Name: Un método para la obtención de secciones seriadas ultrafinas de microorganismos en microscopía electrónica de transmisión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-17T10:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Aprende a obtener secciones seriadas ultrafinas de microorganismos para microscopía electrónica de transmisión sin equipos costosos. Este método proporciona información estructural tridimensional de células completas con alta resolución.

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Agradecemos sinceramente a Shigeo Kita por sus valiosas sugerencias y discusión. También agradecemos a John y Sumire Eckstein para su lectura crítica del manuscrito.

Nota: Los especímenes utilizados en este estudio fueron microorganismos, propano rápidamente congelados en nitrógeno líquido, congelarán substituido en acetona que contiene tetróxido de osmio 2% y embebidos en resina epoxy1,2,3, 4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 ,14,15,16,17,18.
1. preparación de película de soporte (figura 1-3)
Nota: Película de soporte Formvar color plateado está preparada usando el método de fundición en vidrio19.
<ol><li>Añadir 100 mL de 1,5% Formvar en dicloruro de etileno a un aparato de fabricación de Formvar (figura 1). Sumerja la mitad de un portaobjetos de cristal (76 x 26 x 1,3 mm) en la solución de Formvar en la columna superior del aparato presionando la solución con el aire a través de la 'a' usando una bola de caucho19.<ol>
<li>Vaciar la solución de la columna abriendo la llave de tres vías y liberación de aire a través de 'b' para reducir la presión. Sacar el portaobjetos de cristal del aparato y se secan en el aire para formar una película en la superficie de lo portaobjetos de vidrio. Usar una lámpara incandescente para acelerar el secado de la película de Formvar.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de raspar de los cuatro bordes de la película en la diapositiva de cristal con una cuchilla de afeitar (Figura 2a) y la respiración sobre el portaobjetos para facilitar la separación de la película de la diapositiva20, flotan de la película de agua sumergiendo el portaobjeto en el agua lentamente en un ángulo horizontal baja (aproximadamente 10°, figura 2b).</li>
	<li>Sacar con pala encima de la película de Formvar del agua usando un bastidor de aluminio (30 x 25 x 3 mm) con agujeros (4 mm de diámetro) (figura 3a). No la rejilla con la película de Formvar en un desecador hasta su uso (figura 3b).</li>
</ol>2. Ajuste el bloque de muestra con una cuchilla de ultrasonidos y una hoja de afeitar 21 bajo un estereomicroscopio (figura 4)
<ol><li>Asegúrese de que hay células en la superficie del bloque mediante la observación de la punta del bloque con un microscopio de luz (figura 4a).</li>
	<li>Montar el bloque de muestra en el plato (soporte del bloque) y el mandril en un recorte etapa21 (Figura 4b). Esta etapa de recorte tiene un mecanismo de iluminación de la parte posterior de la muestra.</li>
	<li>Cortar el bloque a un tamaño de 0,7 x 1,0 mm (figuras 4C, 5D). Puesto que la resina de epoxy es muy dura, cortar los bloques primero usando una cuchilla cortadora ultrasónica. La cuchilla cortadora ultrasónica es una máquina recientemente introducida, y los bloques se recortan fácilmente. Luego cortar el bloque de más con una cuchilla de afeitar. Corte un hombro para marcar la dirección del corte (ver Figura 5D, figura 8).</li>
</ol>3. Ajuste el bloque de muestras con cuchilla de diamante utilizando el micrótomo (figura 5)
<ol><li>Establecer el bloque muestra tirada en el soporte de espécimen de la ultramicrotomía. Coloque la muestra 90° hacia la izquierda contra la posición actual cuando el seccionamiento ultrafino serial es realizado (ver Figura 5D).</li>
	<li>Cortar la superficie del bloque con un cuchillo de corte de diamante (ver Figura 5D). Ajuste el borde del cuchillo de diamante paralelo a la cara del bloque de muestra y corte la cantidad mínima de superficie de la muestra para no perder a ningún espécimen (Figura 5D). Nota: Este paso se hace para suavizar la superficie de la muestra. La parte de la superficie de la muestra de la parte delgada queda intacta (por lo tanto, esta parte no es brillante como un espejo, Figura 5D), para que no se pierde ninguna parte de la muestra para el seccionamiento serial. Esto es porque la muestra es expuesta en la superficie del bloque.</li>
	<li>Coloque un espejo (corte de Mesa, M) en el escenario de cuchillo para controlar el corte del bloque del espécimen (figura 5C).</li>
	<li>Corte el borde izquierdo (esto se convierte en la parte superior, figura 5 d, de la muestra en el seccionamiento serial) del bloque usando el cuchillo de cortar girando la etapa cuchillo 30 ° a la izquierda (figura 5a).</li>
