Estimulación eléctrica cerebral transcraneal en roedores alerta

El objetivo general de este procedimiento quirúrgico consiste en permitir una estimulación eléctrica transcraneal cerebral fiable y repetida en roedores despiertos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neuromodulación y la neuroplasticidad mediante la estimulación eléctrica dirigida de redes cerebrales para mejorar la función motora o corregir déficits. La principal ventaja de esta técnica es que permite sesiones repetidas de estimulación eléctrica cerebral no invasiva en roedores despiertos, sin provocar molestias ni interferir mínimamente en las mediciones de su comportamiento.

Las personas nuevas en este método podrían tener dificultades porque encontrar la trayectoria correcta para el túnel desde el tórax hasta la cabeza, así como la preparación ósea antes de colocar los conectores de los electrodos, suele ser difícil de realizar para investigadores inexpertos. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos quirúrgicos para la colocación de los conectores de los electrodos, así como la preparación y colocación de los electrodos para la estimulación, serán cruciales para el éxito de los experimentos. Nuestra candidata al doctorado, Stephanie Haschka, ayudará a realizar los procedimientos de NEBS en ratas despiertas.

Presentador}Comience colocando al roedor sobre su pecho en la mesa de operaciones. Desinfecte el cuero cabelludo afeitado con un hisopo empapado en agente antiséptico. Deje que se seque al aire.

Luego, tras verificar la profundidad de la anestesia, corte la piel con un escalpelo mediante una línea única desde el nivel del ojo rostral hasta el nivel del oído medio. A continuación, coloque la rata en posición supina para exponer el tórax y desinfecte la zona torácica. Estire la piel lateral del tórax derecho con dos dedos y realice un corte sagital recto en orientación craneal.

Forme un saco subcutáneo desconectando atraumáticamente la piel del músculo pectoral mayor izquierdo, hágalo abriendo y cerrando repetidamente las tijeras pequeñas. A continuación, gire el animal sobre su lado derecho y haga un túnel para el cable desde la esquina occipital izquierda de la piel abierta de la cabeza a lo largo del cuello hasta que salga en el saco pectoral. Penetre la fascia superficial utilizando pinzas hemostáticas.

Abrir cuidadosamente la pinza homeostática para sujetar el extremo del cable del electrodo conectado al electrodo de platino, sin permitir que los alambres afilados se desvíen. Tirar del cable a través del túnel hasta que el electrodo entre en la bolsa orientado con el punto de cauterización hacia la extremidad trasera izquierda del roedor. Luego, girar al roedor nuevamente a la posición prona.

A continuación, fije la placa de platino con una sutura sintética trenzada estéril no absorbible al fascia pectoral mediante los orificios de las esquinas opuestas. De forma similar, sujete el cable al fascia mediante un nudo suelto que forme un pequeño bucle antes de la entrada al túnel tisular. Finalmente, cierre la piel con tres o cuatro suturas cutáneas, según el tamaño del corte.

Comience raspando el periostio, el tejido conectivo del cráneo hacia los lados, con el bisturí, y limpie completamente con hisopos de algodón. Fije el tejido conectivo en las cuatro esquinas del corte con pinzas de cocodrilo, luego déjelas colgando lateralmente para mantener el campo quirúrgico abierto. A continuación, aplique solución salina al 0,9 % para limpiar la superficie ósea y el tejido con hisopos de algodón.

Luego limpie la superficie ósea con peróxido de hidrógeno al 3%. Utilice un hisopo de algodón para eliminar cualquier residuo del periostio a medida que se vuelva visible. Dado que los tornillos de fijación mejorarán la adherencia del sedante, elija una broca que se ajuste al tamaño del tornillo.

Coloque dos orificios en dos placas óseas diferentes mediante perforación previa con un taladro manual y luego con ligera presión de partículas con un taladro óseo. En los casos con un electrodo implantado, como se muestra en este video, realice un tercer orificio ubicado en el hueso parietal posterior derecho para la futura fijación del cable subcutáneo. Coloque los tornillos plásticos en los orificios y atornille hasta sentir la primera fricción.

Luego, realice tres giros adicionales de 180 grados con el tornillo. Utilice pinzas para verificar la estabilidad del tornillo y agregue un giro más si no está lo suficientemente apretado. Encienda el hierro de cauterización y precaliente durante aproximadamente cinco minutos.

