Name: Establecimiento de pez cebra Larval como modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidad En Vivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 21 s
Description: Aprenda a establecer larvas de pez cebra como modelo in vivo para estudiar la motilidad de Trypanosoma cruzi mediante microscopía de hoja de luz. Este protocolo permite visualizar parásitos fluorescentes en tiempo real.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue financiado por la Convocatoria Interfacultades de la Vicerrectoría de Investigaciones de la Universidad de los Andesy el programa de USAID investigación y beca de innovación. Agradecemos a Juan Rafael Buitrago y Yeferzon Ardila de pescados mantenimiento y asistencia.

los siguientes protocolos fueron aprobados por el cuidado institucional de animales y uso Comité de Los Andes Universidad (CICUAL). Nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) directrices deben seguirse estrictamente para evitar la contaminación con el patógeno T. cruzi.
 Nota: mantenimiento y cuidado de los animales: pez cebra Casper, una cepa genéticamente modificada de pez cebra (Danio rerio) se utiliza en el presente Protocolo debido a su transparencia óptica valiosa en todas las etapas del desarrollo. Peces son manipulados con atención óptima condiciones para la especie 14, en un 14 h luz-10 h oscuro ciclo a 28 ± 1 ° C, en un pH (7.0-7.4) controladas múltiples tanque recirculación agua sistema. Animales son alimentados dos veces al día con vivo Artemia (Artemia salina) y enriquecidos con alimento de cría. Todos los protocolos fueron aprobados por CICUAL en Universidad de los Andes (C.FUA_14-017).
 1. preparación de huevo agua <ol><li>preparar sal de acuario de 0.6 g/L en inversa ósmosis o agua desionizada (DI) y añadir azul de metileno 0,01 mg/L a la solución. 
	Nota: La conductividad medida debe ser de 400-500 μS/cm y pH nivel en 7.2-7.9. Para bajar el pH, airear el agua del huevo durante unas horas.</li>
</ol> 2. Preparación de solución madre de Metanosulfonato <ol><li>preparar 0,4% tricaine solución madre disolviendo 400 mg Metanosulfonato (MS-222), en 97,9 mL de agua destilada (ddH 2 O). Después de que el polvo se ha disuelto completamente, ajustar el pH a 7.0 con 2,1 mL 1M Tris (pH 9.0) y refrigere la solución.</li>
</ol> 3. Preparación de 1.0% agarosa de bajo punto de fusión <ol><li>disolver el polvo de agarosa de punto de fusión bajo en huevo agua a una concentración final de 1.0%. Calienta la mezcla en el microondas o en un plato caliente con agitación continua hasta que la solución de agarosa aparece homogénea.</li>
	<li>Almacenar las alícuotas a 4 º C durante no más de una semana.</li>
</ol> 4. Ensayo y la colección embrionaria de apareamiento <ol><li>tres días antes de las inyecciones de establece acoplamientos con parejas sanas de peces machos y hembras en los tanques de cría. Enriquecimiento con canicas de vidrio y plantas artificiales mejora de desove. Apareamientos deben ser durante la tarde y noche.</li>
	<li>a la mañana siguiente, recoger los huevos enraícen por drenar el tanque a través de un colador y lavar los huevos con el agua del huevo. Eliminar todos los huevos por invertir el colador y verter agua huevo a través del tamiz en una placa Petri. Para mantener los embriones sanos, su agua limpia quitando cualquier suciedad y embriones muertos con una pipeta plástica.</li>
	<li>Transferencia de los embriones en una incubadora a una temperatura estable de 28,5 ° C para permitir el desarrollo de los embriones según el pez cebra provisional normas 15. Examinar los embriones dos veces al día y descartar huevos inviable para mantener saludable el embrague.</li>
</ol> 5. Embrión Dechorionation Nota: este procedimiento es necesario si los embriones no han incubado en el momento de la inyección. En este procedimiento, &#34; las larvas &#34; son animales fuera de su corion desde 48 h post fertilización (hpf) adelante.
<ol><li>En el día del experimento, colocar la placa Petri que contiene los embriones sanos bajo un estereoscopio disección.</li>
	<li>Tome extremos opuestos del corión con dos pinzas afiladas (Dumont #5), y suavemente rasgar y tirar abren el corion. Son imágenes de unos 5-6 larvas se inyectan a la vez y por lo general 3-4.</li>
	<li>Quitar las chorions de agua usando una pipeta de transferencia.</li>
</ol> 6. Preparación de Material de inyección <ol><li>preparar 1.0 mm agujas con Capillares de vidrio de paredes delgadas y un dispositivo de tirador de la micropipeta con la siguiente configuración: 2 pesos ligeros 1 peso pesado, tirón superior 2 mm + 5 mm fondo pull, 75,9 ° C (paso 1) + () de 78,2 ° C Paso 2). Almacenar las agujas en un plato de Petri en una tira de plastilina. La aguja ideal debe tener una punta estrecha, como T. cruzi medir aproximadamente 20 x 1-3 μm y pasar fácilmente a través de la aguja. Puede variar la longitud de la punta: una punta más larga es útil para llegar a estructuras más profundas, pero una extremidad más corta será más rígida, facilitando la inyección para el usuario. 
	Nota: El tamaño de la punta de la aguja depende de la temperatura: una temperatura elevada para el paso 2 resulta en una punta más fina y más.</li>
	<li>Preparar una solución de agarosa al 1,5% en ddH 2 O y viértalo en un plato de Petri de 10 cm. Cubrir una profundidad de aproximadamente 1,0 cm.</li>
	<li>Colocar un molde prefabricado microinyección sobre la agarosa y déjelo solidificar.</li>
	<li>Levantar el molde prefabricado microinyección hacia fuera y añadir agua de huevo para el almacenamiento a 4 ° C. Esto evita que la agarosa se sequen.</li>
	<li>Huevo de agregar agua a la solución a una concentración final de 150 mg/L. tienda 4 Metanosulfonato ° C.</li>
</ol> 7. Cultivo de células para el crecimiento del parásito <ol><li>parásitos se mantienen en una línea celular de astrocitoma humano (CRL-1718) usando el método descrito por Vargas Zambrano et al. 16</li> <li>iniciar el cultivo de células humanas en un frascos de cultivo T25 (superficie = 25 cm 2) con una densidad de 2 x 10 5 o 4 x 10 5 células en 4 mL de Medio RPMI-1640 con 10% de suero fetal de ternero (FCS), complementado con 2 mM L-glutamina, 4,5 g/L glucosa, 10 mM HEPES, piruvato de 1 mM y 1% de penicilina-estreptomicina (referido como &#34; completar los medios de comunicación &#34;). Incubar los cultivos de astrocitoma a 37 ° C en un 5% CO 2 ambiente.</li>
	<li>Una vez una monocapa confluente, separar las células con 2 mL de 0,25% de tripsina-EDTA por incubar 3 min a 37 ° C. visualmente Verifique las células para la separación y bloquear la solución de tripsina usando 3 mL de RPMI-1640 con 10% FCS en un tubo de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugar la suspensión celular por 5 min a 1.350 x g.</li>
	<li>Lavar el pellet celular resultante en medio DMEM en un tubo de 15 mL y centrifugar durante 5 min a 1.350 x g a 22 ° C.</li>
	<li>Contar las células manualmente en una cámara de Neubauer y Compruebe la viabilidad en un microscopio óptico a 40 aumentos.</li>
	<li>Resuspendió suavemente el celular pellets en 4 mL de medio completo y utilizarlo para crear nuevos cultivos celulares utilizando 2 x 10 5 células cada frasco de cultivo T25.</li>
</ol> 8. T. cruzi cultura y etiquetado <ol><li>parásitos son una cepa originalmente obtenido de un humano infectado y caracterizado como cepa de T. cruzi DA (MHOM/CO/01/DA), genotipo TcI unidad discreta de tipificación (DTU) 16. Después de 3 o 4 días de cultivo, recoger los parásitos móviles en el sobrenadante de cultivo celular humano astrocytoma y centrifugar durante 5 min a 1.350 x g. descartar el medio. 
	Nota: Los parásitos en el medio completo pueden utilizarse para volver a la cultura en una proporción 1:1 con las células de astrocitoma en frascos de cultivo T25.</li>