	<li>Cortar la cara del bloque en cerca de 100 μm desde el borde izquierdo de la muestra (esto se convierte en la parte inferior de la muestra en el seccionamiento serial, figura 5 d) girando la etapa cuchillo 30 ° a la derecha (figura 5b). Nota: Las secciones seriales serán cortadas de la parte delgada de la muestra de cerca de 90 nm x 1 mm de tamaño. La mayor parte se utilizará para ajustar la superficie de la muestra y el borde de cuchillo que son paralelas. Después de ajustar la superficie de la muestra para ser paralela al borde de cuchillo, se eliminará la mayor parte con una cuchilla de afeitar. Cortando los lados superiores e inferiores de la muestra con el microtomo, ambos lados de la muestra se convierten en suave y exactamente paralelas entre sí (Figura 5D), que es necesario para tener secciones rectas e ininterrumpidas de la cinta.</li>
</ol>4. Ajuste el borde de la superficie y cuchillo de muestra para que corren paralelo a 21
<ol><li>Quitar la cuchilla de corte y gire el bloque de la muestra 90° hacia la derecha.</li>
	<li>Establezca una cuchilla de seccionamiento ultrafino en la etapa de cuchillo.</li>
	<li>Ajustar la superficie de la muestra y el filo para que corren paralelo con gran parte de la superficie del espécimen. Nota: Gran parte de la muestra se utiliza para el ajuste porque la cara de corte de seccionamiento serial es tan pequeña, lo que dificulta ajustar el espécimen de la superficie y cuchillo el borde usando esta parte solamente, sobre todo en dirección vertical. Así, utilizando gran parte de la pieza facilita el ajuste.</li>
</ol>5. difundir la solución de neopreno en el bloque de la muestra (figura 6)
<ol><li>Para colocar el portabrocas del espécimen en exactamente la misma posición como la posición original, aplique la cinta en el mandril y el mandril del microtomo y corte en el límite (Figura 6a).</li>
	<li>Sacar a la muestra de tirada del microtomo y se coloca bajo el estereomicroscopio (figura 6b). Cortar la parte grande de la muestra con una cuchilla de afeitar, dejando la parte delgada, de la cual se obtendrán las secciones seriales.</li>
	<li>Utilizando una pipeta Pasteur, gota de 1 μl 0.5% neopreno solución (figura 6b) en la muestra a utilizarse para seccionamiento serial, para hacer el pegamento de lados de la sección. Cubrir a la muestra entera con solución de neopreno. Absorba la solución de neopreno exceso inmediatamente con un pedazo de papel de filtro colocado cerca de la muestra. Una cinta de las secciones es esencial para tomar fotografías de las secciones de la serie de la célula, y pegamento de neopreno es muy útil para pegar las secciones juntas.</li>
	<li>Preparar rejillas de ranura 3 (tamaños de ranuras: medio, 0,4 mm x 2,2 mm, ambos lados 0,2 mm x 2,2 mm) (figura 6 c) para recoger las secciones seriales doblando el mango de las rejillas a 60 °, tratamiento de las rejillas con solución de neopreno de 0,5% y haciendo hidrofílica de las rejillas resplandor descarga22.</li>
</ol>6. hacer las secciones seriales (figura 7-9)
<ol><li>Lugar el bloque de muestra de la tirada en el micrótomo en la misma posición como 5.1 (Figura 6a) alineando las piezas con cinta. Esto mantiene la cara del bloque y el borde de cuchillo perfectamente paralelos entre sí. A continuación, llevar el cuchillo cerca de la muestra.</li>
	<li>Llene el bote de cuchillo con agua.</li>
	<li>Cubra el micrótomo con un plástico para prevenir el flujo de aire (figura 7). Nota: Flujo de aire durante el seccionamiento ultrafino y la recuperación de las secciones a menudo causa problemas. La tapa de plástico tiene tres agujeros: un agujero es para las lentes de binoculares, y son los otros dos agujeros para que los brazos permitir la operación mientras que la cubierta es en. Los apoyabrazos de madera se utilizan para la colocación de los brazos mientras hacía trabajos delicados, como recuperar las secciones seriales con rejillas. Los apoyabrazos de madera se colocan en diferentes tablas de la mesa del micrótomo (figura 7, flechas), para no transmitir la vibración de las manos del operador para el micrótomo.</li>
	<li>Empiece a cortar al espécimen en el espesor de sección de 200 nm (figura 8). Ajuste de grosor de nm 200 ahorrará tiempo en llevar el cuchillo a la superficie de la muestra.</li>
	<li>Después de la primera sección, se establece el espesor de la sección a 70 nm (figura 8).</li>
	<li>Cuando el número de secciones seriadas alcanza 20 (precisamente hablando, después de los tramos de cinta aproximadamente 1.8 mm; el número de secciones varía dependiendo del ancho de las secciones), el espesor de la sección a 10 nm (figura 8) sin dejar de cortar. Nota: Puesto que el micrótomo no puede cortar 10 nm de espesor secciones, ninguna nueva sección aparece, y se separan las secciones anteriormente cortadas desde el borde de cuchillo. Es importante que los grupos separados de la sección (figura 9) para que levantar secciones seriadas evitar dificultades en la separación de secciones manualmente usando un par de filamentos del pelo. Desde el campo de visión en el microscopio electrónico de transmisión es de 2,0 mm, secciones deberían ser 1,8 mm de largo como máximo.</li>
