxica en S. cerevisiae mediante RNA-seq. Este protocolo permite analizar la dinámica de expresión génica en tiempo real bajo estrés ambiental.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos el Instituto Lewis Sigler integradora genómica instalaciones centrales para secuenciación en la Universidad de Princeton para asesoramiento técnico y preparación de biblioteca de RNA y secuenciación. Este trabajo fue financiado por becas de la Universidad de Rowan y NIH NIGMS R15GM113187 a M.J.H.

1. inducción de hipoxia
<ol><li>Un día o más antes del curso de tiempo de hipoxia: preparar la incubadora, celular filtrado sistema de vacío, tanque de gas, frascos, tapones, tubos de vidrio y tubos, como en la Tabla de materiales.</li>
	<li>Coloque el tanque de2 N, incubadora, sistema de aspiración y filtración en proximidad cercana, a habilitar el procesamiento rápido de las células.</li>
	<li>Preparar medio YPD líquido estéril (1% Extracto de levadura, 2% peptona, 2% glucosa) mezclando los componentes en una botella de vidrio y autoclave.</li>
	<li>Plan de diseño de frascos en la incubadora. Nota: El tanque de2 N, el primer frasco será una trampa de agua, el segundo matraz será el último punto de tiempo, el tercer matraz será el segundo a último momento y así sucesivamente hasta el último frasco que es una trampa de agua final. La figura 1 muestra el orden y las conexiones entre los frascos.</li>
	<li>El día anterior el curso del tiempo, inocular una colonia de levadura en una cultura de 5 mL de líquido YPD dentro de un tubo de ensayo estéril. Específicamente, recoger una colonia completa de una placa con un palito aplicador estéril. Coloque el palo en el YPD líquido y agitar el palo hasta que la mayoría de las células en suspensión.</li>
	<li>Gire los tubos a 30 ° C durante la noche (~ 16 h). Nota: Después de 16 horas, las células de tipo salvaje alcanzar saturación (~ 2 x 108 células/mL), indicado por una cultura muy nublada. Otras cepas pueden tardar más tiempo para alcanzar la saturación y prueba midiendo la concentración de células con un espectrofotómetro, tal como se indica en el paso 1.9.4.</li>
	<li>En el día del curso del tiempo, después de 16 h de incubación, diluir la cultura saturada 1:50 por utilizando una pipeta de 5 mL a 4 ml de noche cultura en 196 mL de YPD líquido dentro de un matraz de 500 mL estéril. Crecer con agitación a ~ 200 rpm durante 4 horas a 30 ° C. Nota: Después de 4 h, una cultura de tipo salvaje llega a una concentración de medio registro de ~ 1-2 x 107 células/mL.</li>
	<li>Durante la 4 h de incubación, etiqueta los frascos (para las trampas de la hipoxia y el agua) y los 50 mL tubos de recogida. Si la incubadora en el paso 1.7 anterior no se utiliza para el curso del tiempo de hipoxia, encienda la otra incubadora y 30 ° C.</li>
	<li>
Justo antes de someter las células a la hipoxia:
	<ol>
<li>Añadir 50 mL de agua a dos de los frascos estéril de 250 mL que servirán como las trampas de agua.</li>
		<li>Llenar 1/3 de hielo de cubo con nitrógeno líquido y sumerja un bastidor de espuma de poliestireno para sostener tubos de centrífuga de 50 mL.</li>
		<li>Configurar el sistema de filtro para recolección de células. Añadir un disco de filtro estéril en la unidad inferior del sistema de filtración utilizando pinzas estériles, teniendo cuidado de tocar sólo los bordes del disco de filtro. Coloque la unidad en la unidad inferior del filtro filtro y asegure con abrazaderas el sistema. Asegurar que las unidades superior e inferior están alineadas para que haya un sello hermético y no hay fugas.</li>
		<li>Medir la concentración de células con un espectrofotómetro. Diluir las células por lo que puede medirse en el rango lineal del espectrofotómetro – OD600 entre ~0.2 - 0,6, dependiendo del espectrofotómetro. Nota: Una unidad de OD600 es ~ 3 x 107 células/mL, dependiendo de la morfología de la célula y espectrofotómetro. Se espera una concentración de ~ 1-2 x 107 células/mL, correspondiente a OD600 ~0.33 - 0.66.</li>
		<li>
Obtener rápidamente la muestra de tiempo 0.
		<ol>
<li>Conecte el sistema de filtro a un vacío fuerte (~ 10 mbar) a través de tubo de vacío y una trampa de frasco de 1.000 mL. Encienda la aspiradora. Vierta la cultura (generalmente unos 20 mL) en la unidad y espere a líquido ser tirado a través del filtro (~ 10 s, dependiendo de la fuerza del vacío).</li>
			<li>Con cuidado retire el disco de filtro con unas pinzas limpias y colocar en un tubo de centrífuga de 50 mL. Coloque inmediatamente el tubo de centrífuga en el estante sumergido en nitrógeno líquido. Importante, no pre-enfriar los tubos antes de insertar el filtro ya que podría explotar los tubos.</li>