	<li>Suavemente vuelva a suspender el sedimento en 10 mL estéril 1 x de Buffer de fosfato salino (PBS) con 0.1% de FCS y centrifugar durante 5 min a 1.350 x g.</li>
	<li>Eliminar el sobrenadante y resuspender en 1 mL de PBS. Tomar 10 μL para contar los parásitos nadan libremente en una cámara de Neubauer.</li>
	<li>El resto de los parásitos suspendidos de nuevo (990 μL) y añadir 1 μl de Carboxyfluorescein Diacetato de SuccinimiDYL éster (CFSE), concentración final 5.0 μm. Incubar 10 min a temperatura ambiente. 
	Nota: CFSE 5 mm debe ser alícuotas y mantenidos a -20 ° C.</li>
	<li>De la pelotilla de los parásitos (1.350 x g, 5 min). Reconstituir la pelotilla del parásito por sacudiendo el tubo y lávela en 10 mL de 1 x PBS-0.1% FCS seguidos de un exprimido posterior (1.350 x g, 5 min).</li>
	<li>Eliminar el sobrenadante y suavemente volver a suspender el sedimento de parásito etiquetados en 1 X PBS con el volumen adecuado para obtener una concentración final de aproximadamente 10-20 parásitos/nL para inyección.</li>
	<li>Utilizar un pequeño volumen (&#8764; 10 μl, aproximadamente 1 x 10 4 -2 x 10 4 parásitos) de tripomastigotos evaluar viabilidad y etiquetado. Un microscopio invertido de fluorescencia puede utilizarse para la visualización directa de los parásitos. En el modo de luz transmitido, compruebe que los parásitos se mueven. En el modo de fluorescencia, utilice el filtro de isotiocianato de fluoresceína (FITC) para evaluar parásito etiquetado.</li>
</ol> 9. Inyección de larvas de pez cebra <ol><li>carga del parásito <ol><li>tomar 10 μl de parásitos de la resuspensión (100 μL) y cargarlos en las agujas de cristal utilizando una pipeta de microloader de 10 μl.</li>
		<li>Insertar la aguja de vidrio en el soporte de la aguja de las amalgamas dentales, utilizan un soporte magnético y colocar al lado el estereoscopio.</li>
		<li>Pinzas finas usando bajo el estereoscopio, cortar la aguja creando un embotado abierto fin y medir el tamaño de la gota para obtener un volumen de inyección de 1 nL (esto es equivalente a un diámetro de grano de 0.12-0.13 mm cuando se mide en aceite mineral 17). Un Consejo más es preferido para que la aguja puede alcanzar estructuras profundas dentro de los peces sin dañar el tejido. En este protocolo, se utiliza una aguja embotada, pero puede utilizarse una aguja biselada así.</li>
	</ol></li> <li>De montaje <ol><li>anestesiar larvas de 48 hpf con Metanosulfonato de 150 mg/L. Compruebe que no responden al tacto, pero asegúrese de que está latiendo el corazón.</li>
		<li>Colocar las larvas en el molde de agarosa de microinyección en posición lateral.</li>
		<li>Coloque el soporte de la aguja al lado del estereoscopio y ajustar el instrumental quirúrgico para que la punta de la aguja está en el centro del campo de visión. Mueva la caja Petri preparada en pasos de 6.2 a 6.4 para que la yema larval está cerca de la punta de la aguja. Comprobar el estado de la larva para asegurarse de que el corazón latir.</li>
		<li>Establecer los valores microinyectora como sigue: inyección 9,6 libras por pulgada (psi) de presión, mantiene la presión: 20 psi, 100 ms gama de gating; valor período de 1,9 (corresponde a 10,9 ms). El volumen de la inyección debe ser entre 1-3 nL, con aproximadamente 10-20 parásitos/nL.</li>
	</ol></li></ol> 10. Inyección del parásito <ol><li>inyectar el pescado en la parte superior anterior de la yema en el conducto de Cuvier. Este paso debe realizarse para asegurar la supervivencia de animales después de la inyección. Tarda aproximadamente 10 min para inyectar con éxito 5-6 larvas.</li>
	<li>Como control, se inyectan 1-2 larvas con el mismo volumen del vehículo (1 x PBS).</li>
	<li>Transferencia de la larva a agua fresca al huevo inmediatamente.</li>
</ol> 11. LSFM montaje de inyecta larvas <ol><li>transferencia de la larva inyecta con parásitos a un plato de Petri vacío y retire con cuidado el agua circundante con una pipeta de plástico y papel absorbente. Añadir 100 μl de precalentado 1.0% agarosa de punto de fusión bajo (consulte el paso 3 para la preparación de agarosa) para cubrir la larva. Asegurar la agarosa no es más de 40 ° C.</li>
	<li>Insertar un alambre dentro de un capilar de vidrio de 1.0 mm y usarlo como un émbolo para aspirar la larva en posición vertical. Asegúrese de dejar una pequeña cantidad de agarosa sobre la larva. Espere hasta que la agarosa se solidifique antes de exponer la larva (esto requerirá unos minutos). Si es necesario, empuje hacia fuera de agarosa sobrante por debajo de la larva y córtelo apagado</li>
	<li>Coloque el capilar en el portamuestras de microscopio y empuje hacia afuera el extremo que contiene la larva hasta que cuelga libre de los capilares. La cámara de muestra deberá ser rellenada con solución de Metanosulfonato (150 mg/L) y la temperatura de 28 ° C.</li>
	<li>Coloque la larva delante de la pupila del objetivo de detección utilizando un micromanipulador XYZ sistema. Rotaciones sobre el eje vertical, usar de escenario una rotación. Posicionamiento de la larva debe hacerse en el modo de luz transmitido para identificar claramente las estructuras larvales.</li>
</ol> 12. LSFM proyección de imagen de la inyección de parásitos modo de <ol><li>cambio de fluorescencia y ajustar la intensidad de iluminación, así como el tiempo de exposición para disminuir fotodaño y optimizar tiempo resolución. Para estos experimentos particulares, utiliza una potencia de 2.8-3.0 mW para la muestra y expone cada fotograma para 200 ms usando una cámara con 6,45 μm píxeles y eficiencia cuántica de ~ 70% en las longitudes de onda de detección. Esta configuración debe dar lugar a imágenes adecuadamente expuestos en unos 5 cuadros/s. Asegúrese de que utilizar un objetivo con la mayor apertura numérica posible.</li>
	<li>Iniciar una adquisición video de la región de interés (ROI). En nuestro caso, se observan parásitos adheridos a válvulas y libremente móvil en el área del corazón. Se recomienda tomar un video de un solo plano con el tiempo, o para utilizar el sistema de instrumental quirúrgico o piezo galvo enfocar diferentes planos mientras se mueve el parásito. 
	Nota: Este procedimiento es útil para los tiempos de adquisición cortos de hasta 2 h. Para la adquisición a largo plazo, las larvas deben montarse utilizando métodos alternativos 20.</li>
</ol> 13. Tratamiento y análisis de datos adquiridos de imágenes Nota: tratamiento de la imagen fue realizada en un ordenador personal con un procesador GHz 2,90 8,00 GB de memoria y una tarjeta de video con 1,00 GB de memoria.
Conjunto de datos de <ol><li>abierta la adquirida en el software de la opción de procesamiento de imágenes. El open software FiJi recomienda LSFM procesamiento de datos y análisis 21.</li>
	<li>En el software de análisis de imagen, ajustar niveles de brillo y contraste para mejorar las imágenes. 
	Nota: No hay parámetros fijos son usados en este caso pero seleccionando la &#34; Auto &#34; opción puede ser útil para obtener una mejora inicial.</li>
	<li>Seleccione el retorno de la inversión. 
	Nota: Para el seguimiento de los parásitos, FiJi tiene tanto seguimiento manual y automática de plugins disponibles.</li>
</ol> 14. Recuperación de larvas imágenes <ol><li>quitar la larva cuidadosamente de la agarosa usando Pinzas finas y una herramienta de lazo de pelo. Transferir el pescado a huevo fresco agua y comprobación para la recuperación después de 15 minutos volver a la larva a incubadora a 28 ± 0,5 ° C.</li>
	<li>Alternativamente, proceder a la eutanasia las larvas reflejadas con una sobredosis de Metanosulfonato. A continuación, introducir las larvas en una solución de hipoclorito de sodio (6.15% NaClO) durante 5 minutos matar el parásito. Disponer según la institución &#39; protocolos de s.</li>
</ol>

