Establecimiento de pez cebra Larval como modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidad En Vivo

El objetivo general de este procedimiento es establecer el pez cebra como un modelo in vivo para estudiar la motilidad de Trypanosoma cruzi. El Trypanosoma cruzi es el parásito causante de la enfermedad de Chagas. Esta es una enfermedad tropical desatendida que se transmite principalmente a través de vectores en América Latina y en algunas regiones de los Estados Unidos.

El parásito se transmite al ser humano a través de las heces del vector, que contienen la parte infecciosa, y luego se replica en las células huésped. El movimiento de los flagelos permite que el parásito viaje por el cuerpo. Pero también es esencial para el apego en la invasión celular.

El modelo de infección in vivo por Trypanosoma cruzi se encuentra principalmente en roedores. El trabajo enseña que la opacidad complica el seguimiento del parásito dentro del animal. Hasta ahora, la motilidad del parásito solo se ha estudiado in vitro, por lo tanto, un modelo in vivo permitiría comprender un aspecto clave del movimiento del parásito en condiciones de flujo.

Buscando un modelo alternativo, encontramos las larvas de pez cebra. Las larvas de pez cebra son un poderoso modelo para estudiar las interacciones entre el huésped y el patógeno in vivo. Son pequeños, baratos y muy fáciles de criar en comparación con los ratones.

Muy importante para nuestro estudio es que su sistema inmunológico es muy similar al de los humanos. Su sistema inmunológico adaptativo no comienza a desarrollarse hasta cuatro días después de la fertilización, y madura hasta cuatro semanas después de eso, lo que nos da una ventana muy grande para trabajar sin la interferencia inmune. Sin embargo, la mayor ventaja del pez cebra para nuestro estudio es su transparencia óptica.

Esto lo convierte en un modelo ideal para el cribado microscópico y la obtención de imágenes. Esto, en combinación con todas las técnicas para manipular genéticamente los peces, y todas las líneas transgénicas y mutantes disponibles, realmente da muchas posibilidades de estudio. En este vídeo vamos a mostrar cómo una larva mutante de la línea Casper, que es completamente transparente porque no tiene pigmentación, se puede utilizar para visualizar parásitos T.cruzi in vivo.

Con el fin de visualizar el interior de estos peces cebra, utilizamos microscopía de fluorescencia de lámina de luz. La microscopía de fluorescencia en lámina de luz es una familia de técnicas en las que solo se ilumina el plano focal del objetivo de detección. La consecuencia de esto es que no tienes luz en primer plano o en el fondo, y esto hace que las imágenes sean agradables y nítidas, incluso en el interior de tus embriones.

Dado que solo se ilumina la parte de la muestra que le importa, tiene mucho menos daño fotográfico de su muestra, y eso le permite tomar videos durante largos períodos de tiempo. Aquí, visualizamos parásitos vivos de T. cruzi dentro de larvas de pez cebra. La naturaleza de la lámina de luz nos permite tomar videos de alta velocidad con una buena resolución espacial y temporal, con respecto a los microscopios confocal.

Hasta donde sabemos, los tripanosomas vivos nunca se han visualizado dentro de un organismo vivo. Tres días antes de las inyecciones, establezca apareamientos con parejas sanas de peces machos y hembras, o un macho y dos hembras en tanques de cría para aumentar la producción total de huevos. Siguiendo el protocolo de texto, recoja los huevos desovados con un colador pequeño.

Lave los huevos invirtiendo el colador y vertiendo agua de huevo a través del colador en una placa de Petri. Para mantener a los embriones sanos, limpie su agua eliminando cualquier residuo u óvulo no fertilizado con una pipeta de plástico de transferencia. A continuación, coloque los embriones en una incubadora a 28 grados centígrados y repita el procedimiento de limpieza cada tres horas para descartar los huevos inviables y mantener la nidada sana.

A las 48 horas o dos días después de la fecundación, comprueba que la mayoría de los embriones han eclosionado. Sin embargo, si es necesario, descoriona los embriones bajo el estereoscopio agarrando los extremos opuestos del corion con dos pinzas afiladas y tira suavemente de un extremo para abrirlo. Utilice una pipeta de transferencia para eliminar el corion del agua.