			<li>Después de > 30 s, lugar el tubo en un congelador de-80 ° C para la posterior extracción de RNA. Después de cada filtración, limpiar y volver a montar el sistema de filtro. Enjuague el sistema tirando agua a través de 10 s sin un disco de filtro. Por último, seque el sistema con una toalla de papel.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Diluir la cultura 4 h en frascos diferentes para los distintos puntos de tiempo, para que cada frasco alcanza registro media concentración (~ 1-2 x 107 células/mL) en el momento indicado de la hipoxia. Nota: La tabla 1 muestra las diluciones que se utilizaron para la cepa haploide de tipo salvaje S288C HAP1+ . Es aconsejable probar cada cepa en estas condiciones de cultivo hipóxico y ajustar en consecuencia las diluciones.</li>
		<li>Una vez que las células y los medios de comunicación se añaden a los matraces, reemplazar el papel de aluminio que cubre el frasco con un tapón que contiene dos tubos de vidrio insertados.</li>
		<li>Coloque los frascos en la incubadora en el diseño determinado anteriormente.</li>
		<li>Conecte firmemente la tubería como se muestra en la figura 1.</li>
		<li>Compruebe que todos los tapones se empujan firmemente en los orificios del matraz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A tiempo 0, abra la válvula del regulador. Luego ajuste el medidor de flujo a 3 L/min. Nota: Burbujeo se observará en ambos frascos de agua, indicando flujo adecuado de gas. Si este no es el caso, compruebe que los tapones estén bien apretadas y tubería esté correctamente conectada.</li>
	<li>La incubadora de cierre y ajuste la velocidad de agitación a ~ 200 rpm. Iniciar un temporizador.</li>
	<li>Antes de cada momento, establecer el sistema de filtración como se describe anteriormente en el paso 1.9.3.</li>
	<li>
En cada punto del tiempo (p. ej., 5 min, 10 min, etc.), con dos personas procesar rápidamente las celdas como sigue:
	<ol>
<li>Primera persona: Retire el matraz adecuado del soporte y sacar el tapón (con tubo de vidrio conectado). Nota: Esto no interrumpirá el flujo de N2 a cualquiera de los frascos de cultivo restantes pero rompe temporalmente el flujo a la última trampa de agua.</li>
		<li>Segunda persona: Pipetear 1 mL de cultivo y pipetear en una cubeta. Vuelva a conectar el tubo del frasco de cultura que está ahora en el extremo de la línea a la última trampa de agua (un tubo y una tapón voluntad eliminarse en el proceso). Entonces, medir la concentración de células en la cubeta, como se describió anteriormente en el paso 1.9.4.</li>
		<li>Primera persona: Vierta el resto de la cultura en el sistema de filtración de vacío y luego realizar filtrado y congelación como se describió anteriormente en el paso 1.9.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cuando haya terminado con todos los puntos de tiempo, apague el gas N2 . Primero cerrar el regulador y esperar a que la presión liberar y luego apague el medidor de flujo. Finalmente, desmontar el sistema y limpiar todos los materiales con agua y luego con etanol al 70%.</li>
</ol>2. extracción de RNA
<ol><li>Preparar buffer RLT para purificación del ARN a columna, como se describe en la Tabla de materiales.</li>
	<li>Preparar una solución de trabajo de la ADNsa añadiendo 10 μl de la solución madre de DNasa a 70 μl de buffer RDD por muestra (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Retirar los tubos de 50 mL que contiene filtros y células del congelador de-80 ° C y coloque en hielo se descongele (~ 15 min). Realice los pasos siguientes con los tubos en hielo.</li>
	<li>Etiqueta 2 mL tubos de tapón de rosca y colocar en hielo, un tubo para cada muestra. Añadir ~0.6 mL de ácido lavado los granos en cada tubo, utilizando un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL cucharada y medir las cuentas.</li>
	<li>Añadir 0,6 mL del tampón frío de la RLT en los tubos de 50 mL.</li>
	<li>Pipeta hacia arriba y hacia abajo para quitar las células de filtro y suspender en la solución. Evitar que el filtro permanezca en la solución como empapará el filtro de la solución. Quitar toda la solución absorbente en el filtro utilizando la punta de la pipeta para apretar el filtro contra la pared del tubo.</li>
	<li>Transferir todo el líquido del tubo de 50 mL a los tubos de tapón de rosca que contiene granos.</li>
	<li>Colocar los tubos de tapón de rosca en un homogeneizador de molino de grano y duración de un minuto. Inmediatamente Coloque los tubos en hielo durante tres minutos. Otra vez, colocar los tubos en el homogenizador y duración de un minuto.</li>
	<li>Retirar los tubos del homogeneizador y el lugar en el hielo durante 5 minutos. Las cuentas se asentarán en la parte inferior de los tubos.</li>
	<li>Realizar el resto de los pasos a temperatura ambiente.</li>
	<li>Con una pipeta, transferir solamente el lisado (~ 350 μL), evitando los granos, a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Microcentrífuga por 2 min a máxima velocidad y luego traslado el sobrenadante a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL.</li>
