Name: La proyección de imagen de resolución súper Estado de agotamiento de la tierra en células de mamíferos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-05T08:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 55 s
Description: Aprende a visualizar y cuantificar proteínas celulares en células de mamíferos mediante microscopía de superresolución GSD. Este protocolo mejora diez veces la resolución respecto a métodos convencionales.

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Este trabajo fue financiado por una subvención de la AHA para R.E.D. (15SDG25560035). Autores desean reconocer el Dr. Fernando Santana para el uso de su microscopio 3D de Leica SR GSD y el Dr. Johannes Hell por proporcionar amablemente el anticuerpo de la FP1.

<ol><li>Willig, K. I., Rizzoli, S. O., Westphal, V., Jahn, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STED+microscopy+reveals+that+synaptotagmin+remains+clustered+after+synaptic+vesicle+exocytosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">STED microscopy reveals that synaptotagmin remains clustered after synaptic vesicle exocytosis.</a> Nature. 440 (7086), 935-939 (2006).</li>
<li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonlinear+structured-illumination+microscopy%3A+wide-field+fluorescence+imaging+with+theoretically+unlimited+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Nonlinear structured-illumination microscopy: wide-field fluorescence imaging with theoretically unlimited resolution.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13081-13086 (2005).</li>
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<li>Hell, S. W., Kroug, M. <a target="_blank" href="http://www3.mpibpc.mpg.de/groups/hell/publications/pdf/Appl._Phys._B._60_495_497.pdf">Ground-state-depletion fluorscence microscopy: A concept for breaking the diffraction resolution limit.</a> JAppl Phys B. 60 (5), 495-497 (1995).</li>
<li>Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breaking+the+diffraction+barrier+in+fluorescence+microscopy+by+optical+shelving%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Breaking the diffraction barrier in fluorescence microscopy by optical shelving.</a> Phys Rev Lett. 98 (21), 218103(2007).</li>
<li>Flynn, J. M., Santana, L. F., Melov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+transcriptional+profiling+of+adult+mouse+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Single cell transcriptional profiling of adult mouse cardiomyocytes.</a> J Vis Exp. (58), e3302(2011).</li>
<li>Davare, M. A., Horne, M. C., Hell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+phosphatase+2A+is+associated+with+class+C+L-type+calcium+channels+%28Cav1.2%29+and+antagonizes+channel+phosphorylation+by+cAMP-dependent+protein+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein phosphatase 2A is associated with class C L-type calcium channels (Cav1.2) and antagonizes channel phosphorylation by cAMP-dependent protein kinase.</a> J Biol Chem. 275 (50), 39710-39717 (2000).</li>
<li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Chen, K. H., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localization-based+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localization-based super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 8 (12), 1027-1036 (2011).</li>
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<li>Dempsey, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ja904588g">Photoswitching mechanism of cyanine dyes.</a> J Am Chem Soc. 131 (51), 18192-18193 (2009).</li>
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<li>Ovesny, M., Krizek, P., Borkovec, J., Svindrych, Z., Hagen, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ThunderSTORM%3A+a+comprehensive+ImageJ+plug-in+for+PALM+and+STORM+data+analysis+and+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging.</a> Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).</li>
<li>Veeraraghavan, R., Gourdie, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+optical+reconstruction+microscopy-based+relative+localization+analysis+%28STORM-RLA%29+for+quantitative+nanoscale+assessment+of+spatial+protein+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Stochastic optical reconstruction microscopy-based relative localization analysis (STORM-RLA) for quantitative nanoscale assessment of spatial protein organization.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3583-3590 (2016).</li>
<li>Ries, J., Kaplan, C., Platonova, E., Eghlidi, H., Ewers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple%2C+versatile+method+for+GFP-based+super-resolution+microscopy+via+nanobodies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple, versatile method for GFP-based super-resolution microscopy via nanobodies.</a> Nat Methods. 9 (6), 582-584 (2012).</li>
<li>Dixon, R. E., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4360655/">Graded Ca2+/calmodulin-dependent coupling of voltage-gated CaV1.2 channels.</a> Elife. 4, (2015).</li>
<li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat Methods. 8 (7), 527-528 (2011).</li>
<li>Nan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+superresolution+imaging+allows+quantitative+analysis+of+RAF+multimer+formation+and+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule superresolution imaging allows quantitative analysis of RAF multimer formation and signaling.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (46), 18519-18524 (2013).</li>
<li>Fricke, F., Beaudouin, J., Eils, R., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One%2C+two+or+three%3F+Probing+the+stoichiometry+of+membrane+proteins+by+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">One, two or three? Probing the stoichiometry of membrane proteins by single-molecule localization microscopy.</a> Sci Rep. 5, 14072(2015).</li>
</ol>

