Un método para la obtención de secciones seriadas ultrafinas de microorganismos en microscopía electrónica de transmisión

El objetivo general de este procedimiento es realizar cortes ultradelgados en serie de forma segura y sencilla. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, proporcionando información estructural cuantitativa y tridimensional de una célula completa a nivel microscópico electrónico. La principal ventaja de esta técnica es que los cortes ultradelgados en serie pueden realizarse sin necesidad de una máquina costosa, y con este método se pueden obtener imágenes de alta resolución.

Para comenzar este procedimiento, limpie la superficie de un portaobjetos de vidrio. Luego, sumerja una mitad del portaobjetos en la solución de Formvar al 1,5 % en la columna superior del aparato para la elaboración de películas de soporte de Formvar, presionando la solución con aire a través de la llave de tres vías utilizando una pera de goma. Drene la solución de la columna abriendo la llave de tres vías y liberando el aire para reducir la presión.

Luego retire el portaobjetos del aparato y séquelo al aire para formar una película sobre la superficie del portaobjetos. Raspe los cuatro bordes de la película sobre el portaobjetos con una cuchilla de afeitar. Después de soplar sobre el portaobjetos para facilitar la separación de la película del portaobjetos, desprenda la película sumergiendo lentamente el portaobjetos en agua con un ángulo horizontal bajo.

Luego, recoja la película de Formvar del agua utilizando un soporte de aluminio con orificios. Para recortar el bloque de muestra con una cuchilla de recorte ultrasónica y una cuchilla de afeitar bajo un microscopio estereoscópico, primero asegúrese de que hay células en la superficie del bloque observando la punta del bloque con un microscopio óptico. A continuación, coloque el bloque de muestra en el portamuestra y monte el portamuestra en una plataforma de recorte.

Recorte los bloques a un tamaño de 0,7 por 1,0 milímetros. Si la resina epoxi es muy dura, primero recorte la caja utilizando una cuchilla de trinchado ultrasónica, luego siga recortando el bloque con una cuchilla de afeitar. Corte un hombro para marcar la dirección del corte.

Para recortar el bloque de muestra con una cuchilla de diamante utilizando el micrótomo, coloque el portamuestras del bloque de muestra en el soporte de la ultramicrótomo. Corte la superficie del bloque con una cuchilla de diamante para recorte. Coloque el borde de la cuchilla de diamante paralelo a la cara del bloque de muestra y corte la mínima cantidad posible de la superficie de la muestra para no perder ningún espécimen.

Corte el borde izquierdo del bloque utilizando el cuchillo de trinchado, girando la platina del cuchillo 30 grados hacia la izquierda. Este borde se convertirá en el lado superior de la muestra durante el corte en serie. Luego, corte la cara del bloque a aproximadamente 100 micrones del borde izquierdo del espécimen girando la platina del cuchillo 30 grados hacia la derecha.

Este borde se convierte en el lado inferior del espécimen en el corte seriado. Retire la cuchilla de recorte y gire el bloque del espécimen 90 grados en sentido horario. Coloque una cuchilla para corte ultradelgado en la platina de la cuchilla.

Ajuste la superficie del espécimen y el borde del cuchillo para que queden paralelos entre sí, utilizando la parte más grande de la superficie del espécimen. A continuación, aplique cinta adhesiva sobre el portaespécimen y el soporte del microtomo, y corte la cinta en el límite. Saque el portaespécimen del microtomo y colóquelo bajo el microscopio estereoscópico.

Corte la parte grande del espécimen con una hoja de bisturí, dejando la parte delgada de la cual se obtendrán cortes seriados. Aplique los lados de los cortes con adhesivo utilizando una pipeta Pasteur para colocar aproximadamente un microlitro de solución de Neoprene al 0,5 % sobre el espécimen que se utilizará para el corte seriado. Luego, cubra completamente el espécimen con la solución de Neoprene. Absorba inmediatamente el exceso de solución de Neoprene con un trozo de papel filtro colocado cerca del espécimen.