Enrolle el cable que sale del túnel de tejido en dirección occipital alrededor del tornillo parietal derecho y luego córtelo dejando aproximadamente un centímetro de cable detrás del enrollamiento. Retire cuidadosamente el aislamiento en el extremo del cable con un escalpelo. A continuación, fije el cable enrollado al tornillo y al hueso con pegamento de cianoacrilato.

A continuación, aplique una pequeña cantidad de estaño para soldadura libre de plomo al conector y a los hilos desnudos del cable del electrodo de contraparte, y conecte ambos presionando brevemente juntas las partes previamente soldadas mientras toca la punta de soldadura hasta que el estaño se derrita. Retire inmediatamente la punta de soldadura para evitar un calentamiento excesivo del metal en el cable, lo que podría provocar daño tisular posterior. Para la estimulación de la corteza motora, utilice un zócalo de cuatro milímetros de diámetro.

Tomar el zócalo de electrodo tES hecho a medida con pinzas de punta fina dentada y aplicar una capa delgada de pegamento de cianoacrilato al borde inferior del zócalo. El borde intermedial del zócalo debe terminar justo en la sutura sagital y el borde interno del coddle debe terminar en el bregma. Luego presionar brevemente el zócalo contra el hueso hasta que el pegamento se endurezca.

Y utilice una luz para asegurarse de que el hueso dentro del área del zócalo no tenga pegamento reflectante. Una vez que el zócalo esté en su lugar y el área prevista para la estimulación esté libre de pegamento, selle el borde lateral del zócalo al tejido adyacente con una pequeña gota de pegamento de cianoacrilato para evitar un puente de fluido que podría provocar una derivación de corriente en este sitio. Luego, cubra todos los tornillos con pegamento de cianoacrilato.

A continuación, mezcle los dos componentes del cemento acrílico en un pequeño tubo de silicona o vidrio. Tan pronto como adquiera viscosidad, aplíquelo con una espátula dental para sellar los bordes restantes del conector al hueso. Finalmente, cubra todo el cráneo, los tornillos, el cable del electrodo de referencia y hasta 1/3 del conector con cemento acrílico dental.

Una vez que todo el hueso esté cubierto y el cemento se haya endurecido, retire las pinzas de cocodrilo y reposicione la piel. Comience llenando la mitad del zócalo del electrodo de tES con solución salina al 0,9 % y elimine las burbujas de aire. Antes de las sesiones de tES catódicas, verifique la cloración y, si es necesario, reclorine el electrodo de plata y cloruro de plata.

Antes de las sesiones de tES anódica, elimine posibles depósitos excesivos de cloruro de plata de estimulaciones previas con papel de lija para permitir una buena conductividad durante la estimulación. Luego, enrosque el casquillo de los electrodos de tES. Conecte los cables a los dos conectores en la cabeza.

Luego, coloque el roedor en la jaula experimental con los cables conectados a una conexión giratoria ubicada sobre la jaula que permite un movimiento libre. Encienda el estimulador y ajuste los parámetros de estimulación. Finalmente, tras finalizar la estimulación, desconecte los cables, retire el capuchón del electrodo en la cabeza, y limpie y seque el zócalo con un hisopo de algodón.

Los resultados indicaron que la activación de la microglía evaluada mediante alteración morfológica ocurrió primero a 31,8 amperios por metro cuadrado, mientras que los primeros signos de neurodegeneración se detectaron a 47,8 amperios por metro cuadrado. Las muestras de la uno a la cuatro se calificaron como positivas. La anestesia afectó la magnitud de la respuesta al DCS, ya que el porcentaje de cortes cerebrales con neuronas degenerativas positivas para fluoro-JC en ratas despiertas fue mayor a 47,8 amperios por metro cuadrado.

Además, se espera que los efectos conductuales o moleculares a intensidades altas sean mecanísticamente diferentes en comparación con los efectos a baja intensidad. Una vez dominada, esta técnica, incluida la colocación de los electrodos torácicos, puede realizarse en 40 a 45 minutos si se lleva a cabo correctamente. Habitualmente, se necesita un periodo más corto de 10 a 15 minutos si no se coloca quirúrgicamente un electrodo de contraparte.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo colocar un electrodo permanente para las diferentes técnicas de simulación NEBS y de cómo aplicar un eTS en roedores despiertos. No olvide que trabajar con corrientes eléctricas puede ser perjudicial para el roedor si los electrodos no se preparan adecuadamente antes de la estimulación. Siempre se deben tomar precauciones como la re-cloración del electrodo antes de la estimulación catódica o la eliminación de los residuos antes de la estimulación anódica antes de realizar este procedimiento.