	<li>Agregar 1 volumen de etanol al 70% (a base de etanol de grado biología molecular prueba 200). Mezclar por pipeteo.</li>
	<li>Transferencia de la solución y cualquier precipitado a una columna de RNA que se ha colocado dentro de un tubo de colección de 2 mL.</li>
	<li>Centrifugar por 15 s en ≥12, 000 x g y descartar el flujo a través (el líquido en el tubo).</li>
	<li>Añadir 350 μl de tampón RW1 a la columna. Centrifugar por 15 s en ≥12, 000 x g y descartar el flujo a través.</li>
	<li>Añadir 80 μl DNasa I mezcla de incubación de la membrana de la columna (no permita que en los lados del tubo) y dejar para reposar 15 minutos.</li>
	<li>Añadir 350 μl de tampón RW1 a columna. Microcentrífuga de 15 s en ≥12, 000 x g y descartar el flujo a través.</li>
	<li>Añadir 500 μl de tampón RPE a la columna. Microcentrífuga de 15 s en ≥12, 000 x g y descartar flujo a través.</li>
	<li>Añadir 500 μl de tampón RPE a la columna. Microcentrífuga por 2 min a ≥12, 000 x g.</li>
	<li>Cuidadosamente retire la columna y coloque en un tubo nuevo de colección de 2 mL. Microcentrífuga a toda velocidad durante 1 minuto (para secar completamente la membrana).</li>
	<li>Deseche el tubo de la colección y coloque la columna en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Añadir 30 μl de agua libre de ARNasa a la membrana de la columna.</li>
	<li>Eluir el RNA de la columna por microcentrifuging durante 1 min a ≥12, 000 x g. Al cargar las columnas en la microcentrífuga, asegúrese de que las tapas del tubo de colección se enfrentan en la dirección de la centrifugadora gira, para evitar que las tapas de interrupción.</li>
	<li>Añadir otro 30 μl de agua libre de ARNasa a la membrana de la columna, manteniendo la columna en el mismo tubo de microcentrífuga.</li>
	<li>Microcentrífuga durante 1 min a ≥12, 000 x g, por lo que el volumen del efluente final es 60 μL.</li>
	<li>Almacenar cada tubo de 1,5 mL que contiene 60 μL de RNA en el congelador de-80 ° C.</li>
</ol>3. determinar la calidad y la concentración de RNA
<ol><li>Medir la concentración de ARN y ADN en cada muestra de RNA, con un Fluorímetro, (b) ADN y RNA-específico fluorescente tintes y tubos de ensayo (c), que se enumeran en la Tabla de materiales. Siga las instrucciones de los tintes y el fluorómetro.</li>
	<li>Por otra parte, medir la concentración de ácidos nucleicos con un espectrofotómetro de UV a 260 nm. Nota: Una una lectura260 de 1.0 es equivalente a ~ 40 μg/mL solo ARN.</li>
	<li>Prueba calidad de RNA ejecutando el RNA en un analizador comercial de ácido nucleico (véase Tabla de materiales) o en un formaldehído/agarosa estándar gel 26.</li>
</ol>4. RNA-seq análisis
<ol><li>De la estirpe de RNA total, son 21 μl de 100 ng/μl de RNA en agua libre de ARNasa. Use 1 μl de este 21 μL para la concentración de RNA como el anterior. Presentar lo restantes 20 μl (2 μg) ARN total para un centro de secuenciación externa para el enriquecimiento de mRNA, preparación de la biblioteca específica de filamento (con ocho o más códigos de barras para multiplexación) y secuencia (véase Tabla de materiales). Alternativamente, localmente realizar enriquecimiento de mRNA y la preparación de la biblioteca y luego presentar la biblioteca para la secuencia.</li>
	<li>Piscina de ocho o más muestras de multiplexado y la secuencia en un carril de un secuenciador de última generación.</li>
	<li>Descargar el fichero FASTQ que contienen toda las secuencia de lecturas y lee el índice correspondiente. Descargar el archivo de texto que contiene los códigos de barras multiplex. Nota: Las lecturas de índice pueden estar presentes en un archivo separado de FASTQ. Coloque todos estos archivos en un directorio.</li>
	<li>Colocar el script que aquí, "fastq_pipeline.sh", en el mismo directorio. Editar este script como apropiado para el experimento y los directorios del ordenador. Nota: esta secuencia contiene extensas anotaciones explicando los pasos. En Resumen, la calidad de la secuencia de comandos recorta la lee la Lee los mapas del genoma y genera un archivo delimitado por tabuladores que contiene el número de lecturas por gen por cada muestra.</li>
	<li>Depositar los archivos FASTQ y crudos datos leer en Gene expresión Omnibus de NCBI antes publicación 27. Siga las instrucciones para "Datos de la secuencia de alto rendimiento de envío a GEO": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.</li>
	<li>Importar los datos de cuenta leer en el ambiente estadístico de R y realizar análisis estadístico, utilizando el script de R que aquí, "time_course_script. R". Editar este script como apropiado para el experimento y los directorios del ordenador. Nota: Esta secuencia contiene extensas anotaciones explicando los pasos. En Resumen, este script importa los datos leídos, normaliza la Lee, identifica genes que cambian significativamente durante el curso del tiempo, realiza análisis de PCA y grafica la expresión de genes seleccionados.</li>
</ol>