<ol><li>WHO. Chagas disease (American trypanosomiasis). , 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/">http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/en/</a> (2017).</li>
<li>Bern, C. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMra1410150">Chagas's Disease.</a> New England Journal of Medicine. 373 (5), 456-466 (2015).</li>
<li>Sosa Estani, S., Segura, E. L., Ruiz, A. M., Velazquez, E., Porcel, B. M., Yampotis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+chemotherapy+with+benznidazole+in+children+in+the+indeterminate+phase+of+Chagas%E2%80%99+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+American+Journal+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Efficacy of chemotherapy with benznidazole in children in the indeterminate phase of Chagas’ disease.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 59 (4), 526-529 (1998).</li>
<li>Rosas, F., Roa, N., Cucunuba, Z. M., Cuellar, A., Gonzalez, J. M., Puerta, J. C. Chagasic Cardiomyopathy. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRosas%2C+F+%22Cardiomyopathies+-+From+Basic+Research+to+Clinical+Management%22">Cardiomyopathies - From Basic Research to Clinical Management</a>. , (2012).</li>
<li>Finkelsztein, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altering+the+motility+of+Trypanosoma+cruzi+with+rabbit+polyclonal+anti-peptide+antibodies+reduces+infection+to+susceptible+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Altering the motility of Trypanosoma cruzi with rabbit polyclonal anti-peptide antibodies reduces infection to susceptible mammalian cells.</a> Experimental Parasitology. 150, 36-43 (2015).</li>
<li>Martins, R. M., Covarrubias, C., Rojas, R. G., Silber, A. M., Yoshida, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+L-Proline+and+ATP+Production+by+Trypanosoma+cruzi+Metacyclic+Forms+as+Requirements+for+Host+Cell+Invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Use of L-Proline and ATP Production by Trypanosoma cruzi Metacyclic Forms as Requirements for Host Cell Invasion.</a> Infection and Immunity. 77 (7), 3023-3032 (2009).</li>
<li>Engstler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+Flow-Mediated+Protein+Sorting+on+the+Cell+Surface+of+Trypanosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic Flow-Mediated Protein Sorting on the Cell Surface of Trypanosomes.</a> Cell. 131 (3), 505-515 (2007).</li>
<li>Uppaluri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Microscopic+Motility+on+the+Swimming+Behavior+of+Parasites%3A+Straighter+Trypanosomes+are+More+Directional%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">Impact of Microscopic Motility on the Swimming Behavior of Parasites: Straighter Trypanosomes are More Directional.</a> PLoS Computational Biology. 7 (6), e1002058(2011).</li>
<li>Heddergott, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypanosome+Motion+Represents+an+Adaptation+to+the+Crowded+Environment+of+the+Vertebrate+Bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Trypanosome Motion Represents an Adaptation to the Crowded Environment of the Vertebrate Bloodstream.</a> PLoS Pathogens. 8 (11), e1003023(2012).</li>
<li>Gratacap, R. L., Wheeler, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+zebrafish+for+intravital+study+of+eukaryotic+pathogen%E2%80%93host+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+%26+Comparative+Immunology%22%5BJournal%5D)">Utilization of zebrafish for intravital study of eukaryotic pathogen–host interactions.</a> Developmental & Comparative Immunology. 46 (1), 108-115 (2014).</li>
<li>Meijer, A. H., Spaink, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host-Pathogen+Interactions+Made+Transparent+with+the+Zebrafish+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Drug+Targets%22%5BJournal%5D)">Host-Pathogen Interactions Made Transparent with the Zebrafish Model.</a> Current Drug Targets. 12 (7), 1000-1017 (2011).</li>
<li>White, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transparent+Adult+Zebrafish+as+a+Tool+for+In+Vivo+Transplantation+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Transparent Adult Zebrafish as a Tool for In Vivo Transplantation Analysis.</a> Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).</li>
<li>Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slicing+embryos+gently+with+laser+light+sheets%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Slicing embryos gently with laser light sheets.</a> BioEssays. 34 (5), 406-411 (2012).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+zebrafish+book%3A+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29%22">The zebrafish book: A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio)</a>. , University of Oregon Press. Eugene. 
 <a target="_blank" href="http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html">http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html</a> (2000).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/8589427">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Vargas-Zambrano, J. C., Lasso, P., Cuellar, A., Puerta, C. J., González, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+astrocytoma+cell+line+is+highly+susceptible+to+infection+with+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22Mem%C3%B3rias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">A human astrocytoma cell line is highly susceptible to infection with Trypanosoma cruzi.</a> Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 108 (2), 212-219 (2013).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+%28Journal+of+Visualized+Experiments%29%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> JoVE (Journal of Visualized Experiments). (25), e1115-e1115 (2009).</li>
<li>Lorenzo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+cell+division+dynamics+monitoring+in+3D+large+spheroid+tumor+models+using+light+sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Division%22%5BJournal%5D)">Live cell division dynamics monitoring in 3D large spheroid tumor models using light sheet microscopy.</a> Cell Division. 6, 22(2011).</li>
<li>Edelstein, A. D., Tsuchida, M. A., Amodaj, N., Pinkard, H., Vale, R. D., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+methods+of+microscope+control+using+%CE%BCManager+software%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">Advanced methods of microscope control using μManager software.</a> Journal of Biological Methods. 1 (2), e10(2014).</li>
<li>Weber, M., Mickoleit, M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multilayer+Mounting+for+Long-term+Light+Sheet+Microscopy+of+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. (84), (2014).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Ng, A. N. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+the+digestive+system+in+zebrafish%3A+III.+Intestinal+epithelium+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Formation of the digestive system in zebrafish: III. Intestinal epithelium morphogenesis.</a> Developmental Biology. 286 (1), 114-135 (2005).</li>
<li>Higuchi, M. D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+between+Trypanosoma+cruzi+parasitism+and+myocardial+inflammatory+infiltrate+in+human+chronic+chagasic+myocarditis%3A+Light+microscopy+and+immunohistochemical+findings%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%3A+The+Official+Journal+of+the+Society+for+Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Correlation between Trypanosoma cruzi parasitism and myocardial inflammatory infiltrate in human chronic chagasic myocarditis: Light microscopy and immunohistochemical findings.</a> Cardiovascular Pathology: The Official Journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 2 (2), 101-106 (1993).</li>
<li>Vago, A. R., Silva, D. M., Adad, S. J., Correa-Oliveira, R., d'Avila Reis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+Chagas+disease%3A+presence+of+parasite+DNA+in+the+oesophagus+of+patients+without+megaoesophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Transactions+of+the+Royal+Society+of+Tropical+Medicine+and+Hygiene%22%5BJournal%5D)">Chronic Chagas disease: presence of parasite DNA in the oesophagus of patients without megaoesophagus.</a> Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 97 (3), 308-309 (2003).</li>
<li>Wiegertjes, G. F., Forlenza, M., Joerink, M., Scharsack, J. P. <a target="_blank" href="https://insights.ovid.com/developmental-comparative-immunology/devcmi/2005/09/000/parasite-infections-revisited/1/00114477">Parasite infections revisited.</a> Developmental & Comparative Immunology. 29 (9), 749-758 (2005).</li>
<li>De Souza, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+cell+biology+of+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Pharmaceutical+Design%22%5BJournal%5D)">Basic cell biology of Trypanosoma cruzi.</a> Current Pharmaceutical Design. 8 (4), 269-285 (2002).</li>
<li>Langousis, G., Hill, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motility+and+more%3A+the+flagellum+of+Trypanosoma+brucei%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Motility and more: the flagellum of Trypanosoma brucei.</a> Nature Reviews. Microbiology. 12 (7), 505-518 (2014).</li>
<li>Johnson, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+response+to+Trypanosoma+cruzi+infection+induces+secretion+of+defensin+%CE%B1-1%2C+which+damages+the+flagellum%2C+neutralizes+trypanosome+motility%2C+and+inhibits+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Cellular response to Trypanosoma cruzi infection induces secretion of defensin α-1, which damages the flagellum, neutralizes trypanosome motility, and inhibits infection.</a> Infection and Immunity. 81 (11), 4139-4148 (2013).</li>
<li>Magalhães, L. M. D., Viana, A., Chiari, E., Galvão, L. M. C., Gollob, K. J., Dutra, W. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+Activation+of+Human+Monocytes+and+Lymphocytes+by+Distinct+Strains+of+Trypanosoma+cruzi%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+neglected+tropical+diseases%22%5BJournal%5D)">Differential Activation of Human Monocytes and Lymphocytes by Distinct Strains of Trypanosoma cruzi.</a> PLoS neglected tropical diseases. 9 (7), e0003816(2015).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este estudio destaca las ventajas del pez cebra como modelo animal para estudiar comportamiento patógeno en vivo. En particular, este estudio propone un método para visualizar el patógeno T. cruzi en su entorno natural: circulación hemática. El ambiente del microambiente circulatorio en peces es comparable a la de los mamíferos, y trypanosomátidos han evolucionado mecanismos para viajar, evadiendo el sistema inmunitario y a las células para la infección en ese medio ambiente25. Este protocolo ofrece una descripción de un procedimiento óptimo para el cultivo de T. cruzi en una línea celular humana y posterior aislamiento de formas flagelares de etiquetado fluorescente. A continuación se muestra la configuración adecuada para inyección acertada de los parásitos en pez cebra transparente para más adelante montaje y visualización utilizando LSFM. Finalmente, este protocolo ofrece sugerencias para la eficiente y eficaz en vivo imagen de parásito ubicación y movimiento en la circulación mediante LSFM.
El flagelo de tripanosomas surge de su región posterior, que fluye desde el cuerpo celular, y cuelga gratis en la parte anterior del organismo26. T. cruzi se propulsa moviendo el flagelo por delante del cuerpo, que ondula todo el cuerpo del parásito. Movimiento flagelar no sólo es indispensable para la motilidad del parásito, como en el caso de T. brucei27 (el agente causal de la tripanosomiasis africana), pero también se utiliza para la infección celular, como se ha demostrado en T. cruzi5 ,28. Aunque pez cebra no son el huésped natural de T. cruzi, la motilidad del parásito puede estudiarse en un sistema de circulación cardiovascular en desarrollo utilizando los protocolos descritos aquí. Además, hay especies de tripanosomas que infectan a los ciprínidos, la clase de pez cebra, como T. carassii y T. borreli25. Estas especies podrían ser utilizadas para estudiar en tiempo real los movimientos y mecanismos de enganche de estas trypanosomátidos; este tipo de estudios puede prestar la penetración en el proceso de infección de células de mamífero.
En este estudio, se inyecta móviles T. cruzi parásitos fueron observadas viajando a través de la circulación cardiovascular de peces inoculados, moviéndose junto con eritrocitos opacos y adherirse a las estructuras de las paredes del sistema cardiovascular. Utilizamos un LSFM casa construida con un 10 X acromático distancia de funcionamiento larga objetivo de aire (17,6 mm) para el brazo de iluminación con una apertura numérica de 0.25. 40 X objetivo de inmersión de agua apocromática con una apertura numérica de 0,8 y una distancia de trabajo de 3,5 mm se utilizó para el brazo de detección. El objetivo de detección se sumergió en la cámara de la muestra, mientras que el objetivo de la iluminación estaba fuera de la cámara. Un puerto en la cámara de sellado con un cubreobjetos y pegamento óptico permitida para que la viga de la iluminación entrar en la cámara, como se muestra en Lorenzo et al. 18 para la iluminación, utiliza un laser DPSS 50 mW en 488 nm, cuyo poder fue modulada por un filtro óptico sintonizable de acusto. La trayectoria de detección utiliza filtros compatibles con proteína fluorescente verde (GFP) o FITC. Un microscopio de ficha técnica de iluminación, equipado con un soporte de muestra capilar (idealmente con rotación automática) y control de la temperatura de la cámara de muestra debe ser adecuado para esta aplicación. El microscopio debe ser alineado y calibrado según las instrucciones del fabricante o los protocolos estándar de laboratorio del usuario antes de adquisición, si es necesario. En este protocolo, hemos controlado el microscopio utilizando el software SPIM19.
Es importante tener en cuenta que en la circulación del pez cebra, accesorio parásitas de larvas es eficaz. En el sentido cardinal, parásitos permanecieron Unidos por hasta varios minutos; en el corazón, sostuvieron a las válvulas y las paredes, oscilante con las contracciones del corazón. Otros estudios siguen con el fin de dilucidar si T. cruzi interactúa con los eritrocitos que fluyen que deriva en la dirección del flujo de sangre. Anteriores estudios en vitro han demostrado que la presencia de estructuras sólidas (es decir, células de la sangre), o mayor viscosidad del líquido para simular sangre en vitro, tiene un efecto significativo en la motilidad y la velocidad del parásito 9.
Hay muchas preguntas sobre el curso de la infección de T. cruzi en humanos después de amastigotes que escape células fagocitarias, la célula inicialmente infectada tipo29. ¿Por ejemplo, cómo llegan a sus órganos blanco? ¿Cuáles son los mecanismos para el tropismo de los órganos preferidos, como cardíaco, digestivo y sistema nervioso central? Curiosamente, en este estudio los parásitos fueron inicialmente reflejados en el corazón porque es el sitio de mayor densidad de parásitos. Sin embargo, la señal de la CFSE acumulada posteriormente en el intestino en desarrollo por 7 días después de la inyección. Aunque la anatomía de los peces y mamíferos es diferente, los resultados de este estudio demuestran una forma de tropismo, como se observó que los parásitos exhiben tropismo hacia órganos conocidos recomendado: a pesar de la diferencias. Una limitación importante de este estudio refiere a la temperatura utilizada en los experimentos. Larvas de pez cebra deben mantenerse alrededor de 28 °C durante todo el procedimiento. Aunque esta temperatura sea similar al host de vectores (insectos de la subfamilia Triatominae), es bastante diferente de los mamíferos de sangre caliente que son los hospederos finales (alrededor de 37 ° C). T. cruzi es conocido por tener formas vivas flagelar en ambos ejércitos; sin embargo, es importante tener en cuenta que este factor podría tener un efecto en el comportamiento de los animales en vivo.
Aunque el sistema inmune adaptativo fish´s no madurito hasta 4 semanas post fecundación, el sistema inmunitario innato está activo en desarrollo10. Tan pronto como hpf de 48 o 96, células fagocíticas se observaron después de haber engullido etiquetado tripanosomas (datos no mostrados). Esto limita la ventana de tiempo para la visualización del parásito. Sin embargo, si un estudio tiene que centrarse en evaluar la respuesta inmune de fish´s, se puede recomendar la inyección en etapas posteriores. Además, la inyección de parásitos en las líneas de peces transgénicos con macrófagos marcados o de otras células del sistema inmune pueden ser útiles en el estudio de fijación del parásito y los mecanismos de endocitosis posible. Es importante tener en cuenta que si los parásitos están marcados con CFSE, etiquetas de transgénicos de la célula no deben ser GFP, y un marcador al final del espectro de color amarillo o rojo.
Para evaluar la dirección detallada del movimiento de parásito, puede ser útil seguir su trayectoria en 3 dimensiones (3D). Para la visualización 3D y reconstrucción del proceso, es necesario un sistema de alta velocidad. Con el equipo utilizado en el presente Protocolo, sólo es posible visualizar los parásitos en un plano. En este caso, priorizamos mantener la estabilidad del plano focal durante el movimiento del parásito y registro de su trayectoria en un plano.
La metodología propuesta aquí allana el camino para investigar comportamiento del parásito en circulación cardiovascular. En Resumen, los pasos esenciales para parásitos vivos fluorescentes dentro de larvas de pez cebra de la proyección de imagen son:(i) uso de embriones nacidos tempranos (24-48 hpf) o larvas o animales entre 72-96 hpf con ninguna pigmentación para que sean transparentes y fáciles de inyectar; (ii) las larvas imagen tan pronto como sea posible después de la inyección para evitar la eliminación del parásito a las células fagocíticas; y (iii) enfoque LSFM en el sitio de interés (por ejemplo, región pericárdica) y mantener el enfoque. Este novedoso procedimiento permite la visualización de los tripomastigotos en un ambiente comparable a su nicho natural de la infección, proporcionando por primera vez la posibilidad de estudio de T. cruzi en un organismo vivo.