Los autores tienen intereses que compiten a revelar.

La reciente explosión de las tecnologías que permiten la proyección de imagen más allá del límite de difracción han ofrecido nuevas ventanas en las complejidades de células de mamífero en el espacio y el tiempo. Estas tecnologías incluyen tormenta STED, Palma, GSD, SIM y sus variantes (p. ej., dSTORM, FPALM). El ingenio de los científicos detrás de estas técnicas nos ha permitido sortear las limitaciones impuestas por las leyes de la física que rigen la difracción de la luz. A pesar de este enorme logro, cada un...

Reacciones de señalización celulares traducen cambiando los entornos internos y externos para iniciar una respuesta celular. Regulan todos los aspectos de la fisiología humana, sirviendo como la Fundación de hormonas y liberación de neurotransmisor, del latido del corazón, visión, fertilización y función cognitiva. La interrupción de estas cascadas de señales puede tener consecuencias graves en forma de condiciones fisiopatológicas, incluyendo cáncer, enfermedad de Parkinson y la enfermedad de Alzheimer. Durante décadas, los investigadores biológicos y médicos han utilizado con éxito proteínas fluorescentes, sondas y biosensores juntados con microscopía de fluorescencia como las herramientas principales para comprender la organización espacial y temporal precisa de estos celulares señales.
Las fuerzas de técnicas ópticas como epifluorescencia, confocal, microscopía de fluorescencia (TIRF) de reflexión interna total son su sensibilidad, velocidad y compatibilidad con imágenes de células vivas, mientras que la mayor limitación es su difracción limitada resolución y las estructuras de significado o complejos de la proteína menores de 200-250 nm no se puede resolver. Con el desarrollo teórico y práctico de super-resolución determinista (estructurap. ej., microscopia de agotamiento estimulante de la emisión (STED1), microscopía de iluminación (SIM2) o estocástico super-resolución (p. ej. , fotoactiva localización microscopia (3de la palma), o estado el agotamiento (GSD4,5)), resolución lateral y axial en microscopía de fluorescencia se ha extendido más allá de la barrera de la difracción, a la orden de decenas de nanómetros. Así, los investigadores tienen ahora la capacidad sin precedentes para visualizar y entender cómo organización y dinámica de proteínas se traduce en función a nivel molecular cerca.
Microscopia de agotamiento de estado seguido por cada molécula de retorno (GSDIM), o simplemente GSD como se le conoce, evita el límite de difracción reduciendo el número de fluoróforos4,5al mismo tiempo que emite. Luz laser de la alta energía se utiliza para excitar la muestra marcada con el fluoróforo, bombardeo de electrones con fotones y aumentando la probabilidad de que se someten a un 'spin-flip' y entrar en el trío o 'estado de oscuro' desde el estado excitado4. Esto efectivamente reduce el estado, por lo tanto el nombre de 'tierra de agotamiento del estado'. En el estado de triplete, fluoróforos no emiten fotones y la muestra aparece más dévil. Sin embargo, estos fluoróforos estocástico regreso al estado base y se pueden pasar por varios fotones emitiendo las transiciones de estado excitado a tierra antes de regresar al estado de triplete. Con menos fluoróforos que emiten en un momento dado, ráfagas del fotón emitieron por fluoróforos individuales se convierten en espacial y temporal distinto de los vecinos de fluoróforos. La ráfaga de fotones se puede caber con una función Gaussiana, el centroide calculado que corresponde a la posición del fluoróforo con una precisión de localización que depende de la apertura numérica (NA) de la lente, la longitud de onda de la luz utilizada para excitación y crucial, el número de fotones emitidos por el fluoróforo. Una limitación de GSD es que, puesto que sólo un subconjunto de fluoróforos emite activamente en cualquier momento, miles de imágenes deben recogerse durante varios minutos para construir un mapa de localización completa. El tiempo de adquisición largo combinado con el requisito de energía láser de alta, significa que GSD mejor se adapta a fijo en lugar de muestras vivas.
Este artículo describe la preparación de muestras fijadas para obtener imágenes de microscopía de superresolución de membrana y el retículo endoplásmico (ER)-proteínas residentes (para una lista de reactivos véase Tabla de materialesy consumibles necesarios). Ejemplos de cómo este protocolo puede ser fácilmente adaptado para cuantificar el tamaño y el grado de agrupamiento de tipo L canales voltaje-bloqueados Ca2 + (Cav1.2) en el sarcolema de los miocitos cardiacos, o utilizado para visualizar la distribución celular de la ER, se han demostrado. Comprensión de la distribución y organización de estos componentes celulares es de vital importancia en la comprensión de la iniciación, traducción y en última instancia la función de muchas Ca2 +-cascadas de señales dependientes. Por ejemplo, canales de Cav1.2 son fundamentalmente importantes para la excitación-contracción de acoplamiento, mientras que la mediada por receptor Ca2 + lanzamiento de ER es quizá el más ubicua cascada de señalización en células de mamíferos.