<ol><li>Semenza, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensing%2C+homeostasis%2C+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22New+Eng.+J+Med%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensing, homeostasis, and disease.</a> New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).</li>
<li>Butler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoxia+and+gene+expression+in+eukaryotic+microbes%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Micro%22%5BJournal%5D)">Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes.</a> Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).</li>
<li>Ratcliffe, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensing+and+hypoxia+signalling+pathways+in+animals%3A+the+implications+of+physiology+for+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer.</a> J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).</li>
<li>Rosenfeld, E., Beauvoit, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+the+non-respiratory+pathways+in+the+utilization+of+molecular+oxygen+bySaccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).</li>
<li>Ter Linde, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+transcriptional+analysis+of+aerobic+and+anaerobic+chemostat+cultures+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae.</a> J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).</li>
<li>Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microarray-assisted+screen+for+potential+Hap1+and+Rox1+target+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).</li>
<li>Kwast, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+analyses+of+anaerobically+induced+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+functional+roles+of+Rox1+and+other+factors+in+mediating+the+anoxic+response%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response.</a> J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).</li>
<li>Becerra, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+transcriptome+in+aerobic+and+hypoxic+conditions%3A+effects+of+hap1%2C+rox1%2C+rox3+and+srb10+deletions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions.</a> Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).</li>
<li>Lai, L. -C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamical+remodeling+of+the+transcriptome+during+short-term+anaerobiosis+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+differential+response+and+role+of+Msn2+and%2For+Msn4+and+other+factors+in+galactose+and+glucose+media%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media.</a> Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).</li>
<li>Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic-State-Dependent+Remodeling+of+the+Transcriptome+in+Response+to+Anoxia+and+Subsequent+Reoxygenation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Euk.+Cell%22%5BJournal%5D)">Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).</li>
<li>Hickman, M. J., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heme+levels+switch+the+function+of+Hap1+of+Saccharomyces+cerevisiae+between+transcriptional+activator+and+transcriptional+repressor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor.</a> Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).</li>
<li>Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Hog1+mitogen-activated+protein+kinase+mediates+a+hypoxic+response+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 188 (2), 325-338 (2011).</li>
<li>Bendjilali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time-Course+Analysis+of+Gene+Expression+During+the+Saccharomyces+cerevisiae+Hypoxic+Response%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response.</a> G3. 7 (1), 221-231 (2017).</li>
<li>Chellappa, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+membrane+proteins%2C+Spt23p+and+Mga2p%2C+play+distinct+roles+in+the+activation+of+Saccharomyces+cerevisiae+OLE1+gene+expression.+Fatty+acid-mediated+regulation+of+Mga2p+activity+is+independent+of+its+proteolytic+processing+into+a+soluble+transcription+activator%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator.</a> J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).</li>
<li>Abramova, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+mechanisms+controlling+expression+of+the+DAN%2FTIR+mannoprotein+genes+during+anaerobic+remodeling+of+the+cell+wall+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 157 (3), 1169-1177 (2001).</li>
<li>Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SREBP+Pathway+Responds+to+Sterols+and+Functions+as+an+Oxygen+Sensor+in+Fission+Yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast.</a> Cell. 120 (6), 831-842 (2005).</li>
<li>Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+%26%2334%3Bnatural%26%2334%3B+mutation+in+Saccharomyces+cerevisiae+strains+derived+from+S288c+affects+the+complex+regulatory+gene+HAP1+%28CYP1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Gen%22%5BJournal%5D)">A &#34;natural&#34; mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1).</a> Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Gen%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Anders, S., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+expression+analysis+for+sequence+count+data%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Differential expression analysis for sequence count data.</a> Genome Biol. 11 (10), R106(2010).</li>
<li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+survey+of+best+practices+for+RNA-seq+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">A survey of best practices for RNA-seq data analysis.</a> Genome Biol. 17 (1), 13(2016).</li>
<li>Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trimmomatic%3A+a+flexible+trimmer+for+Illumina+sequence+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinf%22%5BJournal%5D)">Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data.</a> Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).</li>
<li>Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TopHat2%3A+accurate+alignment+of+transcriptomes+in+the+presence+of+insertions%2C+deletions+and+gene+fusions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions.</a> Genome Biol. 14 (4), R36(2013).</li>
<li>Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HTSeq--A+Python+framework+to+work+with+high-throughput+sequencing+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinf%22%5BJournal%5D)">HTSeq--A Python framework to work with high-throughput sequencing data.</a> Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).</li>
<li>R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna. Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.R-project.org">https://www.R-project.org</a> (2015).</li>
<li>Love, M. I., Huber, W., Anders, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Moderated+estimation+of+fold+change+and+dispersion+for+RNA-seq+data+with+DESeq2%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2.</a> Genome Biol. 15 (12), 550(2014).</li>
<li>Brown, T., Mackey, K., Du, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+RNA+by+Northern+and+Slot+Blot+Hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Prot.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization.</a> Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).</li>
<li>Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Expression+Omnibus%3A+NCBI+gene+expression+and+hybridization+array+data+repository%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository.</a> Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).</li>
<li>Cherry, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccharomyces+Genome+Database%3A+the+genomics+resource+of+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast.</a> Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).</li>
<li>Hothorn, T., Everitt, B. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHothorn%2C+T+%22A+Handbook+of+Statistical+Analyses+using+R%22">A Handbook of Statistical Analyses using R</a>. , 3rd ed, CRC Press: Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL. (2014).</li>
<li>Saldanha, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Java+Treeview--extensible+visualization+of+microarray+data%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Java Treeview--extensible visualization of microarray data.</a> Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).</li>
<li>Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cluster+analysis+and+display+of+genome-wide+expression+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Nat.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns.</a> Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).</li>
<li>Davies, B. S. J., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Role+for+Sterol+Levels+in+Oxygen+Sensing+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 174 (1), 191-201 (2006).</li>
<li>Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+Recombination+is+Activated+at+Early+Time+Points+Following+Exposure+to+Cobalt+Chloride+Induced+Hypoxic+Conditions+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Ind.+J.+Microb%22%5BJournal%5D)">Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae.</a> Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).</li>
<li>Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+Snf7p+and+Rim101p+in+the+transcriptional+regulation+of+TIR1+and+other+anaerobically+upregulated+genes+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae.</a> FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).</li>
<li>Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Chromatin+and+Transcriptional+Landscape+of+Native+Saccharomyces+cerevisiae+Telomeres+and+Subtelomeric+Domains%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains.</a> Genetics. 200 (2), 505-521 (2015).</li>
<li>Collart, M. A., Oliviero, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+yeast+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Prot.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of yeast RNA.</a> Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).</li>
<li>Blankenberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+FASTQ+data+with+Galaxy%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinf%22%5BJournal%5D)">Manipulation of FASTQ data with Galaxy.</a> Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).</li>
<li>Martini, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((timeClip%3A+pathway+analysis+for+time+course+data+without+replicates%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinf%22%5BJournal%5D)">timeClip: pathway analysis for time course data without replicates.</a> BMC Bioinf. 15, Suppl 5. (2014).</li>
<li>Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+series+expression+analyses+using+RNA-seq%3A+a+statistical+approach%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Res.+Int%22%5BJournal%5D)">Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach.</a> BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este estudio, se midió los niveles de mRNA de los genes durante la hipoxia en la levadura S. cerevisiae. El objetivo era analizar cómo global gene expresión cambios debido al crecimiento en un entorno controlado cerca-anóxica. Varias medidas fueron tomadas para asegurar que el método descrito aquí fue cuidadosamente controlada y reproducible. En primer lugar, las células fueron expuestas a un ambiente hipóxico precisamente definido: 99.999% N2 en medios enriquecidos (YPD). Otros estudios de hipoxia...