	<li>Ajustar el espesor de la sección a 60 nm (figura 8). Esto producirá 70 secciones de nm (figura 8) porque la máquina añadir el grueso de nm 10 anterior.</li>
	<li>Ajustar el espesor de la sección a 70 nm (figura 8) y corte hasta que se obtienen secciones de 1.8 mm de longitud.</li>
	<li>Repita 6.6-6.8 hasta cinco secciones largas de 1,8 mm se obtienen (figura 9). Generalmente hacemos cinco grupos de sección ya que hay cinco sostenedores del espécimen en el microscopio electrónico de transmisión disponibles en nuestro laboratorio, pero cinco no es el límite.</li>
</ol>7. recoger las secciones seriales (figura 10-12)
<ol><li>Colocar el 'lazo de retención de sección'23 (diámetro interior del bucle: 5.0 mm) (figura 10a) en el tercer grupo de la sección (figura 10b). Nota: Es necesario recuperar las secciones en el orden de sus secciones para tomar fotos en el orden adecuado. Sin embargo, puesto que hay cinco grupos de sección en el barco de cuchillo, lo a menudo obtiene confusos que los grupos que son. Colocando el lazo sobre el tercer grupo, está claro que los dos grupos cerca del operador son la primera y segunda y los dos distantes del operador son los grupos cuarto y quinto (figura 10b). Esto evitará que el orden de mezcla.</li>
	<li>Lugar de 'bucle de agua superficie de sensibilización'23 (WSRL, diámetro interno del lazo: 4.0m m) (figura 11a) en la etapa de cuchillo (Figura 11b). El WSRL estará firmemente en la escena del cuchillo ya que está equipada con un imán en la parte inferior.<ol>
<li>Coloque el lazo de la WSRL justo por encima de las secciones seriadas mediante el movimiento de su eje y manija. Baje el lazo de la WSRL sobre la superficie del agua para que el lazo rodea las secciones.</li>
		<li>Empuje el bucle girando el tornillo hacia abajo para que la superficie del agua se eleve por tensión superficial (figuras c 11-d). Mover la sección hasta el centro del lazo, colóquelo sobre el vértice del agua y ajuste la dirección de la sección utilizando un filamento de cabello21.</li>
		<li>Recoger grupos de sección al tocarla con una cuadrícula de raja pelada, que es sostenida por pinzas y se mantiene paralela a la superficie del agua (figura 11 d). Es importante para las secciones tocar la red en primer lugar, no el agua, colocar las secciones precisamente en el centro de la cuadrícula (figura 11 d).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloque las rejillas con secciones junto con una pequeña gota de agua en la de película de Formvar en apoyo16 (figura 12) y quite el exceso de agua utilizando papel de filtro. Nota: Arrugamiento de la película de soporte suele ser un problema cuando las secciones son recogidas con una red de película de soporte porque la membrana (secciones) abarca (película de soporte) la membrana directamente. El problema de obtener las arrugas en la película de soporte se reduce significativamente mediante la colocación de una rejilla de sección de rodamiento junto con una gota de agua el de película de Formvar apoyo16.</li>
</ol>8. tinción de secciones16,24 (figura 13)
<ol><li>Después de las secciones están completamente secas, rasgar la película de Formvar desde alrededor de las rejillas y sacar las rejillas con las secciones.</li>
	<li>Las rejillas en la ranura del tubo tinción16 en el orden adecuado (figura 13) y mancha secciones con uranilo acetato y plomo citrato24. Nota: Hay una ranura 0,6 mm de profundidad en el eje largo del tubo de corte con una cuchilla de afeitar. El tubo es útil para evitar la rotura accidental de las películas de soporte al utilizar pinzas, ya que la manipulación directa de las redes no es necesario durante el proceso de tinción y lavado16.</li>
</ol>9. observación de secciones seriadas (figura 14)
<ol><li>Coloque las 5 rejillas en el soporte de múltiples muestra en el orden adecuado (figura 14a), orientando el eje largo de la ranura de la rejilla perpendicular al eje sostenedor de la muestra. Los mangos (flecha) de las rejillas no debe cortar, porque las 'fijadores de rejilla' no va a tocar las manijas.</li>
	<li>Fijar las rejillas con 'red-fijadores' (figura 14b) e Inserte el soporte de espécimen en el microscopio electrónico de transmisión. Nota: A menudo es útil tomar imágenes de ampliación baja de todas las secciones de la célula (figura 15) para encontrar interesantes microorganismos o células en buen estado sin contaminación y con buena fijación, antes de tomar fotografías de la célula diana.</li>
	<li>Tomar fotografías de las células blanco en todas las secciones de la célula en gran aumento.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El método presentado aquí no requiere de costoso equipo. Requiere sólo un bastidor de aluminio (figura 3), hendidura de tres rejillas (figura 6 c), sección explotación bucles (figura 10a), lazo de aumento de superficie de agua (figura 11a) y un tubo de tinción (figura 13). Hay muchas características del método actual. Gran parte de la muestra se utiliza para ajustar el bord...

