Un método para la obtención de secciones seriadas ultrafinas de microorganismos en microscopía electrónica de transmisión

El objetivo general de este procedimiento es hacer secciones ultrafinas en serie de forma segura y sencilla. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, proporcionando información estructural cuantitativa y tridimensional de una célula completa a nivel de microscopio electrónico. La principal ventaja de esta técnica es que el corte ultrafino en serie se puede realizar sin una máquina costosa, y con este método se pueden obtener imágenes de alta resolución.

Para comenzar este procedimiento, limpie la superficie de un portaobjetos de vidrio. A continuación, sumerja la mitad del portaobjetos de vidrio en una solución de Formvar al 1,5% en la columna superior del aparato de fabricación de películas de soporte Formvar presionando la solución con aire a través de la llave de paso de tres vías con una bola de goma. Drene la solución de la columna abriendo la llave de paso de tres vías y liberando aire para reducir la presión.

Luego saque el portaobjetos de vidrio del aparato y séquelo al aire para formar una película en la superficie del portaobjetos de vidrio. Raspe los cuatro bordes de la película en el portaobjetos de vidrio con una cuchilla de afeitar. Después de respirar en el portaobjetos para facilitar la separación de la película del portaobjetos, flote fuera de la película sumergiendo el portaobjetos de vidrio en el agua lentamente en un ángulo horizontal bajo.

A continuación, recoge la película Formvar del agua utilizando una rejilla de aluminio con agujeros. Para recortar el bloque de muestras con una cuchilla de recorte ultrasónica y una cuchilla de afeitar bajo un microscopio estereoscópico, primero asegúrese de que haya células en la superficie del bloque observando la punta del bloque con un microscopio óptico. A continuación, monte el bloque de muestras en el mandril y monte el mandril en una etapa de recorte.

Recorte los bloques a un tamaño de 0,7 por 1,0 milímetros. Si la resina epoxi es muy dura, recorta primero la caja con una cuchilla de corte ultrasónica, luego recorta aún más el bloque con una cuchilla de afeitar. Corta un hombro para marcar la dirección de corte.

Para recortar el bloque de muestras con una cuchilla de diamante utilizando el micrótomo, coloque el mandril del bloque de muestras en el soporte de muestras del ultra micrótomo. Corta la superficie del bloque con un cuchillo de corte de diamante. Coloque el borde de la cuchilla de diamante paralelo a la cara del bloque de la muestra y corte la cantidad mínima de superficie de la muestra para no perder ninguna muestra.

Corte el borde izquierdo del bloque con la cuchilla de corte girando la etapa de la cuchilla 30 grados hacia la izquierda. Este borde se convierte en la parte superior de la muestra en el corte en serie. A continuación, corte la cara del bloque a unas 100 micras del borde izquierdo de la muestra girando la etapa de la cuchilla 30 grados hacia la derecha.

Este borde se convierte en el lado inferior de la muestra en el corte en serie. Retire la cuchilla de corte y gire el bloque de muestras 90 grados en el sentido de las agujas del reloj. Coloque una cuchilla de corte ultrafina en la etapa de la cuchilla.

Ajuste la superficie de la muestra y el borde de la cuchilla de modo que queden paralelos entre sí utilizando la parte grande de la superficie de la muestra. A continuación, aplique cinta adhesiva en el mandril y en el soporte del mandril del micrótomo, y corte la cinta en el límite. Saque el mandril de muestras del micrótomo y colóquelo debajo del microscopio estereoscópico.

Corte la parte grande de la muestra con una cuchilla de afeitar, dejando la parte delgada de la que se obtendrán las secciones en serie. Haga que los lados de la sección sean adhesivos utilizando una pipeta Pasteur para dejar caer aproximadamente un microlitro de solución de neopreno al 0,5% sobre la muestra que se utilizará para el corte en serie. A continuación, cubra toda la muestra con una solución de neopreno. Absorba el exceso de solución de neopreno inmediatamente con un trozo de papel de filtro colocado cerca de la muestra.