Muchos organismos responden a la hipoxia, o baja O2, alterando gene expression 1,2,3. Esta respuesta ayuda a las células frente a la falta de un sustrato crítico para la respiración aeróbica y para varias reacciones biosintéticas, pero también con un cambio de estado de redox 4. Varios estudios de microarray en S. cerevisiae muestran que los niveles de mRNA de cientos de genes cambian en respuesta a hipoxia 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. recientemente, RNA-seq fue utilizado para caracterizar cambios de expresión génica en el tiempo durante la hipoxia 13. Aquí, se presentan los detalles experimentales y discuten.
La hipoxia puede lograrse de varias maneras, cada una produciendo un nivel diferente de O2. Aquí, la hipoxia fue establecida por continuamente que fluye ultra alta pureza N2 en frascos, que disminuye [O2] inmediatamente disuelta con reproductivos cinética 10. Es posible que algunas O2 moléculas presentes que contribuyen a la expresión génica y el metabolismo pero este entorno se considera muy cerca de anaerobios. En ausencia de O2, las células de levadura no pueden sintetizar hemo, ergosterol y ácidos grasos insaturados 4,12,14. Así, estudios previos han incluido estos metabolitos cuando levadura sin oxígeno 5,10,15. Sin embargo, muchas respuestas hipóxicas son mediadas por el agotamiento de estos metabolitos y así rellenarlos invierte en el gen hipóxico expresión respuestas 12,16. Con el fin de imitar la hipoxia natural, estos metabolitos no fueron agregados a los medios de comunicación. En el poco tiempo que las células fueron expuestas a hipoxia sin la presencia de estos metabolitos esenciales, no había ningún aumento sensible en la muerte celular (datos no mostrados) ni a estrés prolongado respuesta 13.
La respuesta también es dependiente de la cepa y su genotipo. Especialmente importantes son los alelos de los reguladores conocidos de respuestas hipóxicas 2. El fondo de la cepa de S288C es altamente deseado para que resultados pueden ser comparados con los otros estudios genómicos realizados con esta variedad. Sin embargo, S288C contiene un alelo de pérdida de la función parcial de la HAP1 gen 17, un regulador transcripcional esencial para la respuesta hipóxica. Este alelo fue reparado en S288C usando un wildtype copia de la Σ1278b cepa fondo 11.
Expresión génica es altamente dependiente sobre el medio ambiente celular. Por lo tanto, al realizar el análisis del mRNA del genoma, es importante mantener un ambiente constante mientras varía otro parámetro como tiempo, estímulo o genotipo. Para lograr resultados altamente reproducibles, considere estas tres prácticas para el estudio y sus réplicas biológicas o técnicas. En primer lugar, el mismo experimenter(s) debe realizar el estudio, desde prácticas técnicas pueden variar a través de experimentadores. En segundo lugar, del mismo lote de ingredientes debe utilizarse en los medios de crecimiento, ya que cada lote tiene una composición ligeramente diferente que puede afectar la expresión génica. En tercer lugar, para minimizar los efectos del ciclo de la célula, cada momento debe consistir en células asincrónicas en la fase de registro medio de crecimiento (1-2 x 107 células/mL).
Al caracterizar una respuesta compleja como la gene expresión respuesta a la hipoxia, un curso del tiempo es ventajoso para la determinación de la cinética de varios eventos. Puntos de tiempo específico deben ser elegidos que capturará los principales cambios de la respuesta. En este estudio, se observaron puntos de tiempo entre 0 y 4 h, porque pasados experimentos revelaron cambios generalizados en la expresión génica durante este período 13.
Para medir la expresión génica global, RNA-seq fue usado 18,19. Este método utiliza secuenciación de próxima generación para determinar la abundancia relativa de transcripción de cada gen. En comparación con el análisis de microarrays de DNA, RNA-seq exhibe una mayor sensibilidad (para detectar menos abundantes transcripciones), un mayor rango dinámico (para medir cambios veces mayor) y reproducibilidad superior (seguir con precisión la expresión génica en el tiempo). Normalmente, más celular ARN es ARN ribosómico que muchos métodos han sido desarrollados para enriquecer determinados RNA especie 20. Aquí, granos de poly-T se utilizaron para purificar las transcripciones del mRNA de la poli-que la contengan, aunque varios comercialmente - kits disponibles de agotamiento de rRNA también podrían ser eficaces en el enriquecimiento de mRNA.
Aquí, se caracterizó la respuesta de expresión del gen de S. cerevisiae a la hipoxia. Las células fueron expuestas a la hipoxia y luego muestras en ocho puntos del tiempo (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 y 240 min). Para confirmar la reproducibilidad e identificar estadísticamente cambió las transcripciones, se realizaron tres réplicas biológicas. ARN fue extraído por la interrupción mecánica y purificación de la columna y luego procesada para el análisis de RNA-seq. Se describe la tubería posterior secuenciación y programación scripts son siempre que permiten la replicación exacta de los análisis realizados. Específicamente, Trimmomatic 21TopHat2 22, HTseq 23, el entorno estadístico de R 24y el DESeq2 paquete 25 fueron utilizados para procesar los datos de RNA-seq y a identificar los 607 genes que cambian significativamente durante hipoxia. Análisis de componentes principales (PCA) y expresión génica de las repeticiones indican la reproducibilidad de la técnica. Clustering y heatmaps reveló cinética de expresión amplia, mientras que el análisis del gene ontology (GO) demostró que muchos procesos celulares, como respiración aeróbica, se enriquecen en el conjunto de genes regulados por el oxígeno.