Para la inyección, primero prepare agujas de un milímetro con capilares de vidrio de pared delgada y un dispositivo polar de micropipeta. Guarde las agujas selladas en una placa de Petri sobre una tira de arcilla para modelar. Para hacer el molde de microinyección, prepare una solución de agarosa al 1,5% en agua destilada y viértala en una placa de Petri.

A continuación, coloque un molde de microinyección de larvas prefabricado sobre la agarosa y deje que se solidifique completamente a temperatura ambiente sobre una superficie plana. Levante el molde de microinyección y agregue agua para almacenarlo a cuatro grados centígrados. Esto evita que la agarosa se seque.

Prepare la solución anestésica agregando agua de huevo al volumen apropiado de caldo de Tricaine para obtener una concentración final de 150 miligramos por litro. Almacene la solución a cuatro grados centígrados. Finalmente, prepare un stock de agarosa de bajo punto de fusión para la obtención de imágenes disolviendo polvo de agarosa de bajo punto de fusión en agua de huevo hasta una concentración final de 1%Caliente la mezcla hasta que la solución de agarosa parezca homogénea y almacene alícuotas a cuatro grados en tubos de reacción de 1,5 mililitros.

Los parásitos se obtienen a partir de un aislado de Trypanosoma cruzi 01/DA y se cultivan en una línea celular de astrocitoma humano, suplementada con medios completos utilizando matraces T25. Después de tres o cuatro días de cultivo, los parásitos salen de las células y los tripomastigotes se pueden recolectar del sobrenadante. Centrifugar este sobrenadante durante cinco minutos y resuspender suavemente el pellet en 1X PBS con suero fetal de ternero.

A continuación, centrifugar durante cinco minutos, desechar el sobrenadante y volver a suspender en un mililitro de PBS. Tome 10 microlitros para contar los parásitos que nadan libremente en una cámara de Neubauer. Tomar el resto de parásitos resuspendidos y añadir un microlitro de CFSE e incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, agregue PBS para completar 10 mililitros. Centrifugar durante cinco minutos, desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet que contiene los parásitos marcados en 100 microlitros de PBS. Después de este procedimiento de etiquetado, es importante verificar que los parásitos estén vivos y correctamente marcados mediante la visualización directa de los parásitos en un microscopio de florescencia invertida.

En el modo de luz transmitida, compruebe que los parásitos se muevan. En el modo de fluorescencia, use el filtro de pies para evaluar el etiquetado de parásitos. En primer lugar, cargue la aguja de vidrio sellada con 10 microlitros de la solución que contiene los parásitos utilizando la punta de una pipeta de microcargador.

A continuación, inserte la aguja de vidrio en el portaagujas del micromanipulador. Debajo del estereoscopio, corte aproximadamente cinco milímetros de la punta de la aguja con pinzas finas. A continuación, anestesia la larva 48 horas después de la fertilización en una solución de Tricaine hasta que no responda al tacto.

Coloque la larva en la placa de agarosa en posición lateral debajo del estereoscopio. Ajuste el micromanipulador de modo que la punta de la aguja quede en el centro de la yema de la larva. Establezca los parámetros del microinyector.

Inyectar el pescado en el valle de circulación sanguínea de la yema. Verifique que el corazón esté latiendo y transfiera la larva al agua fresca de los huevos inmediatamente para su recuperación. Transfiera el embrión inyectado a una placa de Petri vacía y retire con cuidado el agua circundante con una pipeta de plástico y papel absorbente.

Agregue inmediatamente aproximadamente 100 microlitros de agarosa precalentada al 1% de bajo punto de fusión para cubrir el embrión. Asegúrese de que la agarosa no supere los 40 grados centígrados. Inserte un alambre recto dentro de un capilar de vidrio y utilícelo como émbolo para recoger el embrión en posición vertical.