La enfermedad de Chagas es causada por el parásito protozoo cruzi del T.. Aproximadamente de 6 a 7 millones de personas en todo el mundo están infectadas con T. cruzi. La enfermedad se transmite principalmente en América Latina, pero se ha divulgado en los Estados Unidos, Canadá y muchos Europeo así como algunos países del Pacífico occidental, principalmente debido a la migración de personas infectadas1. Chagas es en gran parte transmitidas por vectores y transmisión a los seres humanos por contacto con heces de insectos hematophagic en la subfamilia Triatominae, conocido comúnmente como "vinchucas". Sin embargo, T. cruzi también puede transmitirse mediante transfusiones de sangre, transferencia vertical de madre a hijo, o la ingestión de alimentos contaminados con parásitos2. La fase aguda de la infección es principalmente asintomático o sintomático constitutivamente y dura de 6 a 8 semanas, después de que compromiso del sistema inmune controla la carga del parásito, pero no eliminar completamente la infección3. Mayoría de las personas entonces entrar en una fase crónica asintomática; sin embargo, casi 30% de los pacientes desarrollan una fase crónica sintomática, en el cual el sistema cardiaco y con menos frecuencia el digestivo y sistema nervioso están comprometido4. Este escenario presenta un reto para el control y tratamiento de la enfermedad ya que hay no hay vacunas disponibles, existen sólo dos medicamentos eficaces para Chagas: benznidazol y nifurtimox. Ambos tratamientos requieren la administración prolongada y pueden tener graves efectos secundarios2.
Mayor comprensión del comportamiento de T. cruzi comportamiento en vivo es clave para determinar la migración parasitaria, accesorio de celular e invasión en el anfitrión; la falta de modelos en vivo limita el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos. Estudios in vitro de infección por T. cruzi han demostrado que la motilidad de tripomastigotos es importante por la Unión a membranas de la célula huésped y la posterior invasión celular5. Agotamiento de la energía en tripomastigotos en co-cultivo con una línea celular susceptible se ha demostrado para reducir la invasión celular6. Curiosamente, en trypanosomátidos, movimiento flagelar también se ha caracterizado como un mecanismo de evasión contra anticuerpos específicos del parásito7.
La motilidad flagelar ha sido extensivamente estudiado en vitro en Trypanosoma brucei, un parásito relacionado que causa la tripanosomiasis africana8. In vitro los estudios de la motilidad de estos tripanosomas demostraron que la simulación de las condiciones de la sangre o fluidos corporales, incluyendo la viscosidad y la presencia de obstáculos representativos de células sanguíneas, es importante para el movimiento hacia adelante del parásito9 . Como todavía no ha sido posible visualizar el movimiento de los parásitos en el torrente sanguíneo en vivo.
Las larvas de pez cebra son un poderoso modelo para el estudio de las interacciones huésped-patógeno en vivo. Son pequeños, baratos y relativamente fáciles de criar en comparación con otros modelos vertebrados establecidos para enfermedad de Chagas. Pez cebra tienen sistemas inmunitarios innatos y adaptativos similares a los seres humanos, pero su sistema inmune adaptativo comienza a desarrollarse en 4 días post fecundación (dpf) y no es maduro para otras varias semanas10. Durante el desarrollo temprano, cuando sólo los macrófagos están presentes, hay una gran ventana para el estudio de comportamiento del parásito sin interferencia inmune inmediata10. Sin embargo, la mayor ventaja de utilizar larvas de pez cebra como modelo para estudiar el comportamiento patógeno vertebrado radica en su transparencia óptica, lo que los hace susceptibles para la investigación microscópica y proyección de imagen11. Además, existen múltiples herramientas para manipular la genética de peces. Por ejemplo, la cepa de Casper es una línea mutante de pez cebra con ninguna pigmentación, haciendo el animal totalmente transparente y útil para la visualización de los órganos individuales y para seguimiento en tiempo real de las células inyectadas12.
Una limitación clave de observación longitudinal de movimiento rápidamente parásitos en peces cebra vivo usando confocal o microscopía de epifluorescencia se encuentra en la imposibilidad de adquisición alta velocidad y profundidades de penetración grande con buena calidad de imagen y baja la proyección de imagen riesgo de fotoenvejecimiento. Ficha técnica de iluminación de la fluorescencia micsroscopy (LSFM) es una técnica emergente que supera estas limitaciones para permitir estas observaciones. Mediante el uso de uno de los objetivos para detectar la fluorescencia y un segundo objetivo de iluminación ortogonal que sólo se ilumina el plano focal del objetivo de detección, es posible obtener secciones ópticas de alta resolución en un microscopio confocal, pero con significativamente reducida fotodaño, incluso con respecto a la microscopía de epifluorescencia13. La técnica LSFM usada aquí se llama solo plano iluminación microscopia (SPIM), en el cual una hoja fina de la luz enciende un solo plano dentro de las larvas de pez cebra.
El objetivo de esta metodología es establecer larval pez cebra como modelo de infección no viable para la comprensión de la movilidad de T. cruzi y comportamiento relacionados con en vivo. Para lograr esto, se inyectaron larvas de pez cebra transparente con etiqueta fluorescente tripomastigotos, la forma celular responsable de la infección de seres humanos y se identificaron el movimiento de T. cruzi en la circulación cardiovascular del pez cebra utilizando LSFM.