<table><tbody><tr><td>Incubadora seca cerrada</td><td>Thermo Scientific</td><td>MaxQ 4000</td><td>Set a 30 &deg;C. Modifique la puerta para permitir la entrada de un tubo Tygon. Alternativamente, use la incubadora New Brunswick G25, que contiene un puerto de tubo. No utilice un agitador de agua al aire libre, ya que la condensación se acumulará en los tubos entre los matraces, posiblemente contaminando los cultivos.</td></tr><tr><td>Portafiltros de microanálisis</td><td>Millipore</td><td>XX1002530</td><td>25 mm de diámetro, soporte de acero inoxidable, n.º 5 soportes de tapón de silicona perforada en matraz filtrante estándar de 125 ml</td></tr><tr><td>Fuerte vacío</td><td>Edwards</td><td>E-LAB 2</td><td>El " casa" El vacío puede ser demasiado débil. Alternativamente, use una bomba de vacío portátil de energía eléctrica como la que se enumera aquí.</td></tr><tr>Matraz <td></td><td></td> de <td>1.000 mL</td><td>para actuar como trampa de vacío.</td></tr><tr><td>~ 2 pies de longitud de tubo de vacío de pared gruesa, diámetro interior de 3/8 pulgadas, diámetro exterior 7/8 pulgadas</td><td>Tygon</td><td>38TT</td><td>Dos piezas: la primera conecta la aspiradora a la trampa y la segunda conecta la trampa al sistema de filtro.</td></tr><tr>Tanque <td></td><td></td><td>de gas N2 de alta presión</td><td>con una pureza del 99,999%, >1.000 psi, con regulador y controlador de flujo de gas</td></tr><tr><td>Matraz</td><td></td><td></td> de 500 mL esterilizado en autoclave <td>Abertura cubierta con papel de aluminio. Uno para cada cepa de levadura.</td></tr><tr>Matraces <td></td><td></td><td>de 250 mL esterilizados en autoclave</td><td>Aberturas cubiertas con papel de aluminio. Uno para cada punto de tiempo más dos para las trampas de agua.</td></tr><tr><td>Tapones de matraz (tamaño 6, dos orificios de 5 mm de diámetro)</td><td></td><td></td><td>Esterilizados con etanol al 70%. Uno para cada matraz.</td></tr><tr><td>Tubo de vidrio, longitud 9 cm o 17 cm, diámetro interior 2 mm, diámetro exterior 5 mm</td><td></td><td></td><td>Esterilizado con etanol al 70%. Dos tubos para cada matraz. Coloque en los agujeros de cada tapón. Consulte la Figura 1 para la colocación de tubos de 9 frente a 17 cm.</td></tr><tr><td>~25 cm de longitud de tubo de plástico, diámetro interior 5 mm</td><td>Tygon</td><td>E-3603</td><td>Una pieza para cada matraz. Esterilizado con etanol al 70%.</td></tr><tr><td>Discos filtrantes estériles</td><td>Millipore HAWP02500</td><td></td><td>25 mm de diámetro, 0,45 y micro; m tamaño de poro, uno para cada punto de tiempo</td></tr><tr><td>Estéril dH2O (~100 mL)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cubetas</td><td></td><td></td> de 1 mL <td>Para medir OD600 (es decir, concentración celular)</td></tr><tr><td>50 mL tubos de centrífuga estériles</td><td></td><td></td><td>Uno para cada punto de tiempo</td></tr><tr><td>Pinzas limpias y estériles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nitrógeno</td><td></td><td></td> líquido <td>Para congelar células</td></tr><tr><td>cuentas lavadas con ácido</td><td>Sigma</td><td>G8772</td><td>Mantener a 4 & grados; C para células de lisis</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Para la purificación de la columna de ARN</td></tr><tr><td>Tampón</td><td></td><td></td> Qiagen RLT <td>Prepare agregando 10 y micro; L de &beta;-Mercaptoetanol por 1 mL de tampón RLT, mantener a 4 &deg;C.</td></tr><tr><td>Tubos colectores de 2</td><td>mL Qiagen</td><td></td><td>incluidos en el Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>Buffer RPE</td><td>Qiagen</td><td></td><td>incluido en el Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>Buffer RW1</td><td>Qiagen</td><td></td><td>incluido en el Qiagen Rneasy Mini Kit</td></tr><tr><td>DNase I stock y soluciones de trabajo</td><td>Qiagen</td><td>79254</td><td>La enzima DNasa I se presenta en forma de polvo liofilizado en un vial de vidrio. Con una aguja y una jeringa estériles, inyecte 550 &micro; L de agua libre de RNasa (incluida en el kit Qiagen) en el vial. Mezcle invirtiendo suavemente la botella. Para evitar la desnaturalización de la enzima, no haga vórtice. Con una pipeta, retire esta solución madre del vial y guárdela en el congelador (-20 &deg; C) en alícuotas de un solo uso (80 y micro; L cada uno). La solución madre no debe descongelarse ni volver a congelarse.</td></tr><tr><td>Tampón RDD</td><td>Qiagen</td><td></td><td>incluido en el kit Qiagen DNase</td></tr><tr><td>Tubos helados de 2 ml con tapón de</td><td></td><td></td> rosca <td>Para lisar células durante la extracción de ARN</td></tr><tr><td>homogeneizador de molino de bolas</td><td>Biospec Mini-Beadbeater-24</td><td>112011</td><td>Mantener en cámara frigorífica</td></tr><tr><td>Bacto Peptona</td><td>BD</td><td>DF0118</td><td>para medios líquidos YPD</td></tr><tr><td>Extracto de levadura Bacto BD</td><td></td><td>DF0886</td><td>para líquido Medios YPD</td></tr><tr><td>glucosa</td><td>Fisher</td><td>D16</td><td>para medios YPD líquidos</td></tr><tr><td>Tubos de ensayo Qubit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32856</td><td>para medir la concentración de ácidos nucleicos</td></tr><tr><td>Quant-iTTM dsDNA BR Kit de ensayo</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32853</td><td>para medir la concentración de ácidos nucleicos</td></tr><tr><td>Quant-iTTM Kit de ensayo de ARN</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q32855</td><td>para medir la concentración de ácidos nucleicos</td></tr><tr><td>Fluorímetro Qubit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Q33216</td><td>para medir la concentración de ácidos nucleicos</td></tr><tr><td>Sistema de electroforesis comercial</td><td>Agilent</td><td>Bioanalyzer 2100</td><td>para medir la calidad de los ácidos nucleicos</td></tr><tr><td>Secuenciador de última generación</td><td>Illumina</td><td>HiSeq 2500</td><td>para bibliotecas de secuenciación</td></tr><tr><td>sistema automatizado de manipulación de líquidos</td><td>Wafergen</td><td>Apollo 324</td><td>para crear bibliotecas de secuenciación</td></tr><tr><td>PrepX PolyA mRNA Isolation Kit</td><td>Wafergen</td><td>400047</td><td>para aislar el ARNm del ARN total</td></tr><tr><td>PrepX RNA SEQ para Illumina Library Kit</td><td>Wafergen</td><td>400039</td><td>para crear bibliotecas de secuenciación específicas de hebra a partir de ARN total</td></tr><tr><td>Divisor</td><td></td><td></td> <td>de código de barrashttps://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d</td></tr><tr><td>Samtools, que incluye el comando</td><td></td><td></td> gzip <td>http://www.htslib.org/download/</td></tr> <tr><td>Trimmomatic</td><td></td><td></td><td>http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic</td></tr><tr><td>Bowtie2 (instalado antes de TopHat)</td><td></td><td></td><td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml</td></tr><tr><td>TopHat</td><td></td><td></td><td>https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml</td></tr><tr><td>HTSeq</td><td></td><td></td><td>http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html</td></tr><tr><td>R (instalado antes de R Studio)</td><td></td><td></td><td>https://cran.rstudio.com</td></tr><tr><td>R Studio (versión gratuita)</td><td></td><td></td><td>https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/</td></tr></tbody></table>

