Name: Rápido Chip para Cruz-reactivity-libre y observador de tiro multiplexado inmunoensayos de Sandwich (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 44 s
Description: Aprende a realizar inmunoensayos sandwich multiplexados sin reactividad cruzada usando tecnología snap chip. Este método simplificado elimina la necesidad de equipos de microarrays complejos para cuantificación proteica precisa.

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Agradecemos al Dr. Rob Sladek el uso del telescopio de inyección de tinta. Reconocemos el apoyo final de los institutos canadienses de investigación de la salud (CIHR), la Ciencia Natural e Ingeniería investigación Consejo de Canadá (NSERC), el Instituto canadiense de investigación de sociedad de cánceres y la Fundación Canadá para la innovación (CFI). D.J. gracias apoyo de una Cátedra de investigación de Canadá.

1. fabricación y almacenamiento de snap chips <ol><li>método de transferencia simple ( Figura 1a) <ol><li>punto cAb soluciones que contengan 400 μg/mL anticuerpos y 20% de glicerol en solución salina tamponada con fosfato (PBS) sobre una nitrocelulosa (o un vidrio funcionalizado) diapositiva de ensayo con una de inyección de tinta microarray observador 13 en una humedad relativa de 60% (1.2 nL para cada punto) con espaciamiento de centro a centro de 800 μm. Asegúrese de que la diapositiva es fijada sobre la cubierta del observador según un ángulo (aquí, la esquina inferior izquierda fue utilizada).</li>
		<li>Incubar el portaobjetos manchada ensayo a temperatura ambiente durante 1 h con una humedad relativa de 60%.</li>
		<li>Abrazadera Junta módulo diapositivas con 16 compartimentos en la diapositiva de análisis para dividir en 16 pozos. Enjuagar el portaobjetos tres veces mediante la adición de 80 μl de PBS con un 0.1% Tween-20 (SAFT) en cada pozo y sacudiendo a 450 rpm en un agitador, 5 minutos cada vez.</li>
		<li>Añadir 80 μl de bloqueo para cada bien y agitar por 1 h a 450 rpm.</li>
		<li>Quite la Junta y secar el portaobjetos de ensayo con una corriente de nitrógeno.</li>
		<li>Fijar una diapositiva de transferencia en la cubierta del observador de tiro y empuje la parte inferior izquierda de la diapositiva contra la esquina inferior izquierda de la cubierta del observador. Tinta punto una amplia gama de marcas de alineación (una solución de micro-granos del poliestireno) con el mismo diseño que las cabinas de.</li>
		<li>Deje las marcas de alineación en seco. Tapa de la diapositiva de la transferencia y lo vuelva a colocar la cubierta de spotter, fijación contra la esquina inferior izquierda.</li>
		<li>Preparar el lenguado manchado las soluciones que contienen 20 μg/mL anticuerpos, glicerol al 20% y 1% de BSA.</li>
		<li>Usando el telescopio de &#39; s cámara, toma una foto de una marca de alineación. Implementar esta imagen en el programa de localización como una referencia y obtener el sistema de reconocimiento de imagen del telescopio de inyección de tinta para identificar la boya izquierda. Utilice sus coordenadas en el primer lugar de la matriz de dAb. Punto 8 nL por gota con un espaciamiento de centro a centro de 800 μm.</li>
	</ol></li> <li>Método de doble transferencia ( Figura 1b) <ol><li>colocar una diapositiva de transferencia 1 en la cubierta de quitamanchas de tinta contra la esquina inferior izquierda. Punto taxis soluciones que contengan 400 μg/mL anticuerpos, glicerol al 20% y 1% de BSA en PBS sobre la diapositiva con un spotter de microarray de inyección de tinta en una humedad relativa de 60% (0.4 nL para cada punto y ~ 200 μm de diámetro). El espaciamiento de centro a centro es 400 μm.</li>
		<li>Ajustar la transferencia con un recubrimiento de nitrocelulosa (o un vidrio funcionalizado) ensayo diapositiva usando un aparato de presión ( figura 2) para transferir las gotitas de la cabina en la diapositiva de ensayo.
		<ol><li>a su vez los seis botones laterales el aparato de presión por 90 grados y bloquear todos los elementos en la posición abierta. Insertar la diapositiva de transferencia en el soporte de diapositivas en su receptáculo con la esquina recortada hacia el perno del pogo fijo. La primera puesta de tres botones para liberar los émbolos con el perno del pogo oro y asegúrese de que las diapositivas son empujadas contra los pernos de alineación.</li>
			<li>Insertar un portaobjetos recubiertos con nitrocelulosa en el snap aparato boca abajo sentado en los 4 pines pogo. Gire el segundo conjunto de tres botones para liberar émbolos con el pin plata y asegúrese de que las diapositivas son empujadas contra los pernos de alineación.</li>