<table><tbody><tr><td>KOH</td><td>Thermo Scientific</td><td>P250-500</td><td>Para limpiar cubreobjetos</td></tr><tr><td>#1.5 cubreobjetos 18 x 18 mm</td><td>Marienfeld Superior</td><td>0107032)</td><td>Para cultivar/procesar/obtener imágenes de células</td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>BP3994</td><td>Diluir a 1x con agua desionizada</td></tr><tr><td>Poly-L-Lisine</td><td>Sigma</td><td>P4832</td><td>Ayuda con la adhesión de las células a la laminina</td></tr> <tr><td></td><td>de vidrio de recubrimientoSigma</td><td>114956-81-9</td><td>Ayuda a la adhesión celular al vidrio de recubrimiento</td></tr><tr><td>Medio 199</td><td>Thermo Scientific</td><td>11150-059 Medios de</td><td>cultivo de miocitos ventriculares</td></tr><tr><td>DMEM 11995</td><td>Gibco</td><td>11995</td><td>Medios de cultivo celular</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Thermo Scientific</td><td>10437028</td><td>Media suplemento</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Sigma</td><td>P4333</td><td>Media suplemento</td></tr><tr><td>0,05% tripsina-EDTA</td><td>Corning</td><td>25-052-CL</td><td>Solución de cultivo celular</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td>Reactivo de transfección transitoria</td></tr><tr><td>PBS libre de Ca2+</td><td>Gibco</td><td>1419-144</td><td>Cultivo celular</td></tr><tr><td>100 % Metanol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A414-4</td><td>Fijación celular</td></tr><tr><td>Paraformaldehído</td><td>Electrón Ciencias de la Microscopía</td><td>15710</td><td>Fijación</td></tr><tr><td>Celular Glutaraldehído</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>Fijación Celular</td></tr><tr><td>SLBR6504V SEAblock</td><td>Thermo Scientific</td><td>37527</td><td>BSA u otras alternativas de solución de bloqueo</td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td>Detergente para permeabilizar células</td></tr><tr><td>Conejo anti-CaV1.2 (FP1)</td><td>Regalo</td><td>N/A</td><td>Existen anticuerpos comerciales anti-CaV1.2 como Alomone Labs Rb anti-CaV1.2 (ACC-003)</td></tr><tr><td>Monoclonal de ratón anti-RFP</td><td>Rockland Inc.</td><td>200-301-379</td><td>Anticuerpo primario</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 donket anti-conejo IgG (H+L)</td><td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td><td>A31573</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 cabra anti-ratón IgG (H+L)</td><td>Invitrogen (Thermo Scientific)</td><td>A11031</td><td>Anticuerpo secundario</td></tr><tr><td>Azida sódica</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td>Previene el crecimiento microbiano para el almacenamiento a largo plazo de muestras</td></tr><tr><td>Catalasa</td><td>Sigma</td><td>C40</td><td>Ingrediente del tampón de fotoconmutación</td></tr><tr><td>Glucosa oxidasa</td><td>Sigma</td><td>G2133</td><td>Ingrediente del tampón de fotoconmutación</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T6066</td><td>Ingrediente del tampón de fotoconmutación</td></tr><tr><td>beta-Mercaptoetilamina Clorhidrato de</td><td>Fisher BP2664100</td><td></td><td>Fisher</td></tr>&<tr><td>beta;-mercaptoetanol</td><td>Sigma</td><td>63689</td><td>Ingrediente tampón de fotoconmutación</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S271-3</td><td>Ingrediente tampón de fotoconmutación</td></tr><tr><td>Dextrosa</td><td>Fisher</td><td>D14-212</td><td>Ingrediente tampón de fotoconmutación</td></tr><tr><td>Portaobjetos de depresión de vidrio</td><td>Neolab</td><td>1 &ndash; 6293</td><td>Para montar muestras</td></tr><tr><td>Twinsil</td><td>Picodent</td><td>13001000</td><td>Para sellar cubreobjetos</td></tr><tr><td>sec61&beta;- Plásmido mCherry</td><td>Addgene</td><td>49155</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio 3D Leica SR GSD</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Solución <td></td><td></td> de<td>bloques de lavado</td><td>20 % SEAblock en PBS</td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> de incubación de anticuerpos primarios <td>0,5 % Triton-X100, 20 % SEAblock, en PBS</td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td> <td>de incubación de anticuerpos secundarios1:1000 en PBS</td></tr></tbody></table>