medición de los niveles de mrna con el tiempo durante la levadura s. cerevisiae por respuesta hipóxica

Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response

Complejos cambios en la expresión génica normalmente median una gran parte de la respuesta celular. Cada gen puede cambiar la expresión cinética única como el gen es regulado por el calendario particular de uno de los muchos estímulos, señalización de vías o efectos secundarios. Para capturar el gene entero de expresión ante la hipoxia en la levadura S. cerevisiae, RNA-seq análisis fue utilizada para supervisar los niveles de mRNA de los genes en momentos específicos después de la exposición a la hipoxia. Hipoxia fue establecida por cultivo de células en ~ 100% N2 gas. Lo importante, a diferencia de otros estudios hipóxicos, ergosterol y ácidos grasos insaturados no agregaron a los medios de comunicación ya que estos metabolitos afectan la expresión génica. Puntos de tiempo fueron elegidos en el intervalo de 0 - 4 h después de la hipoxia porque ese período captura los principales cambios en la expresión génica. En cada momento, las células hipóxicas registros medio fueron rápidamente filtrado y congelado, limitar la exposición a los cambios2 y concomitante O en la expresión génica. ARN total fue extraído de las células y utilizado para enriquecer de mRNA, que luego se convierte a cDNA. De este cDNA, se crearon bibliotecas multiplexores y ocho o más muestras se secuenciaron en un carril de un secuenciador de última generación. Una tubería de la secuencia se describe, que incluye ajuste de base de calidad, leer cartografía y determinar el número de lecturas por gene. DESeq2 en el ambiente estadístico de R fue utilizado para identificar los genes que cambian significativamente en alguno de los puntos del tiempo hipóxico. El análisis de tres réplicas biológicas reveló alta reproducibilidad, genes de diferenciación cinética y un gran número de esperan O2-regulada de los genes. Estos métodos pueden ser utilizados para estudiar cómo las células de diferentes organismos responden a la hipoxia con el tiempo y adaptados para el estudio de expresión génica durante otras respuestas celulares.

El curso del tiempo de hipoxia y RNA-seq análisis fueron realizados independientemente tres veces. Para examinar la reproducibilidad de las tres repeticiones, datos de expresión genética para todos los genes se analizan mediante análisis de componentes principales (ACP). La figura 2 muestra cómo cambian las muestras durante los dos primeros componentes principales, que en conjunto representan el 58.9% de la variabilidad. Este análisis indicó que cada curso de...

Aquí, presentamos un protocolo usando RNA-seq para controlar los niveles de mRNA con el tiempo durante la respuesta hipóxica de las células de S. cerevisiae . Este método puede adaptarse para analizar la expresión génica durante cualquier respuesta celular.