<table><tbody><tr><td>0.5-10 &mu; L Micropipeta</td><td>Fisherbrand</td><td>21-377-815</td><td></td></tr><tr><td>Agarosa RA</td><td>Amresco</td><td>N605</td><td></td></tr><tr><td>Regular Agarosa SFR</td><td>Amresco</td><td>J234</td><td>Bajo punto de fusión</td></tr><tr><td>Sal de acuario Instant</td><td>ocean</td><td>SS15-10</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuento de células</td><td>Boeco</td><td>Neubauer&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Matraces de cultivo celular</td><td>Centrífuga 430639</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Corning Sorvall</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>ThermoFisher</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Objetivo de detección</td><td>Nikon 40x 0.8NA&nbsp;</td><td>40x CFI APO NIR</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medio</td> Pinzas finas <td>Sigma-Aldrich</td><td>D5648</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5</td><td>World precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato (Tricaína)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal para terneros (FCS)</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF00-01</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>Chroma</td><td>ET-525/50M</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio para el montaje de embriones</td><td>Vitrez Medical</td><td>160215</td><td></td></tr><tr><td>Capilares de vidrio para extraer agujas World</td><td>precision instruments</td><td>TW100-4</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Gibco</td><td>A2494001</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>156300-80</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Thermo Corporation</td><td>Revco</td><td></td></tr><tr><td>Molde de microinyección para larvas</td><td>Herramientas de ciencia adaptativa</td><td>I-34</td><td></td></tr><tr><td>Cristalizador</td><td>láser</td><td>DL488-050</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Gibco</td><td>250300-81</td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Albor Qu&iacute; micos</td><td>12223</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>MN-153</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de micromanipulador</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-200</td><td>para LSFM&nbsp;</td></tr><tr><td>Dispositivo extractor de micropipetas&nbsp;</td><td>Microscopio Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Microscopio</td><td>Olympus CX31</td><td></td></tr><tr><td>(invertido)</td><td>Microscopio</td> multipropósito Olympus <td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>AZ100M</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de recuento Neubauer</td><td>Boeco Alemania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>15140-163</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri 94x16</td><td>Greiner bio-one</td><td>633181</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta pasteur de plástico</td><td>Fisherbrand</td><td>11577722</td><td></td></tr><tr><td>Etapa de rotación</td><td>Newport</td><td>CONEX-PR50CC</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 medio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4130</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Estereoscopio</td><td>Nikon</td><td>C-LEDS</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (MS-222)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>886-86-2</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Amresco</td><td>M151</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>R-001-100</td><td></td></tr><tr><td>Tubos 15 ml</td><td>Corning</td><td>05-527-90</td><td></td></tr></tbody></table>

establecimiento de pez cebra larval como modelo animal para investigar trypanosoma cruzi motilidad en vivo

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

La enfermedad de Chagas es una infección parasitaria causada por Trypanosoma cruzi, cuya movilidad no es sólo importante para la localización, sino también para la Unión celular y la invasión. Actuales modelos animales para el estudio de T. cruzi permitan una observación limitada de parásitos in vivo, que representa un reto para la comprensión de la conducta parásito durante las etapas iniciales de la infección en seres humanos. Este protozoo tiene una etapa flagelar en vectores y huéspedes mamíferos, pero no existen estudios que describen su motilidad en vivo. El objetivo de este proyecto fue establecer un modelo de pez cebra vertebrado vivo para evaluar motilidad de T. cruzi en el sistema vascular. Pez cebra transparente larvas fueron inyectadas con fluorescencia etiquetada tripomastigotos y observado mediante microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación (LSFM), un método no invasivo para visualizar organismos vivos con óptico de alta resolución. Los parásitos podrían visualizarse durante largos períodos de tiempo debido al riesgo relativamente bajo de la técnica de fotodaño en comparación con el confocal o microscopía de epifluorescencia. Parásitos de T. cruzi fueron observados en el sistema circulatorio del pez cebra vivo en vasos de diferentes tamaños y la yema. Podría también verse atado a la pared del saco vitelino y a la válvula aurículo-ventricular a pesar de las fuertes asociados con las contracciones del corazón. LSFM de T. cruzi-larvas de pez cebra inoculado es un método valioso que puede utilizarse para visualizar parásitos de la circulación y evaluar su tropismo, patrones de migración y movilidad en el ambiente dinámico del sistema cardiovascular de un animal vivo.