			<li>Cerrar el aparato de presión mediante la colocación de la carcasa superior del soporte de diapositivas utilizando la alineación pilares y huecos para un posicionamiento preciso.</li>
			<li>Inserte el aparato cerrado snap en su jaula y presione la pestaña de cierre completamente para los microarrays cara a cara mientras se aplica la presión adecuada. Mantener cerrada durante 1 minuto</li>
		</ol></li> <li>Separar las diapositivas. Incubar el portaobjetos de ensayo a temperatura ambiente durante 1 h con una humedad relativa de 60%. Lavar, bloquear y secar el portaobjetos de ensayo como se describe en pasos 1.1.3 - 1.1.5.</li>
		<li>Ponga otra diapositiva de la transferencia en la cubierta de quitamanchas de tinta y empuje contra la esquina inferior izquierda. DAb punto soluciones que contienen 50 o 100 μg/mL de anticuerpos (ver tabla 1), glicerol al 20% y 1% de BSA en PBS. Asegurarse de que cada punto es 0.8 nL y el espaciamiento de centro a centro entre puntos es de 400 μm.</li>
		<li>Tienda el ensayo y la diapositiva de la transferencia. Análisis y transferencia de diapositivas en una bolsa hermética que contenga desecante del sello y puso en un congelador de-20 ° C.</li>
	</ol></li></ol> 2. Multiplexado de inmunoensayos con snap chips <ol><li>recuperar la diapositiva de prueba del congelador. Deja la bolsa sellada durante 30 minutos hasta que el carro llega a temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare 7 puntos serie diluida soluciones muestra por clavar las proteínas en PBS que contenga 0.05% Tween-20. 
	Nota: Aquí, se utiliza un factor de 5-fold dilución. Las concentraciones de partida para cada proteína se enumeran en la tabla 1.</li>
	<li>Preparar soluciones de muestra según el caso. Por ejemplo, diluir el suero humano 4 veces en buffer de SAFT.</li>
	<li>Abrazadera de una Junta de compartimiento 16 en la diapositiva ensayo.</li>
	<li>Llenar una columna de 8 pocillos con las soluciones de dilución de 7 proteína y una solución de tampón de SAFT proteínas mediante pipeteo. Pipetear las soluciones muestra en los otros pozos de 8 en la diapositiva misma. 
	Nota: se pueden caber 80 soluciones μL en cada pozo. Más diapositivas pueden utilizarse para medir muestras adicionales cuando sea necesario.</li>
	<li>Incubar las muestras en un agitador a 450 rpm por 1 h a temperatura ambiente o para pasar la noche a 4 ° C. lavado el carro tres veces con SAFT en el agitador a 450 rpm, 5 minutos cada vez. Retire la Junta y secar el portaobjetos bajo una corriente de gas nitrógeno.</li>
	<li>Recuperar el carro de transferencia con toques del congelador. Mantener la bolsa sellada durante 30 min a temperatura ambiente. Luego, incubar el portaobjetos en una cámara cerrada (por ejemplo caja de consejos vacíos) que contiene granos de estabilización de humedad de 60% por 20 min para la rehidratación.</li>
	<li>Ajustar el carro de transferencia con la diapositiva de ensayo usando un aparato de presión ( figura 2) para transferir las gotitas de dAb. Ver sección 1.2.2 para el funcionamiento de los aparatos de presión.</li>
	<li>Separar las diapositivas. Incubar el portaobjetos de ensayo en una cámara cerrada que contiene granos de estabilización de humedad de 60% para h. 1 abrazadera de la diapositiva de ensayo con un empaque de 16 compartimentos y enjuagar el portaobjetos 4 veces con SAFT en un agitador a 450 rpm, 5 minutos cada vez.</li>
	<li>Pipeta 80 μl de las soluciones que contienen 2,5 fluoróforo estreptavidina μg/mL en PBS a cada pocillo. Incubar por 20 min en un agitador a 450 rpm.</li>
	<li>Enjuague la diapositiva 3 veces con Saft y una vez con agua destilada en el agitador a 450 rpm. Retire la Junta y secar el portaobjetos usando nitrógeno gas.</li>
</ol> 3. Deslice la exploración y análisis de datos <ol><li>analizar la diapositiva de prueba con un scanner de microarrays de fluorescencia usando el láser de 635 nm.</li>
	<li>Extraer la intensidad neta de cada punto mediante un análisis software (e.g. matriz pro analyzer) 16.</li>
	<li>Calcular el límite de detección (LOD) de cada proteína utilizando un software estadístico y determinar las concentraciones de proteína en las muestras de. 
	Nota: El LOD se define como la intersección de la norma cuincrementado en tres veces la desviación estándar de tres ensayos independientes RVE.</li>
</ol>