A continuación, prepare tres rejillas de hendidura para recoger secciones en serie. Para ello, doble el mango de las rejillas a 60 grados y trate las rejillas con una solución de neopreno al 0,5%. A continuación, haga que las rejillas sean hidrófilas por descarga incandescente.

Vuelva a colocar el mandril de bloque de muestra en el micrótomo en la misma posición alineando las piezas encintadas. Esto mantiene la cara del bloque y el filo de la cuchilla perfectamente paralelos entre sí. A continuación, acerque el cuchillo a la muestra.

Después de llenar el bote de cuchillos con agua, cubra el micrótomo con una cubierta de plástico para evitar el flujo de aire. Comience a cortar la muestra con un grosor de sección de 200 nanómetros. Después de cortar la primera sección, establezca el grosor de la sección en 70 nanómetros.

Cuando el número de secciones en serie llegue a 20, establezca el grosor de la sección en 10 nanómetros. Dado que el micrótomo no puede cortar secciones de 10 nanómetros de grosor, no aparece ninguna sección nueva y las secciones cortadas previamente se separan del filo de la cuchilla. A continuación, establezca el grosor de la sección en 60 nanómetros.

Esto producirá secciones de 70 nanómetros porque la máquina agregará el grosor de 10 nanómetros anterior. Finalmente, vuelva a establecer el grosor de la sección en 70 nanómetros y continúe cortando hasta obtener secciones de 1,8 milímetros de largo. Para recoger las secciones en serie, primero coloque el bucle de retención de secciones en el tercer grupo de secciones.

A continuación, coloque el bucle de elevación de la superficie del agua en la etapa de la cuchilla. Coloque el bucle del WSRL justo encima de las secciones en serie moviendo su eje y manija. Baje el bucle del WSRL sobre la superficie del agua de modo que el bucle rodee las secciones.

Empuje el bucle hacia abajo girando el tornillo hacia abajo para que la superficie del agua se eleve por la tensión superficial. Mueva la sección al centro del bucle. Colócalo en el vértice del agua y ajusta la dirección de la sección usando un mechón de cabello.

Recoja los grupos de secciones tocándolos con una rejilla de hendidura desnuda, que se ayuda con pinzas y se mantiene paralela a la superficie del agua. Coloque las rejillas con secciones junto con una pequeña gota de agua sobre la película de soporte Formvar. Retire el exceso de agua con papel de filtro.

Después de que las secciones estén completamente secas, rasgue la película Formvar alrededor de las rejillas; y retire las rejillas que llevan las secciones. Coloque las rejillas en la ranura del tubo de tinción en el orden correcto y tiña las secciones con acetato de uranilo y citrato de plomo. Coloque las cinco rejillas en el portamuestras múltiples en el orden correcto, orientando el eje largo de la ranura de la rejilla perpendicular al eje del portamuestras.

Fije la rejilla con fijadores de rejilla e inserte el portamuestras en el microscopio electrónico de transmisión. Proceda a tomar fotografías de las celdas objetivo y todas las secciones de celdas con gran aumento. Aquí se muestra una vista de baja ampliación de cinco cuadrículas que llevan secciones en serie.

Se montaron de 18 a 25 secciones en una cuadrícula. Tenga en cuenta que las secciones están unidas entre sí y tienen el mismo grosor. Aquí se muestran secciones seriadas de la miogénesis del pericarion.

La figura muestra 12 de las 67 secciones completas. Se descubrió que esta célula tenía un gran nucleoide que consistía en fibras de ADN desnudas con una sola membrana nucleoide y endosimbiontes que se asemejan a las bacterias pero no a las mitocondrias. Por lo tanto, este organismo parece ser una forma de vida intermedia que evoluciona de procariota a eucariota.

Aquí se muestran secciones seriadas de Escherichia coli. La figura muestra 12 secciones completas. Curiosamente, se descubrió que esta célula contenía 21.700 ribosomas.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo hacer secciones ultradelgadas en serie. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres horas si se realiza correctamente.