A continuación, prepare tres rejillas con ranuras para recoger secciones seriadas. Para ello, doble el mango de las rejillas a 60 grados y trátelas con una solución de Neoprene al 0,5 %. Luego, haga que las rejillas sean hidrófilas mediante descarga de resplandor (glow discharge).

Coloque nuevamente el porta-muestras en el micrótomo en la misma posición alineando las partes con cinta. Esto mantiene la cara del bloque y el filo del cuchillo perfectamente paralelos entre sí. Luego acerque el cuchillo al espécimen.

Después de llenar la cápsula del cuchillo con agua, cubra el microtomo con una tapa de plástico para evitar la corriente de aire. Comience a cortar la muestra con un grosor de sección de 200 nanómetros. Después de cortar la primera sección, ajuste el grosor de sección a 70 nanómetros.

Cuando el número de cortes seriados alcance 20, ajuste el grosor del corte a 10 nanómetros. Dado que el micrótomo no puede cortar secciones de 10 nanómetros de grosor, no aparece ninguna sección nueva y las secciones previamente cortadas se separan del borde del cuchillo. A continuación, ajuste el grosor del corte a 60 nanómetros.

Esto producirá secciones de 70 nanómetros porque la máquina sumará el espesor previo de 10 nanómetros. Finalmente, restablezca el espesor de la sección a 70 nanómetros y continúe cortando hasta obtener secciones de 1,8 milímetros de largo. Para recoger las secciones seriadas, primero coloque el lazo de sujeción de secciones sobre el tercer grupo de secciones.

Luego coloque el lazo elevador de la superficie del agua sobre la etapa del cuchillo. Coloque el lazo del lazo elevador de la superficie del agua justo encima de las secciones en serie moviendo su eje y mango. Baje el lazo del lazo elevador de la superficie del agua sobre la superficie del agua de modo que el lazo rodee las secciones.

Presione el lazo hacia abajo girando el tornillo hacia abajo para que la superficie del agua se eleve por la tensión superficial. Mueva la sección al centro del lazo. Colóquela en el vértice del agua y ajuste la dirección de la sección utilizando un cabello.

Recoger los grupos de secciones tocándolos con una rejilla de hendidura desnuda, ayudándose con pinzas y manteniéndola paralela a la superficie del agua. Coloque las rejillas con las secciones junto con una pequeña gota de agua sobre la película de soporte de Formvar. Retire el exceso de agua utilizando papel de filtro.

Después de que los cortes estén completamente secos, rompa la película de Formvar alrededor de las rejillas y retire las rejillas que contienen los cortes. Coloque las rejillas en la ranura del tubo de tinción en el orden adecuado, y tiña los cortes con acetato de uranilo y citrato de plomo. Coloque cinco rejillas en el portamuestras múltiple en el orden correcto, orientando el eje largo de la ranura de la rejilla perpendicular al eje del portamuestras.

Fije la rejilla con fijadores de rejilla e inserte el portamuestras en el microscopio electrónico de transmisión. Proceda a tomar imágenes de las células diana y de todas las secciones celulares a alto aumento. Aquí se muestra una vista de bajo aumento de cinco rejillas que contienen secciones seriadas.

Se montaron entre 18 y 25 secciones en una sola rejilla. Tenga en cuenta que las secciones están unidas entre sí y tienen el mismo grosor. Aquí se muestran secciones seriadas de la miogénesis del pericarion.

La figura muestra 12 de 67 secciones completas. Se encontró que esta célula posee un nucleoide grande compuesto por fibras de ADN desnudas con una única membrana nucleoide y endosimbiontes que se asemejan a bacterias, pero carece de mitocondrias. Por lo tanto, este organismo parece ser una forma de vida intermedia que evoluciona de procariota a eucariota.

Se muestran aquí secciones seriadas de Escherichia coli. La figura muestra 12 secciones completas. Curiosamente, se encontró que esta célula contiene 21.700 ribosomas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar cortes ultradelgados en serie. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres horas si se lleva a cabo correctamente.