Esto debe hacerse rápidamente antes de que la agarosa se solidifique. Mientras absorbes la agarosa, asegúrate de dejar un poco de agarosa por encima del embrión y espera hasta que se solidifique. Si es necesario, empuje el exceso de agarosa por debajo del embrión y córtelo.

Llene la cámara de muestras con solución de tricaína y ajuste la temperatura de la cámara de muestras a 28 grados centígrados. A continuación, inserte el capilar que contiene el embrión en el portamuestras del microscopio y colóquelo en la etapa del micromanipulador. Empuja hacia afuera el extremo que contiene el embrión hasta que quede libre.

En el modo de luz transmitida, coloque la muestra frente a la pupila del objetivo de detección utilizando un sistema de micromanipulación XYZ y una etapa de rotación para girarla alrededor del eje vertical. Es útil enfocar primero un borde del capilar, luego moverse para encontrar el embrión y las estructuras de interés, como el corazón o la vasculatura. Ahora, utilizando un láser de longitud de onda de 488 nanómetros o similar, cambie al modo fluorescente y ajuste la intensidad de la iluminación, así como el tiempo de exposición, para disminuir el fotoblanqueo y optimizar la resolución del tiempo.

Para ello, se debe elegir un objetivo con una buena apertura numérica. Inicie la adquisición de vídeo de la región de interés. En nuestro caso, se observa que los parásitos están adheridos a las válvulas y se mueven libremente por la zona del corazón.

Se recomienda tomar un video de un solo avión a lo largo del tiempo o usar el micromanipulador o el sistema piezoeléctrico y galvo para enfocar diferentes planos y seguir el movimiento del parásito. Una vez completada la adquisición, extraiga el embrión con cuidado de la agarosa con pinzas finas y una herramienta de bucle para el cabello. Transfiera el pescado nuevamente al agua de huevo fresca y verifique la recuperación durante 15 minutos.

A continuación, deséchelo de acuerdo con los protocolos estándar de su institución. Para todos los procedimientos aquí presentados, se utilizaron embriones 48 horas después de la fertilización. Se podrían utilizar diferentes sitios anatómicos para inocular el parásito, sin embargo, el valle de circulación sanguínea del saco vitelino o conducto de Cuvier es la región más rápida y fácil de inyectar y acceder al sistema cardiovascular.

Dentro de los ocho a 10 minutos posteriores a la inyección de Trypanosoma cruzi en el conducto de Cuvier, se observan los parásitos en el sistema cardiovascular en desarrollo. Algunos parásitos permanecen adheridos a las paredes del saco vitelino embrionario o a estructuras cardíacas como la válvula auriculoventricular. Los parásitos se ven oscilando con contracciones cardíacas, lo que demuestra su mecanismo de adherencia efectivo.

Además, se observa que los parásitos se desplazan con el flujo sanguíneo en la misma dirección que los eritrocitos en el espacio pericárdico y en los vasos sanguíneos. El método que desarrollamos permite la observación in vivo de parásitos T. cruzi dentro de larvas transparentes de pez cebra. Esto puede ser muy útil para visualizar y analizar la dinámica de un patógeno, como la motilidad a través de la sangre y las estructuras cardíacas en un organismo vertebrado vivo.

Es importante que el tiempo entre la inyección y la visualización sea corto para poder ver el parásito que nada libremente. También es crucial optimizar los parámetros de adquisición mientras se utiliza el microscopio de lámina de luz para reducir el daño fotográfico y seguir obteniendo imágenes de buena calidad. La microinyección de T. cruzi en larvas de pez cebra es una técnica eficaz para inocular el parásito en el torrente sanguíneo.

En este método, se vio el marcaje con CFC del parásito como un procedimiento práctico que permite una visualización clara del parásito dentro del pez. La inyección en el conducto de Cuvier es una forma suave de asegurar que los parásitos pasen por la circulación. El T. cruzi tiende a adherirse a las válvulas del corazón y a los grandes vasos de los peces.

Pero según nuestros experimentos, no hay infección celular. Son necesarios más estudios para dilucidar su tro-pez-ee.