Condiciones óptimas para la inyección:
Grupos de larvas de pez cebra fueron inyectados a las 24, 48, 72, 96 y 120 hpf, en diferentes sitios anatómicos y su supervivencia fue examinada cada día por 5 días. Después de 5 días post inyección, embriones inyección en 24 hpf tenía 6,25% (2/32) de supervivencia, mientras que el 95% (38/40) de larvas inyectados en 48 hpf sobrevivió. Como control, las larvas fueron inyectadas con 1 x PBS como un vehículo. No hubo diferencias en la supervivencia entre larvas vehículo inyectado e inyectado por el parásito, no indicando efectos parásitos dependientes de la tasa de supervivencia de los peces (p = 0,08). Larvas inyectadas entre 72-120 hpf tuvieron tasas de supervivencia comparables a 48 hpf inyecta larvas en el volumen de inyección constante. Para todos los procedimientos aquí presentados, 48 larvas hpf fueron utilizadas debido a su facilidad de manipulación y habiendo desarrollado órganos y fácilmente penetrable piel sin daño evidente después de la inyección.
Las larvas inyectadas en 48 hpf fueron inyectados en el espacio pericárdico, Cola muscular, ventrículo de cerebelo, vesícula ótica, notocordio y conducto de Cuvier en el saco vitelino. No hubo diferencias en la supervivencia de las larvas que se inyecta en sitios anatómicos diferentes. Sin embargo, la región más fácil y rápida para inyectar era que el conducto de Cuvier situado en la parte anterior del saco vitelino (figura 1, película 1). Inyecciones en ese sitio permitieron la introducción de volúmenes más altos con un menor riesgo de lesión a estructuras vitales. Además, entre 24-72 hpf, esta región es un sitio óptimo para acceder directamente a la vasculatura en desarrollo y corazón11.
Visualización del parásito mediante LSFM:
Dentro de 8-10 min después de la inyección de T. cruzi en el conducto de Cuvier, se identificaron parásitos en larvas de pez cebra con LSFM debido a su señal fluorescente CFSE y la transparencia óptica de las larvas. Después de la inoculación, se observaron parásitos que ya sea adherido a las paredes alrededor del sistema circulatorio o viajando en la dirección del flujo de sangre (figura 2, figura 3). Cuando un parásito permanezca adherido a una estructura cardíaca, tales como la válvula auriculoventricular, oscila con las contracciones del corazón, lo que indica que los mecanismos moleculares de la adherencia de parásitos pueden ser eficaces en nuestro modelo de vertebrados (Movie 2, pelicula 3 Película adicional 1). T. cruzi también se adhirieron a las paredes del saco vitelino larval ( figura 2, Movie 2), una estructura que después será reabsorbida y formar parte de la del intestino del pez cebra22. Esto podría ser similar a lo que sucede durante la fase crónica de la enfermedad en seres humanos infectados, donde los parásitos se encuentran en cardiomiocitos y en el sistema nervioso digestivo23,24. Cuando no, los parásitos se desvió a través del flujo de sangre en la misma dirección que los eritrocitos ( figura 3, película 4). Parásitos se podrían observar en diferentes vasos de tamaño de los peces, pero eran más abundantes en el espacio pericárdico y en la región adyacente de la yema que contiene el flujo de sangre ( figura 2, figura 3, película adicional 2).
En 10 min post inyección, era más difícil punto solas formas del parásito debido a su distribución a lo largo de la vasculatura y una inhabilidad para rápidamente pantalla diferentes sitios anatómicos de los peces debido a un limitado campo de visión de LSFM (con 40 aumentos ). Después de 24 horas post inyección (hpi), la señal de la CFSE comienza a acumularse en la región cerca del intestino en desarrollo (suplementario Figura 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56238/56238fig1.jpg"> 
Figura 1: Sitio de la inyección óptima. (A) imagen de larva 48 hpf mostrando el sitio de inyección óptima en el conducto de Cuvier (flecha amarilla) utilizando un estereoscopio ordinario. Ampliada (B) vista de la caja en la que muestra el conducto de Cuvier (flecha amarilla). Barra de escala = 200 μm (A), 50 μm (B). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/56238fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56238/56238fig2.jpg"> 
Figura 2: Imágenes LSFM de un parásito estático en una larva de hpf 48. El parásito T. cruzi (flecha amarilla) permanece adherido a las paredes del saco vitelino, a lo largo de la secuencia Time-lapse (7.2 s, 17.2 s y 27,2 s), alrededor de ~ 15 minutos después de la inyección del parásito. No hay cambio en la posición del parásito es observado durante un período de adquisición de al menos 30 s. un atrio; v ventrículo. Barra de escala = 50 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/56238fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56238/56238fig3.jpg"> 
Figura 3: Trayectoria de un parásito viajando en el espacio pericárdico mediante LSFM. El parásito T. cruzi se puede realizar un seguimiento mientras la deriva en el espacio pericárdico (PS), siguiendo la dirección del flujo de sangre (pista en rojo) alrededor de ~ 15 minutos después de la inyección del parásito. Barra de escala = 50 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/56238fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/56238/56238mov1.jpg"> 
Película 1: Valle de la circulación de sangre de la yema en una larva 48 hpf. Película de una larva 48 hpf mostrando la sangre circulación valle o conducto de Cuvier utilizando un estereoscopio ordinario. Diferentes regiones se concentran durante el vídeo para mostrar glóbulos rojos circulando a lo largo del conducto. Flecha amarilla muestra el sitio de inyección óptima. Película fue registrada alrededor de 10-15 minutos después de la inyección del parásito. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/Movie_1.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar el video.</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/56238/56238mov2.jpg"> 
Película 2: Parásitos de T. cruzi atado a las paredes de la vesícula vitelina. Película LSFM de proyección larva 48 hpf que parásitos de T. cruzi permanecen adheridas al saco de la yema de huevo unos 10-15 minutos después de la inyección del parásito. Ningún cambio en la posición del parásito fue observada durante un período de adquisición de al menos 30 s. un atrio; v ventrículo. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/Movie_2.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar el video.</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/56238/56238mov3.jpg"> 
Película 3: Los parásitos de T. cruzi atado a las paredes del corazón. Película LSFM de una larva 48 hpf muestra que acercarse de parásitos de T. cruzi n adheridos a la pared cardiovascular, a pesar de las contracciones del corazón fuerte alrededor de 10-15 minutos después de la inyección del parásito. Los eritrocitos se observan como sombras redondeadas negras. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/Movie_3.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar el video.</a>
<img alt="Movie 4" src="/files/ftp_upload/56238/56238mov4.jpg"> 
Movie 4: parásitos moviéndose en el espacio pericardial. Película LSFM un parásitos de T. cruzi de mostrar hpf larva 48 a la deriva en el espacio pericárdico. Dos parásitos pueden encontrarse en diferentes puntos temporales (ID 1, en círculo rojo y ID 2 en círculo amarillo), siguiendo una trayectoria similar. La película fue registrada alrededor de 10-15 minutos después de la inyección del parásito. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/Movie_4.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar el video.</a>
Suplementario Figura 1: señal fluorescente de acumulación de la CFSE en la yema de huevo. Imágenes de estereoscopio de una larva de tipo salvaje inyectado en 48 hpf en el conducto de Cuvier. Señal fluorescente CFSE se acumula progresivamente en la yema, después de dos días post inyección (48 hpi). Barra de escala = 500 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/Supplemental_figure_1.tif" target="_blank">haga clic aquí para descargar la figura.</a>
Suplementario 1 película: parásitos unido a las paredes y válvulas del sistema circulatorio. Imágenes de serie de tiempo de estereoscopio de una larva de tipo salvaje inyectado en 48 hpf. Imágenes son tomadas a intervalos de 0,2 s capturar parásitos de T. cruzi en sincronía con las contracciones del músculo cardiaco en la válvula auriculoventricular. Película se registró unos 30 min después de la inyección del parásito. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/Supplemental_movie_1.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar el video.</a>
Adicional 2 de la película: parásitos móviles y adheridos en la yema y espacio periventricular. Película LSFM de una larva 48 hpf muestra T. cruzi parásitos deriva o adheridos en el espacio pericárdico o la yema de huevo. Una vista de luz transmitida se observó para los primeros 5 s. El punto de vista de la fluorescencia se observó de s 25.8 5.2. La película fue registrada alrededor de 10-15 minutos después de la inyección del parásito. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56238/Supplemental_movie_2.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar el video.</a>

En este protocolo, fluorescencia etiquetada T. cruzi fueron inyectadas en larvas de pez cebra transparente y motilidad del parásito fue observada en vivo usando microscopía de fluorescencia de la ficha técnica de iluminación.