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</ol>

La Universidad de McGill ha presentado una solicitud de patente en algunos aspectos de este trabajo con Li Huiyan y David Juncker como inventores.

En este trabajo, hemos presentado una tecnología de chip de complemento que hace las immunoassays multiplex Cruz-reactivity-free ampliamente disponible para los investigadores con configuración experimental básica. A diferencia de los microarrays de anticuerpos, ningún observador de microarrays es necesario para los usuarios finales. Se demuestran solo y métodos de transferencia de doble, y doble transferencia ofrece exactitud de la alineación superior a ~ 40 μm para los puntos del 98%, con el desalineamiento mayor de 63...

Puede proporcionar un panel de biomarcadores que comprende múltiples proteínas de más alta sensibilidad y especificidad que un único biomarcador en el diagnóstico de enfermedades complejas como cáncer1,2. El análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) ha sido la tecnología estándar utilizada en laboratorios clínicos alcanzar un límite de detección bajo pg/ml en plasma, sino límites a un destino por ensayo3,4,5. Microarrays de anticuerpos se han desarrollado para albergar miles de ensayos miniaturizados llevó a cabo en paralelo en un solo microscopio diapositiva6,7,8. Sin embargo, la capacidad de multiplexación de este método es limitada por reactividad cruzada basada en el reactivo, que surjan de la aplicación de una mezcla de lenguados, y llega a ser más problemático con un número creciente de objetivos9,10 , 11. Pla et al. han declarado que la vulnerabilidad resultante de un análisis multiplex emparedado escalas como 4N(N-1) donde N es el número de objetivos12.
Para mitigar la reactividad cruzada en microarrays de anticuerpos, anticuerpos colocalization microarrays (ACM) se ha desarrollado en nuestro laboratorio de ensayo sándwich multiplex12. Anticuerpos de captura (cAbs) son vistos en un substrato con un observador de microarrays. Después de bloqueo de las muestras se aplican en la superficie, y luego toques individuales son vistos en los mismos lugares con el complejo antígeno-cAb. Todos los escenarios de reactividad cruzada entre antígenos y anticuerpos pueden ser mitigados con ACM, y límites de detección en pg/mL se han logrado. Sin embargo, el protocolo de ensayo requiere preparación y manchado el dAbs durante los experimentos usando un spotter de microarray in situ con la alta precisión para propósito de la alineación, que es caro y consume tiempo, limitar la aplicación amplia de esta tecnología en otros laboratorios. Un mano ACM, llamado snap chip ha sido desarrollado para Cruz-reactivity-free y observador de tiro-libre multiplexar sandwich inmunoensayos13,14,15. Taxis y lenguados son pre-vistos en una diapositiva de ensayo y un tobogán de transferencia respectivamente en formato de microarrays y almacenados. Durante el ensayo, se recuperan las diapositivas y un microarray de lenguados son transferidos colectivamente en la diapositiva de ensayo simplemente chasquear las dos fichas juntos. Un aparato de presión se utiliza para la transferencia confiable reactivo. Portaobjetos de nitrocelulosa recubierto con una capacidad de enlace de anticuerpos relativamente grandes se han utilizado como las diapositivas ensayo para absorber las gotitas de líquido y así facilitar la transferencia de reactivo, sin embargo, las diapositivas son más caras que microarray y laminas de vidrio regular escáneres compatibles con diapositivas no transparentes son necesarios para la adquisición de señales.
En este trabajo, demostramos el protocolo de llevar a cabo un immunoensayo del emparedado multiplex con un chip de snap. Un aparato novedoso complemento ha sido desarrollado para la transferencia de reactivo más conveniente y confiable de microarray de microarrays. Aquí lo importante, hemos establecido el método de transferencia de reactivo sobre portaobjetos de vidrio ordinario con la viruta del cierre. 1024 puntos se transfirieron con éxito y alineados sobre un portaobjetos de vidrio, ampliando significativamente el uso de esta tecnología en la mayoría de los laboratorios.