la proyección de imagen de resolución súper estado de agotamiento de la tierra en células de mamíferos

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Avances en biología celular y microscopía fluorescente se correlacionan íntimamente con la mayor habilidad de visualizar eventos celulares conduce a menudo a dramáticos saltos en nuestra comprensión de cómo las células de función. El desarrollo y la disponibilidad de la microscopía de superresolución ha ampliado considerablemente los límites de la resolución óptica de ~ 250-20 nm. Biólogos no se limitan a describir las interacciones moleculares en términos de colocalización dentro de un área de difracción limitada, más bien ahora es posible visualizar las interacciones dinámicas de las moléculas individuales. Aquí, describimos un protocolo para la visualización y cuantificación de proteínas celulares por microscopia de agotamiento de la tierra-estado para la proyección de imagen fija de la célula. Proporcionamos ejemplos de dos proteínas de membrana diferentes, un elemento de la translocon del retículo endoplásmico, sec61β y un localizado en membrana del plasma voltaje tipo L de Ca2 + canal (CaV1.2). Discutidos son el microscopio específicos parámetros, métodos de fijación, cambio de foto formulación del buffer y trampas y desafíos de procesamiento de imágenes.

Como se indica en la introducción, hay muchos microscopía de resolución súper diferentes modalidades de la proyección de imagen. Este protocolo se centra en la proyección de imagen de súper-resolución GSD. Imágenes representativas y localización mapas se muestran en la figura 2 y figura 3.
La figura 2 muestra una células COS-7 transfectadas...