Establecimiento de pez cebra Larval como modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidad En Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

El objetivo general de este procedimiento es establecer al pez cebra como un modelo in vivo para estudiar la motilidad de Trypanosoma cruzi. Trypanosoma cruzi es el parásito que causa la enfermedad de Chagas, una enfermedad tropical desatendida que se transmite principalmente por vectores en América Latina y en algunas regiones de Estados Unidos.El parásito es transmitido al ser humano por las heces del vector, que contienen la parte infecciosa, y luego se replica en las células del huésped. El movimiento de las flagelas permite al parásito desplazarse por el cuerpo. Pero también es esencial para la adhesión durante la invasión celular.Los modelos de infección in vivo con Trypanosoma cruzi se realizan principalmente en roedores. La opacidad del tejido dificulta el seguimiento del parásito dentro del animal. Hasta ahora, la motilidad del parásito solo se ha estudiado in vitro; por lo tanto, un modelo in vivo permitiría comprender aspectos clave del movimiento del parásito bajo condiciones de flujo.Buscando un modelo alternativo, encontramos las larvas de pez cebra. La larva de pez cebra es un modelo potente para estudiar las interacciones entre el huésped y el patógeno in vivo. Son pequeñas, económicas y muy fáciles de criar en comparación con los ratones.Muy importante para nuestro estudio es que su sistema inmunitario es muy similar al de los humanos. Su sistema inmunitario adaptativo no comienza a desarrollarse hasta cuatro días después de la fertilización, y madura hasta cuatro semanas después, lo que nos brinda una ventana muy amplia para trabajar sin la interferencia inmunitaria. Sin embargo, la mayor ventaja del pez cebra para nuestro estudio es su transparencia óptica.Esto lo convierte en un modelo ideal para la detección microscópica y el análisis de imágenes. Esto, en combinación con todas las técnicas disponibles para manipular genéticamente al pez, así como con las líneas transgénicas y mutantes existentes, ofrece muchas posibilidades para su estudio. En este video mostraremos cómo una larva mutante de la línea Casper, que es completamente transparente debido a la ausencia de pigmentación, puede utilizarse para visualizar parásitos de T.cruzi in vivo.Para visualizar el interior de estos peces cebra, utilizamos microscopía de hoja de luz por fluorescencia. La microscopía de hoja de luz por fluorescencia es una familia de técnicas en las que solo se ilumina el plano focal del objetivo de detección. La consecuencia de esto es que no hay luz en el primer plano ni en el fondo, lo que permite obtener imágenes nítidas y definidas, incluso en las regiones más profundas de los embriones.Dado que solo se ilumina la parte de la muestra de interés, se produce mucho menos daño fotónico en la muestra, lo que permite grabar videos durante largos períodos de tiempo. Aquí, visualizamos parásitos vivos de T.cruzi dentro de larvas de pez cebra. La naturaleza de la lámina de luz nos permite obtener videos de alta velocidad con buena resolución espacial y temporal, en comparación con los microscopios confocales.Hasta donde sabemos, nunca se han visualizado tripanosomas vivos dentro de un organismo vivo. Tres días antes de las inyecciones, establezca apareamientos con parejas sanas de peces macho y hembra, o un macho y dos hembras en tanques de cría para aumentar la producción total de huevos. Siguiendo el protocolo descrito, recolecte los huevos desovados utilizando un colador pequeño.Lave los huevos invirtiendo el colador y vertiendo el agua de los huevos a través del colador hacia una placa de Petri. Para mantener los embriones sanos, limpie el agua eliminando cualquier residuo o huevos no fertilizados con una pipeta plástica de transferencia. A continuación, coloque los embriones en un incubador a 28 grados Celsius y repita el procedimiento de limpieza cada tres horas para desechar los huevos no viables y mantener la postura sana.A las 48 horas o dos días posteriores a la fertilización, verifique que la mayoría de los embriones hayan eclosionado. Sin embargo, si es necesario, descorionicelos bajo el estereoscopio agarrando los extremos opuestos del corion con dos pinzas finas y tire suavemente desde un extremo para abrirlo. Utilice una pipeta de transferencia para retirar el corion del agua.Para la inyección, prepare primero agujas de un milímetro utilizando capilares de vidrio de pared delgada y un dispositivo micropipetizador polar. Almacene las agujas selladas en una placa de Petri sobre una tira de arcilla para modelar. Para fabricar el molde de microinyección, prepare una solución de agarosa al 1,5 % en agua destilada y viértala en una placa de Petri.Luego, coloque un molde prefabricado para microinyección de larvas sobre el agarosa y déjelo solidificar completamente a temperatura ambiente sobre una superficie plana. Saque el molde de microinyección y agregue agua para su almacenamiento a cuatro grados centígrados. Esto evita que el agarosa se seque.Prepare la solución anestésica añadiendo agua de huevo al volumen apropiado de la solución stock de tricaina para obtener una concentración final de 150 miligramos por litro. Almacene la solución a cuatro grados centígrados. Finalmente, prepare un stock de agarosa de punto de fusión bajo para imágenes disolviendo polvo de agarosa de punto de fusión bajo en agua de huevo hasta una concentración final de 1%. Caliente la mezcla hasta que la solución de agarosa aparezca homogénea y almacene alícuotas a cuatro grados en tubos de reacción de 1,5 mililitros.Los parásitos se obtienen a partir de un aislado de Trypanosoma cruzi 01/DA y se cultivan en una línea celular de astrocitoma humano, suplementada con medio completo utilizando matraces T25. Después de tres o cuatro días de cultivo, los parásitos salen de las células y los tripomastigotes pueden recolectarse del sobrenadante. Centrifugue este sobrenadante durante cinco minutos y resuspenda suavemente el sedimento en PBS 1X con suero de feto bovino.Luego, centrifugue durante cinco minutos, deseche el sobrenadante y resuspenda en un mililitro de PBS. Tome 10 microlitros para contar los parásitos de nado libre en una cámara de Neubauer. Tome el resto de los parásitos resuspendidos y agregue un microlitro de CFSE e incube durante 10 minutos a temperatura ambiente.A continuación, agregue PBS para completar 10 mililitros. Centrifugue durante cinco minutos, deseche el sobrenadante y resuspenda el precipitado que contiene los parásitos marcados en 100 microlitros de PBS. Después de este procedimiento de marcado, es importante verificar que los parásitos estén vivos y correctamente marcados mediante la visualización directa de los parásitos en un microscopio de fluorescencia invertido.En el modo de luz transmitida, verifique que los parásitos se muevan. En el modo de fluorescencia, utilice el filtro feet-see para evaluar la marcación de los parásitos. Primero cargue la aguja de vidrio sellada con 10 microlitros de la solución que contiene los parásitos utilizando una punta de pipeta microloader.Luego, inserte la aguja de vidrio en el portaagujas del micromanipulador. Bajo el estereoscopio, corte aproximadamente cinco milímetros de la punta de la aguja utilizando pinzas finas. A continuación, anestesie la larva de 48 horas post-fecundación en una solución de Tricaine hasta que no responda al tacto.Coloque la larva en la placa de agarosa en posición lateral bajo el estereoscopio. Ajuste el micromanipulador de manera que la punta de la aguja quede en el centro del vitelo de la larva. Configure los parámetros del microinyector.Inyecte el pez en el valle de la circulación sanguínea del vitelo. Verifique que el corazón esté latiendo y transfiera inmediatamente la larva a agua fresca de huevo para su recuperación. Transfiera el embrión inyectado a una placa de Petri vacía y retire cuidadosamente el agua circundante con una pipeta de plástico y papel absorbente.Agregue inmediatamente aproximadamente 100 microlitros de agarosa al 1 % de punto de fusión baja precalentada para cubrir el embrión. Asegúrese de que la agarosa no supere los 40 grados Celsius. Inserte un alambre recto dentro de una capilar de vidrio y utilícelo como émbolo para aspirar el embrión en posición vertical.Esto debe hacerse rápidamente antes de que el agarosa se solidifique. Mientras absorbe el agarosa, asegúrese de dejar algo de agarosa por encima del embrión y espere hasta que se solidifique. Si es necesario, expulse el exceso de agarosa por debajo del embrión y córtelo.Llene la cámara de muestra con solución de Tricaine y ajuste la temperatura de la cámara de muestra a 28 grados celsius. A continuación, inserte la capilar que contiene el embrión en el portaobjetos del microscopio y colóquelo en la platina del micromanipulador. Extriga el extremo que contiene el embrión hasta que cuelgue libremente.En el modo de luz transmitida, coloque la muestra frente a la pupila del objetivo de detección utilizando un sistema micromanipulador XYZ y una plataforma de rotación para girarla alrededor del eje vertical. Es útil enfocar primero un borde del capilar, luego desplazarse para localizar el embrión y las estructuras de interés, como el corazón o la vasculatura. A continuación, utilizando un láser de 488 nanómetros o una longitud de onda similar, cambie al modo fluorescente y ajuste la intensidad de iluminación, así como el tiempo de exposición, para reducir el fotoblanqueamiento y optimizar la resolución temporal.Para ello, debe elegirse un objetivo con una buena apertura numérica. Inicie la adquisición de video de la región de interés. En nuestro caso, se observan parásitos adheridos a las válvulas y moviéndose libremente alrededor del área cardíaca.Se recomienda grabar un video de un solo plano a lo largo del tiempo o utilizar el micromanipulador o el sistema Piezo y galvanómetro para enfocar diferentes planos y seguir el movimiento del parásito. Una vez finalizada la adquisición, retire cuidadosamente el embrión del agarosa utilizando pinzas finas y una herramienta de lazo de cabello. Transfiera el pez de vuelta al agua de huevo fresca y verifique su recuperación durante 15 minutos.Luego deseche según los protocolos estándar de su institución. Para todos los procedimientos presentados aquí, se utilizaron embriones a las 48 horas post fertilización. Se podrían usar diferentes sitios anatómicos para inocular el parásito; sin embargo, el valle de la circulación sanguínea del saco vitelino o el conducto de Cuvier son la región más rápida y sencilla para inyectar y acceder al sistema cardiovascular.De ocho a 10 minutos después de la inyección de Trypanosoma cruzi en el conducto de Cuvier, se observan los parásitos en el sistema cardiovascular en desarrollo. Algunos parásitos permanecen adheridos a las paredes del saco vitelino embrionario o a estructuras cardíacas como la válvula atrioventricular. Se observa que los parásitos oscilan con las contracciones cardíacas, lo que demuestra su mecanismo efectivo de adherencia.Además, se observa que los parásitos se desplazan arrastrados por el flujo sanguíneo, en la misma dirección que los eritrocitos, en el espacio pericárdico y en los vasos sanguíneos. El método que desarrollamos permite la observación in vivo de parásitos de T.cruzi en larvas transparentes de pez cebra. Esto puede ser muy útil para visualizar y analizar la dinámica de un patógeno, como la motilidad a través de la sangre y las estructuras cardíacas en un organismo vertebrado vivo.Es importante mantener breve el tiempo entre la inyección y la visualización para observar el parásito nadando libremente. También es fundamental optimizar los parámetros de adquisición al utilizar el microscopio de hoja de luz para reducir el daño fotónico y aún así obtener imágenes de buena calidad. La microinyección de T.cruzi en larvas de pez cebra es una técnica eficaz para inocular el parásito en la circulación sanguínea.En este método, observó la etiquetización con CFC del parásito como un procedimiento práctico que permite una visualización clara del parásito dentro del pez. La inyección en el conducto de Cuvier es una manera suave de asegurar que los parásitos pasen por la circulación. T.cruzi tiende a adherirse a las válvulas del corazón y a los grandes vasos del pez.Pero según nuestros experimentos, no hay infección celular. Son necesarios más estudios para elucidar su tropismo.