<table><tbody><tr><td>Tableta de solución salina tamponada con fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>5246501EA</td><td></td></tr><tr><td>Cy5 conjugada con estreptavidina</td><td>Rockland</td><td>s000-06</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>p1379</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc</td><td>001-000-162</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Solución de bloqueo: Estabilizador de microarrays StabilGuard Choice sin BSA</td><td>SurModics, Inc</td><td>SG02</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos recubiertos de nitrocelulosa</td><td>Grace Bio-Laboratories, Inc</td><td>305116</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos recubiertos de aminosilano</td><td>Schott North America</td><td>1064875</td><td></td></tr><tr><td>Snap Device</td><td>Parallex BioAssays Inc.</td><td>PBA-SD01</td><td></td></tr><tr><td>Observador de microarrays de inyección de tinta</td><td>GeSiM</td><td>Nanoplotter 2.0</td><td></td></tr><tr><td>Junta de módulo</td><td>deslizante Grace Bio-Laboratories, Inc</td><td>204862</td><td></td></tr><tr><td>Perlas de estabilización de humedad</td><td>Parallex BioAssays Inc.</td><td>PBA-HU60</td><td></td></tr><tr><td>Software Array-Pro Analyzer Media</td><td>Cybernetics</td><td>Versión 4.5</td><td></td></tr><tr><td>Escáner de microarrays de fluorescencia</td><td>Agilent</td><td>SureScan Microarray</td> Scanner <td></td></tr><tr><td>Software de bioestadística</td><td>Software GraphPad</td><td>Prisma 6</td><td></td></tr><tr><td>Captura de endoglin de anticuerpos</td><td>R& D Systems</td><td>MAB10972</td><td></td></tr><tr><td>Proteína Endoglin</td><td>R& D Systems</td><td>1097-ES</td><td></td></tr><tr><td>Detección de endoglina anticuerpo</td><td>R& D Systems</td><td>BAF1097</td><td></td></tr><tr><td>IL-6a (véase la Tabla 1)</td><td>R& D Systems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-6b (ver Tabla 1)</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rápido chip para cruz-reactivity-libre y observador de tiro multiplexado inmunoensayos de sandwich

Snap Chip for Cross-reactivity-free and Spotter-free Multiplexed Sandwich Immunoassays