Este artículo describe un protocolo para la detección de uno o más de plasma y proteínas de la membrana intracelular mediante microscopía de superresolución estado agotamiento (GSD) en células de mamíferos. Aquí, discutimos las ventajas y consideraciones del uso de estos enfoques para la visualización y cuantificación de proteínas celulares.

La proyección de imagen de resolución súper Estado de agotamiento de la tierra en células de mamíferos

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

El objetivo general de esta técnica de imagen fluorescente es visualizar y cuantificar proteínas celulares en células fijadas con una resolución subdifractiva mediante una forma de microscopía de superresolución denominada microscopía de agotamiento del estado fundamental y retorno de moléculas individuales. Este método ayuda a responder preguntas clave en el campo de la biología celular y la biofísica de membranas, ya que evita el límite de resolución impuesto por la difracción, lo que permite a los investigadores definir, visualizar y cuantificar con mayor precisión la distribución de las proteínas celulares. La principal ventaja de este protocolo es que permite obtener imágenes con una mejora aproximada de diez veces en resolución frente a los enfoques convencionales de microscopía fluorescente, como la microscopía confocal.El procedimiento será demostrado por Oscar Vivas, un postdoctorado en mi laboratorio, y Karen Hannigan, una postdoctorada en el laboratorio de Rose Dixon. Para comenzar, prepare las laminillas y las células según se describe en el protocolo de texto adjunto. Luego, fije las muestras y realice inmunocitoquímica para etiquetar la membrana plasmática y/o las proteínas de membrana intracelulares de interés.A continuación, prepare la solución depuradora de oxígeno Glock añadiendo primero 12,5 µL de una solución stock de catalasa, 3,5 mg de glucosa oxidasa y 0,5 µL de Tris 1 M a 49,5 µL de PBS en un tubo microcentrífugo de 1,5 mL. Cierre el tubo y vortexee brevemente para disolver los componentes. Luego, centrifugue la solución durante tres minutos.Ahora, prepare la solución de tiol que induce el cambio fotoconmutable disolviendo la solución de beta-mercaptoetilamina en PBS hasta una concentración de 100 milimolares y ajuste el pH a 8,0. Aliquote y almacene la solución de tiol en el congelador durante hasta una semana. Inmediatamente antes de la adquisición de imágenes, mezcle los componentes de tiol y de eliminación de oxígeno con un tampón salino y almacene la solución en hielo.Utilizando 100 microlitros del tampón de conmutación fotónica preparado, monte laminillas que contengan células teñidas sobre portaobjetos con cavidad. A continuación, selle los bordes de la laminilla con un pegamento de silicona para evitar la oxidación rápida del tampón de imagen. Espere varios minutos hasta que el pegamento de silicona haya curado completamente, antes de realizar la adquisición de imágenes.De lo contrario, la cubreobjetos se desplazará. Para comenzar, seleccione un láser adecuado para iluminar la muestra, según el fluoróforo elegido. Para un fluoróforo Alexa 647, utilice un láser de 642 nanómetros.A continuación, elija el cubo de imagen dicróico y el objetivo adecuados. Abra el software de adquisición de imágenes. Seleccione el modo de adquisición 2D y luego configure el tiempo de exposición en 11 milisegundos.Además, ajuste la ganancia EM a 300 y seleccione un umbral de detección adecuado. A continuación, active el Control Automático de Eventos y establezca el número de Eventos por Imagen en ocho. Ingrese el Tamaño de Píxel como 20 nanómetros.En la pestaña GSD Tools, vaya a las opciones de cálculo de imagen de alta resolución y asegúrese de que el modo de histograma esté seleccionado. Para obtener imágenes de proteínas en la membrana plasmática, seleccione el modo TIRF y modifique el ángulo de incidencia para determinar la profundidad de penetración. Luego, ajuste la intensidad del láser al 100 % para enviar electrones al estado oscuro.A continuación, seleccione Detección de Moléculas Individuales durante el bombeo y configure la adquisición automática cuando la correlación de cuadros sea 0,20. Para la adquisición, ajuste la intensidad del láser al 50 % y el número de cuadros de adquisición a 60 000. Luego, comience a tomar imágenes.Para cuantificar el tamaño del cúmulo de proteínas, abra el archivo de imagen de un mapa de localización de moléculas individuales con histograma de 10 nanómetros en ImageJ. En el menú Imagen, vaya a Ajustar y utilice la opción Automático para optimizar el brillo y el contraste de la imagen. Luego, en el menú Tipo, seleccione 8 bits.A continuación, abra el menú Analizar, haga clic en Establecer escala e ingrese los valores mostrados aquí. Luego, en el menú Analizar, seleccione Establecer mediciones y marque la casilla junto a la opción Área. De regreso en el menú Imagen, seleccione Ajustar, Umbral y luego seleccione Sobre/Debajo.Mueva el valor máximo a 255, el valor mínimo a uno y haga clic en Aplicar. Finalmente, abra el menú Analizar y seleccione Analizar partículas. Marque la casilla para seleccionar unidades de píxeles, mostrar resultados y resumir.Luego, configure el tamaño de cuatro a infinito, seleccione la opción Contornos simples y haga clic en Aceptar. La célula imagenada aquí fue transfectada con la proteína del retículo endoplasmático, mCherry-Sec61 beta, e imagenada utilizando tanto microscopía TIRF sin límite de difracción como microscopía de superresolución GSD en modo TIRF. Estas curvas representan el diámetro de los túbulos del retículo endoplasmático. La imagen de la derecha muestra una mejora en la resolución lateral y representa una representación más precisa de la estructura de los túbulos del retículo endoplasmático.La mejora en resolución ofrecida por la imagen de superresolución GSD se demuestra aún más en estas imágenes, que muestran un miocito cardíaco marcado con un anticuerpo anti-CAV 1.2. Al utilizar el modo GSD, la mejora en la resolución lateral es notable y es más fácil identificar grupos separados de canales. Una vez dominado, este protocolo puede completarse en menos de tres días.La obtención de imágenes de superresolución de una sola célula toma de 10 a 30 minutos, dependiendo del número de cuadros requeridos. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la microscopía electrónica para responder preguntas adicionales, como cómo la proteína fluorescente de interés interactúa con el complejo entorno celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar, adquirir y analizar muestras para visualizar una o más proteínas celulares mediante microscopía de superresolución utilizando el agotamiento del estado fundamental seguido por el retorno individual de moléculas.