establishment-larval-zebrafish-as-an-animal-model-to-investigate

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Embriones de pez cebra transparentes han demostrado ser útiles los ejércitos de modelo para visualizar y las interacciones funcionales de estudio entre las células inmunes y los patógenos bacterianos intracelulares, tales...

La infección de embriones de pez cebra con patógenos bacterianos intracelulares

El rápido desarrollo de tamaño pequeño y la transparencia del pez cebra son grandes ventajas para el estudio del control inmunitario innato de la...

La imagen no invasiva de la candidiasis diseminada en larvas de pez cebra

El video describe el ensayo de evitación y tigmotaxis de las larvas de pez cebra. El video examina el comportamiento de las larvas de pez cebra en respuesta a estímulos aversivos visuales.

Ensayo de evitación y tigmotaxis del pez cebra: un método de alto rendimiento para examinar el comportamiento de las larvas en respuesta a estímulos visuales aversivos

Este artículo describe la tubería de vídeo de alto rendimiento que se ha establecido con éxito para infectar y analizar un gran número de embriones de pez cebra que proporcionan una nueva herramienta potente para las pruebas de compuesto y el descubrimiento de fármacos usando todo un organismo animal vertebrado.

Establecimiento y Optimización de una instalación de alto rendimiento para el Estudio<em&gt; Staphylococcus epidermidis</em&gt; Y<em&gt; Mycobacterium marinum</em&gt; La infección como modelo para el descubrimiento de fármacos

Las interacciones espacio-temporales in vivo del patógeno y las defensas inmunitarias a nivel de la mucosa no se visualizan fácilmente en los huéspedes vertebrados existentes. El método presentado aquí describe una plataforma versátil para estudiar la candidiasis de la mucosa en vertebrados vivos utilizando la vejiga natatoria del pez cebra juvenil como sitio de infección.

Modelado de las mucosas Candidiasis en larvas de pez cebra por inyección de Swimbladder

Los embriones de pez cebra ópticamente transparentes se utilizan ampliamente para estudiar y visualizar en tiempo real las interacciones entre los microorganismos patógenos y las células inmunitarias innatas. La microinyección de Mycobacterium abscessus, combinada con imágenes de fluorescencia, se utiliza para examinar las características patógenas esenciales, como la formación del cordón en los embriones de pez cebra.

Descifrar e imagen Patogénesis y Cording de<em&gt; Abscessus Mycobacterium</em&gt; En embriones de pez cebra

Combinando los enfoques de trasplante de células, marcaje del citoesqueleto y pérdida/ganancia de función, este protocolo describe cómo se puede utilizar la placa precordal prospectiva del pez cebra en migración para analizar la función de un gen candidato en la migración celular in vivo.

analizando<em&gt; En Vivo</em&gt; Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra

Aquí, mostramos el proceso de crear una línea de pez cebra de reportero de tensión eléctrica celular para visualizar el desarrollo embrionario, movimiento, y las células de tumor de peces en vivo.

Visualización de la actividad eléctrica celular en embriones tempranos de pez cebra y tumores

Aquí se presenta un método seguro y eficaz para infectar las larvas de pez cebra con C. difficile anaeróbico etiquetado fluorescentemente por microinyección y microvago no invasivo.

Desarrollo de un modelo de infección de pez cebra larval para Clostridioides difficile

Aquí presentamos un método para obtener imágenes del cerebro embrionario del pez cebra in vivo hasta etapas larvales y juveniles. Este procedimiento microinvasivo, adaptado de enfoques electrofisiológicos, proporciona acceso a detalles celulares y subcelulares de neuronas maduras y se puede combinar con estudios optogenéticos y neurofarmacológicos para caracterizar la función cerebral y la intervención farmacológica.

Imágenes in vivo de tejido cerebral completamente activo en larvas y juveniles de pez cebra despiertos mediante la extirpación del cráneo y la piel

Aquí, proporcionamos un protocolo paso a paso, con consejos para generar xenoinjertos y directrices para el análisis del comportamiento tumoral, la inmunofluorescencia de montaje completo y la cuantificación de imágenes confocales.

Generación de Xenoinjertos Larvales de Pez Cebra y Análisis de Comportamiento Tumoral

Aprenda a establecer larvas de pez cebra como modelo in vivo para estudiar la motilidad de Trypanosoma cruzi mediante microscopía de hoja de luz. Este protocolo permite visualizar parásitos fluorescentes en tiempo real.

Establecimiento de pez cebra Larval como modelo Animal para investigar Trypanosoma cruzi motilidad En Vivo

Explorar más videos