Análisis de la proteína multiplexada ha demostrado una sensibilidad diagnóstica superior y precisión frente a las proteínas solo. Microarrays de anticuerpos permiten miles de micro escala inmunoensayos realizados simultáneamente en un solo chip. Formato de ensayo sándwich mejora la especificidad del ensayo mediante la detección de cada destino con dos anticuerpos, pero sufre de reactividad cruzada entre reactivos lo que limita su capacidad de multiplexación. Microarray de colocalización de anticuerpo (ACM) ha sido desarrollado para la detección de proteína multiplexados Cruz-reactivity-free, pero requiere un costoso observador in situ para la fabricación de microarrays durante los ensayos. En este trabajo, demostramos una tecnología de chip de snap que transfiere reactivo de microarrays para microarrays por simplemente encaja a presión juntos, que así no observador es necesario durante la incubación de la muestra y posterior aplicación de anticuerpos de detección (dAbs) con dos fichas almacenamiento de portaobjetos previamente manchados, disociando la preparación de los portaobjetos de la ejecución del ensayo. Ambos métodos de transferencia individuales y dobles se presentan para lograr la alineación exacta entre los dos microarrays y la fabricación de la diapositiva para ambos métodos se describen. Resultados muestran que &#60; 40 μm alineación se ha conseguido con la doble transferencia, alcanzando una densidad de matriz de 625 puntos/cm2. Un inmunoanálisis de 50 plexed se ha realizado para demostrar la utilidad de la viruta del complemento en el análisis de la proteína multiplexados. Límites de detección de proteínas de 35 están en la gama de pg/mL.

El procedimiento del ensayo de single y doble métodos de transferencia se muestra en la figura 1. En una transferencia, los taxis son vistos directamente en la diapositiva de ensayo y los lenguados se transfieren en la diapositiva de ensayo al uso en forma de espejo de los taxis (Figura 1a). Procedimiento de solo transferencia se requiere, pero este método sufre de desalineación entre los dos microarrays, causada principalmente p...

Demostramos una tecnología de chip de complemento para realizar inmunoensayos sandwich multiplexados Cruz-reactivity-free simplemente chasquear dos diapositivas. Un aparato de presión se utiliza para transferir confiablemente reactivos de microarray de microarrays. El chip del broche de presión puede utilizarse reacciones bioquímicas que requieren colocalización de diferentes reactivos sin contaminación cruzada.

Rápido Chip para Cruz-reactivity-libre y observador de tiro multiplexado inmunoensayos de Sandwich

Multiplexed protein analysis has shown superior diagnostic sensitivity and accuracy compared to single proteins. Antibody microarrays allow for thousands ...

El objetivo general de este procedimiento es cuantificar simultáneamente múltiples proteínas en el chip utilizando inmunoensayos tipo sándwich de forma libre de impresión (spotter-free) y sin reactividad cruzada entre los reactivos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la proteómica cuantitativa, como el descubrimiento y la validación de biomarcadores proteicos candidatos en el cáncer. Las principales ventajas de esta técnica son la ausencia de reactividad cruzada entre anticuerpos y antígenos en ensayos tipo sándwich multiplexados y que los usuarios no necesitan un dispensador de microarreglos complejo.La procedura será demostrada por Heidi Larkin, directora científica en Parallex BioAssays. Para comenzar la preparación de las láminas para el método de transferencia única, fije una nueva lámina de transferencia en la plataforma del microdispensador de inyección de tinta. Utilizando una solución de microesferas de poliestireno o glicerol al 30 %, imprima un arreglo de marcas de alineación en el borde de la lámina.Utilizando el software del instrumento y la cámara del dispensador, tome una imagen de las marcas de alineación para el control de calidad.

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Cuantitativo, de alto rendimiento, en tiempo real, y sin etiquetas de detección biomolecular (ADN, proteínas, etc) sobre...

Biomoleculares de detección utilizando el sensor de reflectancia de imágenes interferométricas (IRIS)

Un ELISA se puede convertir fácilmente a un ensayo de Luminex xMAP y, a través de los beneficios de anticuerpos de multiplexación, varios pueden ser examinados simultáneamente para identificar un par de anticuerpos óptima, dando lugar a una mayor sensibilidad y rango dinámico, mientras que reduce el coste del ensayo.