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Investigación

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Biología

Se describe un super-resolución método de imagen para sondear la organización estructural de la bacteriana FtsZ-anillo, un aparato esencial para la división celular. Este método se basa en análisis cuantitativos de fotoactivados microscopía de localización (palma) y las imágenes se puede aplicar a otras proteínas del citoesqueleto bacterianas.

Super-resolución de imagen de la maquinaria de división bacteriana

La información espacio-temporal sobre las proteínas dinámicas dentro de las células vivas es crucial para entender la biología. Un tipo de microscopía de superresolución llamada microscopía rápida de iluminación estructurada en 3D (f3D-SIM) revela información única sobre el anillo Z citocinético en las bacterias: tanto su apariencia en forma de perla como la rápida dinámica de FtsZ dentro del anillo.

Super-resolución de imagen del anillo Z cytokinetic en bacterias vivas Utilizando 3D-estructurado Fast Iluminación Microscopía (F3D-SIM)

Describimos aquí una combinación de la técnica de bicapa lipídica soportada por vidrio para formar sinapsis inmunológicas con la técnica de imagen de superresolución de la microscopía de depleción por emisión estimulada (STED). El objetivo de este protocolo es proporcionar a los usuarios las instrucciones necesarias para llevar a cabo con éxito estas dos técnicas.