Técnica de seccionamiento ultrafina serie adecuada es indispensable para el estudio de las células y los componentes de la célula tridimensionalmente en el nivel microscópico de electrones. Hemos estudiado la dinámica del cuerpo de polo del huso en el ciclo celular de las células de levadura y reveló cambios morfológicos de su ultraestructura durante el ciclo celular y el tiempo de duplicación1,2,3, 4,5. En 2006, acuñó una nueva palabra 'structome' mediante la combinación de 'estructura' y '-ome' y se define como la 'información cuantitativa y tridimensional estructural de una célula entera en el nivel microscópico de electrones' 6,7.
Por el análisis de structome, que requiere técnica de seccionamiento ultrafino serial, se encontró que una célula de levadura de Saccharomyces cerevisiae y Exophiala dermatitidis tenía unos 200.000 ribosomas7,8, un Escherichia coli celular tenía 26.000 ribosomas9, un celular de la Mycobacterium tuberculosis tenía 1.700 ribosomas10 y bacterias en espiral Myojin tenían los ribosomas sólo 30011. Esta información es útil en la estimación no solo de la tasa de crecimiento en cada organismo, pero también en la identificación de especies9.
Además, structome análisis conducido al descubrimiento de un nuevo organismo; Parakaryon myojinensis fue encontrado en el mar frente a las costa de Japón, cuya estructura de la célula fueron un intermedio entre los de procariotas y eucariotas,12,13,14,15. En la actualidad, serie técnica de seccionamiento ultrafino se considera tan difícil que tomaría mucho tiempo al maestro. En este estudio, hemos desarrollado un método fiable en la que cualquiera puede realizar seccionamiento ultrafino serial sin dificultad.