La conversión de un ELISA de captura para un ensayo de Luminex xMAP utilizando un anticuerpo Multiplex Método de detección

El video muestra la implementación de la tecnología de chip instantáneo para inmunoensayos sándwich multiplexados sin reactividad cruzada. La simple acción de encajar dos portaobjetos de microarrays, cada uno de los cuales contiene diferentes reactivos, garantiza la transferencia de reactivos sin contaminación cruzada y ayuda a detectar múltiples proteínas mediante inmunoensayo sándwich.

Una tecnología de chip a presión para un inmunoensayo sándwich multiplexado sin reactividad cruzada

En este artículo se presenta un chip de microfluidos para el análisis de células individuales. Permite la cuantificación de las proteínas intracelulares, enzimas, cofactores, y segundos mensajeros por medio de ensayos fluorescentes o inmunoensayos.

Un chip de microfluidos para el análisis químico versátil de células individuales

En el clima actual de escasez de recursos, están surgiendo nuevas tecnologías que permiten a los investigadores realizar estudios más baratos, más rápidos y con más precisión. En este trabajo describimos el desarrollo de un inmunoensayo múltiple de anticuerpos salivales basado en perlas para medir la exposición humana a múltiples patógenos ambientales simultáneamente.

El desarrollo de un anticuerpo salival múltiplex inmunoensayo para medir la exposición humana a los patógenos ambientales

La presencia de toxinas cianobacterianas en los embalses de agua dulce para consumo humano es una gran preocupación para las autoridades de gestión del agua. Para evaluar el riesgo de contaminación del agua, este artículo describe un protocolo para la detección en campo de cepas de cianobacterias en muestras líquidas y sólidas mediante el uso de un chip de microarray de anticuerpos.

Protocolo Experimental para la detección de Las cianobacterias En muestras líquidas y sólidas con un chip de microarray de anticuerpos

Corriente de multiplexado de diagnóstico para detectar los Zika, chikungunya y dengue virus requieren preparación compleja y costosa instrumentación y son difíciles de usar en entornos de bajos recursos. Se muestra un diagnóstico que utiliza amplificación isotérmica con sondas desplazable filamento blanco específico para detectar y diferenciar estos virus con alta sensibilidad y especificidad.

La amplificación isotérmica multiplexada basado en plataforma de diagnóstico para detectar Zika, Chikungunya y Dengue 1

Se utilizó un sistema de análisis de flujo para ensayos multiplexados basados en perlas que proporciona una lectura de dos reporteros para el desarrollo de ensayos serológicos multiplex y de neutralización de anticuerpos que pueden medir simultáneamente anticuerpos IgG e IgM neutralizantes para SARS-CoV-2.

Un ensayo de neutralización igG e IgM SARS-CoV-2 de doble multiplex multiplexing para un sistema de análisis de flujo multiplexado basado en perlas

Este artículo propone una nueva generación de plataformas analíticas multiparamétricas con mayor rendimiento para la caracterización de subconjuntos de vesículas extracelulares. El método se basa en una combinación de métodos de biodetección multiplexada con análisis metrológicos y morfomecánicos por microscopía de fuerza atómica, junto con espectroscopia Raman, para calificar objetivos vesiculares atrapados en un biochip de microarray.

Plataforma analítica multimodal en un chip de resonancia de plasmón de superficie multiplexada para el análisis de subconjuntos de vesículas extracelulares

El análisis de imágenes de códigos de barras multiplexadas ha mejorado recientemente la caracterización del microambiente tumoral, permitiendo estudios exhaustivos de la composición celular, el estado funcional y las interacciones célula-célula. Aquí, describimos un protocolo de tinción e imagen utilizando el código de barras de anticuerpos conjugados con oligonucleótidos y el ciclo de imágenes, que permite el uso de una técnica de análisis de imágenes de alta dimensión.

Análisis de imágenes de código de barras multiplexadas para inmunoperfilado y caracterización de mapeo espacial en el análisis unicelular de muestras de tejido de parafina

Aprende a realizar inmunoensayos sandwich multiplexados sin reactividad cruzada usando tecnología snap chip. Este método simplificado elimina la necesidad de equipos de microarrays complejos para cuantificación proteica precisa.

Rápido Chip para Cruz-reactivity-libre y observador de tiro multiplexado inmunoensayos de Sandwich

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