Medición de los niveles de mRNA con el tiempo durante la levadura S. cerevisiae por respuesta hipóxica

Complex changes in gene expression typically mediate a large portion of a cellular response. Each gene may change expression with unique kinetics as the ...

El objetivo general de este experimento es monitorear los niveles de ARNm de todos los genes a lo largo del tiempo mientras las células de S. cerevisiae son expuestas a hipoxia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de señalización celular, como por ejemplo, ¿cuáles son la cinética de los cambios en la expresión génica durante una respuesta celular? La principal ventaja de esta técnica es que los niveles de ARNm se miden a lo largo del tiempo, en lugar de hacerlo en un solo punto durante la respuesta celular. Aunque este método puede proporcionar información sobre la respuesta hipóxica de la levadura, también puede aplicarse a otras especies microbianas que puedan cultivarse en medio líquido. La demostración visual de este método es fundamental para transmitir la disposición detallada de los frascos y las conexiones de tubos, así como la recolección rápida de células en condiciones de hipoxia. Un día o más antes del curso temporal de hipoxia, prepare los materiales necesarios. Coloque el tanque de nitrógeno, el incubador, el vacío y el sistema de filtración en proximidad cercana para permitir un procesamiento rápido de las células. Prepare el medio YPD

measuring-mrna-levels-over-time-during-yeast-s-cerevisiae-hypoxic

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Deleción del gen y la sobreexpresión de la proteína son métodos comunes para el estudio de las funciones de las proteínas. En este artículo se describe un protocolo para el análisis del fenotipo de desarrollo en función de la concentración de proteínas en la población y de una sola célula en los...

Análisis de la elaboración de un fenotipo morfológico en función de la concentración de proteínas en la levadura en ciernes

En este protocolo, la expresión de genes en la levadura...

El análisis de microarrays para Saccharomyces cerevisiae</em

Este protocolo describe un procedimiento experimental para la realización de...

Visualización y Análisis de las moléculas de ARNm mediante fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Se presenta un protocolo sencillo para obtener películas de microscopía de fluorescencia de las células de levadura en crecimiento, y un paquete de software basado en GUI para extraer los datos de series de tiempo de una sola célula. El análisis incluye linaje automático y la asignación por división de tiempo integrado con inspección visual y manual de conservación de los datos de seguimiento.

La adquisición de fluorescencia Time-lapse películas de levadura en ciernes y el análisis de la dinámica de una sola célula con injertos

Dos métodos complementarios basados ​​en citometría de flujo y microscopía se presentan que permiten la cuantificación, a nivel de una sola célula, de la dinámica de la expresión génica inducidos por la activación de una vía MAPK en la levadura.

La cuantificación temporal de la expresión de MAPK inducida en células individuales de levadura

El nivel de estado estacionario de ARNm específicos se determina por la velocidad de síntesis y la descomposición del ARNm. Las tasas de degradación de ARNm de todo el genoma o las tasas de descomposición de ARNm específicos se pueden medir mediante la determinación de ARNm de vida media. Este protocolo se centra en la medición de las tasas de descomposición de ARNm en Saccharomyces cerevisiae.

La medición de mRNA decadencia Tarifas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Uso<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Cepas

Regulación traduccional desempeña un papel importante en el control de la abundancia de la proteína. Aquí, describimos un método de alto rendimiento para el análisis cuantitativo de la traducción en la levadura de florecimiento Saccharomyces cerevisiae.

Cuantificación del genoma de traducción en levadura de florecimiento por Ribosome Profiling

El protocolo aquí descrito se basa en la cuantificación del genoma de mRNA recién sintetizada purificada de células de levadura con 4-tiouracilo. Este método permite para medir la síntesis de mRNA desacoplado del decaimiento del mRNA y por lo tanto, proporciona una medida exacta de la transcripción del RNA polimerasa II.

Saccharomyces cerevisiae Metabólico etiquetado con 4-tiouracilo y la cuantificación de mRNA recién sintetizada como un Proxy para la actividad de ARN polimerasa II

Este protocolo describe una aplicación de hibridación in situ de fluorescencia de una sola molécula (smFISH) para medir la cinética in vivo de la síntesis y degradación del ARNm.

Sondeo de mRNA cinética en el espacio y el tiempo en Escherichia coli usando hibridación de fluorescencia de una sola molécula de dos colores

Presentamos una técnica para estabilizar rápidamente complejos traslacionales (biosíntesis de proteínas) con reticulación de formaldehído en levaduras vivas y células de mamíferos. El enfoque permite diseccionar intermedios transitorios e interacciones dinámicas ARN:proteína. Los complejos reticulados se pueden utilizar en múltiples aplicaciones posteriores, como en métodos de perfiles basados en secuenciación profunda, microscopía y espectrometría de masas.

Fijación rápida in vivo y aislamiento de complejos traslacionales de células eucariotas

Este protocolo emplea un reportero bioluminiscente, lo que permite mediciones de la actividad transcripcional en Saccharomyces eubayanus para monitorear la transición de glucosa a maltosa, lo que permite el análisis en tiempo real de las adaptaciones metabólicas y apoya la optimización de la cepa para la fermentación industrial en diversas condiciones.

In vivo Monitorización de la actividad transcripcional durante la transición metabólica mediante un reportero bioluminiscente en levadura

Aprende a medir niveles de mRNA durante la respuesta hipóxica en S. cerevisiae mediante RNA-seq. Este protocolo permite analizar la dinámica de expresión génica en tiempo real bajo estrés ambiental.

Medición de los niveles de mRNA con el tiempo durante la levadura S. cerevisiae por respuesta hipóxica

Explorar más videos