<table><tbody><tr><td>Aparato de fabricación Formvar</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>652</td><td>W 180 x D 180 x H 300 mm</td></tr><tr><td>Corredera de vidrio</td><td>Matsunami Co. Ltd., Osaka-76</td><td></td> <td>x 26 x 1,3 mm</td></tr><tr><td>Bastidor de aluminio con agujeros de 4 mm</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>658</td><td>W 30 x D 25 x H 3 mm, Consulte este documento</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Nikon Co. Ltd., </td><td></td><td>Tokyo-SMZ 645</td></tr><tr><td>Iluminación LED para microscopio estereoscópico</td><td>Nikon Co. Ltd., Tokio-SM-LW</td><td></td> <td>61 Ji</td></tr><tr><td>Etapa de recorte</td><td>Sunmag Co.Ltd., Tokio-Mecanismo</td><td></td> <td>de inclinación equipado, Consulte este documento</td></tr><tr><td>Iluminación LED para la etapa de recorte</td><td>Sunmag Co.Ltd., Tokio-Consulte</td><td></td> <td>este documento</td></tr><tr><td>Cuchilla de recorte ultrasónica</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>5240</td><td>EM-240, Consulte este documento</td></tr><tr><td>Cuchillo de diamante para recortar</td><td>Diatome Co. Ltd.,</td> <td>Suiza-45</td><td>&deg;</td></tr><tr><td>Cuchilla de diamante para corte ultrafino</td><td>Diatome Co. Ltd.,</td> <td>Suiza-45</td><td>&deg;</td></tr><tr><td>Ultramicrótomo</td><td>Leica Microsystems,</td> <td>Vienna-Ultracut</td> <td>S</td></tr><tr><td>Mesa cut</td><td>Leica Microsystems,</td> <td>Vienna-Mirror</td><td></td></tr> <tr><td>0.5% Solución de neopreno W</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>605</td><td></td></tr><tr><td>Rejilla especial de níquel de 3 ranuras</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>2458</td><td>Consulte este documento</td></tr><tr><td>Rejilla especial de cobre de 3 ranuras</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>2459</td><td>Consulte este documento</td></tr><tr><td>Bucle de retención de secciones</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>526</td><td>Consulte este documento</td></tr><tr><td>Bucle de elevación de la superficie del agua</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>527</td><td>Consulte este documento</td></tr><tr><td>Tubo de tinción</td><td>Nisshin EM Co. Ltd., Tokio</td><td>463</td><td>Consulte este documento</td></tr><tr><td>Soporte de muestras múltiples</td><td>JEOL Co. Ltd., Tokio-EM-11170</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JEM-1400</td><td>JEOL Co. Ltd.,</td><td></td> <td>Tokio-Microscopio electrónico de transmisión</td></tr></tbody></table>