Super-resolución de imagen de la célula Natural Killer inmunológica Synapse en un apoyada-Glass planar bicapa lipídica

PI (4,5) P 2 regula diversas funciones celulares, pero su organización nanoescala en la membrana plasmática de la célula es poco conocido. Por PI etiquetado (4,5) P 2 con una sonda fluorescente de dos colores fusionado con el dominio de homología Pleckstrin, se describe un nuevo enfoque para estudiar la PI (4,5) P 2 distribución espacial en la membrana plasmática en la escala nanométrica .

Single-molécula de super-resolución de imagen de fosfatidilinositol 4,5-bisfosfato en la membrana plasmática con la novela fluorescentes Sondas

Los conjugados BODIPY convencionales se pueden utilizar para la microscopía de localización de células vivas de una sola molécula (SMLM) a través de la explotación de sus dimers de estado de tierra de formación transitoria y cambio de rojo. Presentamos un protocolo SMLM optimizado para rastrear y resolver lípidos neutros subcelulares y ácidos grasos en mamíferos vivos y células de levadura a escala de longitud nanoscópica.

Conjugaciones BODIPY convencionales para microscopía de superresolución de células vivas y seguimiento de una sola molécula

Se presenta aquí un protocolo para la proyección de imagen de la vivir-célula de la super-resolución en tejido intacto. Hemos estandarizado las condiciones para la obtención de imágenes de una población de células madre adultas altamente sensibles en su entorno de tejido nativo. Esta técnica consiste en equilibrar la resolución temporal y espacial para permitir la observación directa de fenómenos biológicos en tejidos vivos.

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La membrana basal es esencial para la morfogénesis de tejidos y órganos durante el desarrollo. Para comprender mejor los mecanismos que conducen a la colocación adecuada de esta estructura, el protocolo presentado describe métodos para visualizar y caracterizar el tráfico intracelular y la secreción de proteínas de la membrana basal en células epiteliales utilizando microscopía confocal y de superresolución.

Imágenes confocales y de superresolución del tráfico intracelular polarizado y la secreción de proteínas de la membrana basal durante la oogénesis de Drosophila

La microscopía de superresolución puede proporcionar una visión detallada de la organización de los componentes dentro del complejo sinaptonémico en la meiosis. Aquí, demostramos un protocolo para resolver proteínas individuales del complejo sinaptonémico Caenorhabditis elegans .

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Este artículo proporciona un protocolo sencillo y claro para etiquetar los efectores secretados por Salmonella utilizando el sitio específico de expansión del código genético (GCE) e imágenes de la localización subcelular de proteínas secretadas en células HeLa utilizando microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa (dSTORM)...

Imágenes de superresolución de proteínas secretadas por bacterias mediante la expansión del código genético

Este protocolo describe el procedimiento para realizar la microscopía de localización profunda de molécula única (SMLM) de célula entera utilizando un microscopio confocal de disco giratorio con reasignación óptica de fotones, permitiendo así la obtención de imágenes DNA-PAINT sin necesidad de óptica personalizada ni iluminación compleja.

Imagen de superresolución de célula completa mediante DNA-PAINT en un disco confocal giratorio con reasignación óptica de fotones

Este protocolo detalla las aplicaciones avanzadas de imagen y la gestión de recursos compartidos de un sistema de microscopio confocal de barrido láser integrado con un detector de matriz multiplexada para imágenes celulares y subcelulares de alta resolución. El flujo de trabajo permite la obtención de imágenes multimodales desde confocal hasta superresolución (~120 nm) dentro de una sola plataforma, haciendo que la visualización a escala nanométrica sea más accesible.

Imagen de superresolución y gestión compartida: un protocolo para microscopía confocal con detección multiplex

Aprende a visualizar y cuantificar proteínas celulares en células de mamíferos mediante microscopía de superresolución GSD. Este protocolo mejora diez veces la resolución respecto a métodos convencionales.

La proyección de imagen de resolución súper Estado de agotamiento de la tierra en células de mamíferos

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