Usando a láser Doppler Imaging y seguimiento para analizar la microcirculación de la médula espinal en ratas

El objetivo general de este procedimiento es presentar una combinación de imágenes láser Doppler y monitoreo para medir los flujos sanguíneos locales de la médula espinal y la saturación de oxígeno, así como un procedimiento estandarizado para introducir un traumatismo de la médula espinal en una rata. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microcirculación, como cómo se redistribuye el flujo sanguíneo con el tiempo y su impacto en el área circundante después de una lesión de la médula espinal. La principal ventaja de esta técnica es que mediante el uso de imágenes láser Doppler y el dispositivo de monitoreo podemos derivar rápidamente datos de la distribución local del flujo sanguíneo, así como la variación del flujo sanguíneo durante un período de tiempo, lo que permite un análisis más sofisticado del flujo sanguíneo en el área problemática.

Comience por revisar la rata anestesiada para ver si tiene un plano quirúrgico de anestesia por la ausencia de una reacción a un pinzamiento del dedo del pie. Afeita el área dorsal de la rata desde la parte baja de la espalda hasta el cuello. Luego, coloque la rata con el lado dorsal hacia arriba sobre una almohadilla térmica de 40 grados centígrados para mantener una temperatura corporal constante.

Esterilice el área afeitada limpiando con bolas de algodón empapadas en yodo seguidas de alcohol al 75%. Después de hacer una incisión en la piel sobre el sitio de la laminectomía que cubre las vértebras torácicas T7 a T11, corte los músculos adheridos en ambos lados de T8 a T10 para exponer las apófisis espinosas, las láminas y las articulaciones facetarias. Use el bisturí para hacer incisiones que desconecten la unión entre T10 y T11.

Exponga aún más la unión diseccionando cuidadosamente la capa muscular para exponer el hueso. Use las tijeras para eliminar aún más el músculo de la lámina y alrededor del pedículo con pequeños cortes. Esto abrirá un pequeño espacio entre las vértebras en T10 y T11.

Inserte lenta y delicadamente pinzas hemostáticas en este espacio y rompa el pedículo. Repita en el otro lado. Exponga la médula espinal y levante y rompa con cuidado la lámina sin dejar fragmentos de hueso libres o dentados.

Repita el proceso para eliminar aún más las láminas T9 y T8. Un impactador ahora se puede usar para inducir lesiones por conmoción cerebral en grupos experimentales. Para escanear la médula espinal expuesta, coloque el lado dorsal de la rata hacia arriba sobre un fondo negro no reflectante, luego configure los parámetros de escaneo en el software haciendo clic en Medir para ingresar a la interfaz gráfica de usuario de medición y luego en el botón Configuración del escáner para abrir la interfaz de Configuración del escáner.

Para escanear áreas pequeñas, como en este experimento, haga clic en Opciones de Tamaño de escaneo y Visualización y seleccione Alta resolución para un modo de escaneo fino con mayor resolución. Haga clic en la opción Escaneo de imagen para verificar los parámetros de escaneo. Verifique la imagen de video en vivo haciendo clic en la opción Video y distancia.

Coloque el escáner de 10 a 13 centímetros por encima de la ventana quirúrgica y mueva el fondo con el animal para centrar la médula espinal expuesta en la ventana de exploración. Seleccione la función Distancia automática para ajustar con precisión la altura de escaneo, que debe mantenerse constante en todas las mediciones del experimento. Use una cubierta no reflectante con una ventana para exponer solo el área quirúrgica para minimizar aún más el fondo y marcar la dirección del animal.

Haga clic en Repetir escaneo para establecer el número de escaneos, luego haga clic en Aceptar para abrir la interfaz de Repetir escaneo. Haga clic en el botón Inicio para comenzar a escanear. Todo el proceso durará aproximadamente de tres a cuatro minutos.

En este caso, se utiliza un monitor de escáner con una aguja roma VP3 y una sonda de administración para controlar el flujo sanguíneo y la saturación de oxígeno a lo largo del tiempo. Comience conectando la sonda perpendicular a un instrumento estereotáxico para configurar el equipo de monitoreo. Coloque a la rata en el aparato estereotáxico, con la parte dorsal hacia arriba, y cubra al animal con un pequeño trozo de espuma de poliestireno para nivelar la médula espinal expuesta.

Examine la incisión y elimine el exceso de líquido o sangre con una almohadilla de algodón. Utilice los ejes x e y del aparato para ubicar la sonda a dos milímetros rostrales del punto central de la médula espinal expuesta o del punto de la lesión y vaciar la vena central. Use el eje z para bajar lentamente la sonda hasta el nivel que toca la superficie de la médula espinal.

La sonda debe tocar la superficie de la médula espinal, pero no debe estar tan floja como para permitir que la luz brillante escape por el lado del punto de contacto. El posicionamiento adecuado es fundamental para adaptar e implementar el protocolo de monitoreo. La sonda debe estar perpendicular a la superficie medida y se debe evitar una presión excesiva.

Para registrar los datos, haga clic en el botón Nuevo experimento en el software para abrir la interfaz de configuración. En la opción General, compruebe la configuración del sistema y, a continuación, haga clic en Siguiente. En la configuración de pantalla, seleccione el canal para el flujo sanguíneo y la saturación de oxígeno y haga clic en Siguiente.

Ingrese la información del archivo y haga clic en Siguiente para ingresar a la interfaz de registro de datos. Haga clic en el botón del triángulo verde para comenzar a registrar los datos de la sonda. Una vez que la señal sea estable, registre los datos durante ocho minutos consecutivos, luego levante la sonda y retire al animal del aparato estereotáxico.

Después de suturar el músculo y la piel, coloque a la rata de lado en una jaula limpia sobre una almohadilla térmica, evitando el contacto entre el sitio de la cirugía y el fondo de la jaula. Vigile al animal hasta que se despierte de la anestesia para asegurarse de que no haya sangrado después de la cirugía y que las suturas permanezcan cerradas. Estas imágenes representan la imagen de flujo de la médula espinal del grupo simulado a la izquierda y del grupo de lesiones de la médula espinal a la derecha.

Las imágenes de flujo demostraron que la lesión de la médula espinal indujo una reducción del flujo sanguíneo y que el flujo sanguíneo del epicentro fue menor que el de la médula rostral y la médula caudal. Estas imágenes muestran el flujo sanguíneo alterno a lo largo del eje rostral-caudal de la médula espinal del grupo simulado a la izquierda y del grupo LM a la derecha. Como se muestra aquí, el flujo sanguíneo de la médula espinal del grupo con lesión de la médula espinal disminuyó significativamente en comparación con el grupo simulado.

Al mismo tiempo, la saturación de oxígeno de la médula espinal fue notablemente más baja después de la conmoción cerebral de la médula espinal, lo que fue consistente con el cambio en el flujo sanguíneo después de la lesión. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo medir el flujo sanguíneo de la médula espinal utilizando imágenes de perfusión Doppler láser y el monitoreo de perfusión Doppler láser. Una vez dominada, la cirugía de introducción de la lesión medular se puede realizar en 20 minutos y las mediciones, incluido el uso de ambos instrumentos láser Doppler, tomarán aproximadamente 20 minutos si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar una cubierta no reflectante con una ventana para exponer solo el área quirúrgica para minimizar aún más el fondo y marcar la dirección del animal. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la microcirculación exploraran los cambios del flujo sanguíneo para su evaluación faracodinámica y farmacocinética.