un método para la obtención de secciones seriadas ultrafinas de microorganismos en microscopía electrónica de transmisión

A Method for Obtaining Serial Ultrathin Sections of Microorganisms in Transmission Electron Microscopy

Observación de células y componentes de la célula en tres dimensiones en el gran aumento en microscopía electrónica de transmisión requiere la preparación de secciones ultrafinas seriales de la muestra. Aunque la preparación de secciones ultrafinas seriales es considerado como muy difícil, es bastante fácil si se utiliza el método apropiado. En este documento, se muestra un procedimiento paso a paso para la obtención segura de las secciones ultrafinas seriales de microorganismos. Los puntos claves de este método son: 1) a utilizar gran parte de la muestra y ajustar el borde de la superficie y cuchillo de muestra para que sean paralelas entre sí; 2) para cortar secciones seriales en grupos y evitar dificultades en la separación de las secciones con un par de mechones de pelo al recuperar un grupo de secciones seriadas en las rejillas de ranura; 3) usar un 'lazo de retención de sección' y evitar mezclar el orden de los grupos de sección; 4) para utilizar un bucle de aumento de superficie de agua y asegúrese de que las secciones se colocan en el ápice del agua y que tocan la red en primer lugar, con el fin de colocarlos en la posición deseada sobre las rejillas; 5) para utilizar la película de soporte en un bastidor de aluminio y que sea más fácil recuperar las secciones en las rejillas y evitar el arrugamiento de la película de soporte; y 6) a utilizar un tubo de coloración y evitar romper accidentalmente las películas de soporte con las pinzas. Este nuevo método permite obtener secciones seriadas ultrafinas sin dificultad. El método permite analizar las estructuras celulares de los microorganismos en alta resolución en 3D, que no puede lograrse mediante el método automático de recogida de cinta ultramicrótomo y serie bloque-cara o viga de ion enfocada microscopía electrónica de barrido.

En este protocolo, rejillas de ranura en tres fueron utilizadas para recoger las secciones seriales. Las redes están hechas de níquel o cobre. Las secciones seriales se colocan en la ranura central. Las ranuras en ambos lados son necesarias para ver las secciones al aspirar con la rejilla. Para mantener las rejillas paralelas con secciones seriales al recoger con las pinzas (figura 11 d), el mango se dobla (figura 6 c, derecha). ...

Este estudio presenta procedimientos confiables y fáciles para la obtención de secciones ultrafinas seriales de un microorganismo sin equipo costoso en microscopía electrónica de transmisión.

Un método para la obtención de secciones seriadas ultrafinas de microorganismos en microscopía electrónica de transmisión

Observing cells and cell components in three dimensions at high magnification in transmission electron microscopy requires preparing serial ultrathin ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar cortes ultradelgados en serie de forma segura y sencilla. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología celular, proporcionando información estructural cuantitativa y tridimensional de una célula completa a nivel microscópico electrónico. La principal ventaja de esta técnica es que los cortes ultradelgados en serie pueden realizarse sin necesidad de una máquina costosa, y con este método se pueden obtener imágenes de alta resolución.Para comenzar este procedimiento, limpie la superficie de un portaobjetos de vidrio. Luego, sumerja una mitad del portaobjetos en la solución de Formvar al 1,5 % en la columna superior del aparato para la elaboración de películas de soporte de Formvar, presionando la solución con aire a través de la llave de tres vías utilizando una pera de goma. Drene la solución de la columna abriendo la llave de tres vías y liberando el aire para reducir la presión.Luego retire el portaobjetos del aparato y séquelo al aire para formar una película sobre la superficie del portaobjetos. Raspe los cuatro bordes de la película sobre el portaobjetos con una cuchilla de afeitar. Después de soplar sobre el portaobjetos para facilitar la separación de la película del portaobjetos, desprenda la película sumergiendo lentamente el portaobjetos en agua con un ángulo horizontal bajo.Luego, recoja la película de Formvar del agua utilizando un soporte de aluminio con orificios. Para recortar el bloque de muestra con una cuchilla de recorte ultrasónica y una cuchilla de afeitar bajo un microscopio estereoscópico, primero asegúrese de que hay células en la superficie del bloque observando la punta del bloque con un microscopio óptico. A continuación, coloque el bloque de muestra en el portamuestra y monte el portamuestra en una plataforma de recorte.Recorte los bloques a un tamaño de 0,7 por 1,0 milímetros. Si la resina epoxi es muy dura, primero recorte la caja utilizando una cuchilla de trinchado ultrasónica, luego siga recortando el bloque con una cuchilla de afeitar. Corte un hombro para marcar la dirección del corte.Para recortar el bloque de muestra con una cuchilla de diamante utilizando el micrótomo, coloque el portamuestras del bloque de muestra en el soporte de la ultramicrótomo. Corte la superficie del bloque con una cuchilla de diamante para recorte. Coloque el borde de la cuchilla de diamante paralelo a la cara del bloque de muestra y corte la mínima cantidad posible de la superficie de la muestra para no perder ningún espécimen.Corte el borde izquierdo del bloque utilizando el cuchillo de trinchado, girando la platina del cuchillo 30 grados hacia la izquierda. Este borde se convertirá en el lado superior de la muestra durante el corte en serie. Luego, corte la cara del bloque a aproximadamente 100 micrones del borde izquierdo del espécimen girando la platina del cuchillo 30 grados hacia la derecha.Este borde se convierte en el lado inferior del espécimen en el corte seriado. Retire la cuchilla de recorte y gire el bloque del espécimen 90 grados en sentido horario. Coloque una cuchilla para corte ultradelgado en la platina de la cuchilla.Ajuste la superficie del espécimen y el borde del cuchillo para que queden paralelos entre sí, utilizando la parte más grande de la superficie del espécimen. A continuación, aplique cinta adhesiva sobre el portaespécimen y el soporte del microtomo, y corte la cinta en el límite. Saque el portaespécimen del microtomo y colóquelo bajo el microscopio estereoscópico.Corte la parte grande del espécimen con una hoja de bisturí, dejando la parte delgada de la cual se obtendrán cortes seriados. Aplique los lados de los cortes con adhesivo utilizando una pipeta Pasteur para colocar aproximadamente un microlitro de solución de Neoprene al 0,5 % sobre el espécimen que se utilizará para el corte seriado. Luego, cubra completamente el espécimen con la solución de Neoprene. Absorba inmediatamente el exceso de solución de Neoprene con un trozo de papel filtro colocado cerca del espécimen.A continuación, prepare tres rejillas con ranuras para recoger secciones seriadas. Para ello, doble el mango de las rejillas a 60 grados y trátelas con una solución de Neoprene al 0,5 %. Luego, haga que las rejillas sean hidrófilas mediante descarga de resplandor (glow discharge).Coloque nuevamente el porta-muestras en el micrótomo en la misma posición alineando las partes con cinta. Esto mantiene la cara del bloque y el filo del cuchillo perfectamente paralelos entre sí. Luego acerque el cuchillo al espécimen.Después de llenar la cápsula del cuchillo con agua, cubra el microtomo con una tapa de plástico para evitar la corriente de aire. Comience a cortar la muestra con un grosor de sección de 200 nanómetros. Después de cortar la primera sección, ajuste el grosor de sección a 70 nanómetros.Cuando el número de cortes seriados alcance 20, ajuste el grosor del corte a 10 nanómetros. Dado que el micrótomo no puede cortar secciones de 10 nanómetros de grosor, no aparece ninguna sección nueva y las secciones previamente cortadas se separan del borde del cuchillo. A continuación, ajuste el grosor del corte a 60 nanómetros.Esto producirá secciones de 70 nanómetros porque la máquina sumará el espesor previo de 10 nanómetros. Finalmente, restablezca el espesor de la sección a 70 nanómetros y continúe cortando hasta obtener secciones de 1,8 milímetros de largo. Para recoger las secciones seriadas, primero coloque el lazo de sujeción de secciones sobre el tercer grupo de secciones.Luego coloque el lazo elevador de la superficie del agua sobre la etapa del cuchillo. Coloque el lazo del lazo elevador de la superficie del agua justo encima de las secciones en serie moviendo su eje y mango. Baje el lazo del lazo elevador de la superficie del agua sobre la superficie del agua de modo que el lazo rodee las secciones.Presione el lazo hacia abajo girando el tornillo hacia abajo para que la superficie del agua se eleve por la tensión superficial. Mueva la sección al centro del lazo. Colóquela en el vértice del agua y ajuste la dirección de la sección utilizando un cabello.Recoger los grupos de secciones tocándolos con una rejilla de hendidura desnuda, ayudándose con pinzas y manteniéndola paralela a la superficie del agua. Coloque las rejillas con las secciones junto con una pequeña gota de agua sobre la película de soporte de Formvar. Retire el exceso de agua utilizando papel de filtro.Después de que los cortes estén completamente secos, rompa la película de Formvar alrededor de las rejillas y retire las rejillas que contienen los cortes. Coloque las rejillas en la ranura del tubo de tinción en el orden adecuado, y tiña los cortes con acetato de uranilo y citrato de plomo. Coloque cinco rejillas en el portamuestras múltiple en el orden correcto, orientando el eje largo de la ranura de la rejilla perpendicular al eje del portamuestras.Fije la rejilla con fijadores de rejilla e inserte el portamuestras en el microscopio electrónico de transmisión. Proceda a tomar imágenes de las células diana y de todas las secciones celulares a alto aumento. Aquí se muestra una vista de bajo aumento de cinco rejillas que contienen secciones seriadas.Se montaron entre 18 y 25 secciones en una sola rejilla. Tenga en cuenta que las secciones están unidas entre sí y tienen el mismo grosor. Aquí se muestran secciones seriadas de la miogénesis del pericarion.La figura muestra 12 de 67 secciones completas. Se encontró que esta célula posee un nucleoide grande compuesto por fibras de ADN desnudas con una única membrana nucleoide y endosimbiontes que se asemejan a bacterias, pero carece de mitocondrias. Por lo tanto, este organismo parece ser una forma de vida intermedia que evoluciona de procariota a eucariota.Se muestran aquí secciones seriadas de Escherichia coli. La figura muestra 12 secciones completas. Curiosamente, se encontró que esta célula contiene 21.700 ribosomas.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar cortes ultradelgados en serie. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres horas si se lleva a cabo correctamente.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Engineering

Ingeniería

Fuente: Lutz, D., et.al.  Evaluación de los parámetros de neuroplasticidad ultraestructural después de la transducción en el útero del cerebro y la médula espinal del ratón en desarrollo. J. Vis. Exp. (2019). Este video muestra la preparación y el análisis de microscopía electrónica de transmisión (TEM) de una sección del cerebro de un cachorro de ratón. El protocolo comienza con tejido fijado en tetróxido de osmio incrustado en resina, seguido de un recorte preciso para aislar la región de...

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