Name: Preparación de muestras para análisis de Endopeptidomic en el líquido cefalorraquídeo humano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprenda a preparar muestras de líquido cefalorraquídeo humano para análisis de endopeptidómica mediante espectrometría de masas con prefraccionamiento cromatográfico. Este método permite detectar péptidos de baja abundancia y expandir el peptidoma conocido, facilitando el descubrimiento de biomarcadores para trastornos neurodegenerativos.

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Muchas gracias a Tanveer Batth y colegas para asesoría en establecer el método de fraccionamiento anterior.
Este trabajo contó con financiamiento del Consejo de investigación sueco, la Wallström y Fundación Sjöblom, la pistola y Bertil Stohne Fundación Stiftelse, la Fundación de Bergwall de Magnus, Åhlén Fundación, Alzheimerfonden, Demensförbundet, Stiftelsen för Gamla Tjänarinnor, Knut y Alice Wallenberg Foundation, Frimurarestiftelsen y FoU-Västra Götalandsregionen.
Los principales destinatarios de la financiación de este proyecto fueron Kaj Blennow, Henrik Zetterberg y Johan Gobom.

El protocolo que se describe a continuación es una versión refinada de la utilizada en un estudio previo donde se identificaron una gran cantidad de péptidos endógenos en CSF humana15. Versiones del protocolo original implican alteraciones menores en el tratamiento previo químico del LCR, así como optimización de degradado que se utiliza para el fraccionamiento previo fuera de línea de alto pH RP HPLC.
Consideraciones éticas
Todos los estudios de sueco paciente y control de los materiales han sido aprobados por comités de ética: St Göran (Ref. 2005-554-31/3). Muestras de la CSF de la cohorte de demencia de Amsterdam y recogidos en el Hospital Nacional para Neurología y Neurocirugía, Londres fueron utilizados para investigación con consentimiento de todos los pacientes participantes y la aprobación de los comités de ética regional. El material aquí utilizado principalmente consistió en CSF sobrantes de las muestras tomadas con el fin de diagnosis y era anónima antes de ser incluido en nuestros estudios. No hay posibilidad de remontar nuevamente la muestra a cualquier donante individual o grupo de donantes.
1. extracción de humanos del líquido cerebroespinal (CFS):
<ol><li>Extracto de la CSF a través de una punción lumbar (debe realizarse por un médico entrenado) utilizando un protocolo estandarizado de22.</li>
	<li>Eliminar restos celulares y otros materiales no solubles por centrifugación a 2.500 x g durante 20 min.</li>
	<li>Inspeccione visualmente las muestras CSF de decoloración que puede indicar contaminación de sangre por punción hemorragia. La significativamente mayor concentración de proteína en la sangre y la presencia de proteasas puede afectar enormemente los resultados analíticos.</li>
</ol>2. tratamiento previo de la CFS (volumen de muestra de 1,5 mL, no hay cuantificación):
<ol><li>Descongelar los 1,5 mL de alícuotas de la CSF a temperatura ambiente (RT), transferir el contenido a tubos de polipropileno de 10 mL y añadir 80 μl de 1 M bicarbonato de Trietilamonio (TEAB) como un neutralizante.</li>
	<li>Agregar clorhidrato de guanidinio 0,65 mL de 8 M (GdnHCl) (concentración activo GdnHCl: 2,4 M) y agitar suavemente a temperatura ambiente durante 10 minutos. Nota: El agente caotrópico, GdnHCl, afecta a la viscosidad del solvente tanto interactúa con la cadena polipeptídica, que se traduce en proteína despliegue ser enérgio favorable23. Así, GdnHCl disuelve agregados de proteína y aumenta la recuperación de péptidos endógenos durante la filtración posterior.</li>
	<li>Añadir 60 μL de 200 mM de acuosa tris(2-carboxyethyl) clorhidrato de fosfina (TCEP) (concentración active TCEP: 6 mM) e incubar a 55 ° C por 1 h para reducir disulfuros de cisteína.</li>
	<li>Añadir 35 μl de 400 mM Yodoacetamida (IAA) (concentración activa IAA: 4 mM) e incubar a temperatura ambiente en oscuridad durante 30 minutos a alkylate cisteínas. La adición de un grupo alquilo se asegura de que residuos de cisteína espontáneamente no pueden formar puentes disulfuro en cualquier momento durante la preparación de la muestra posteriores.</li>
	<li>Añadir 3,25 mL de agua desionizada y agitar brevemente para diluir la muestra antes de la filtración MWCO, dando por resultado un volumen total de la muestra de 5,5 mL. Este paso sirve para diluir GdnHCl a por debajo de 1 M como se ha observado una mayor concentración a veces causar lixiviación de sustancias poliméricas de los dispositivos de filtro.</li>
</ol>3. tratamiento previo de la CFS (volumen de muestra 10 x 150 μL, cuantificación etiquetado isobárica):
<ol><li>Descongelar 150 μL de alícuotas de la CSF de 10 individuos en RT y posteriormente transferir el contenido a tubos de centrífuga micro baja unión individual 1.5 mL y añadir 8 μl de 1 M TEAB como un neutralizante.</li>
	<li>Añadir 65 μl de 8 M GdnHCl (concentración activo GdnHCl: 2,4 M) y agitar suavemente a temperatura ambiente durante 10 minutos.</li>
	<li>Añadir 6 μl de 200 mM de TCEP acuosa (concentración active TCEP: 6 mM) e incubación a 55 ° C por 1 h para reducir disulfuros de cisteína.</li>
	<li>Añadir 3,5 μl 400 mM IAA acuosa (concentración activa IAA: 6 mM) e incubar a la RT y la oscuridad durante 30 minutos para alkylate cisteínas.</li>
	<li>Preparar el kit de etiquetado isobárico (e.g., reactivo de etiquetado isobárico de etiqueta de masa tándem 10plex). Deje que los frascos de reactivo etiquetado isobáricos a RT antes de abrirlos para evitar hidratación innecesario reactivo, añadir 41 μl de grado HPLC acetonitrilo (AcN) y disolver por agitación suave durante 5 minutos.</li>
	<li>30 μl de solución de reactivo de etiquetado isobárica de transferencia a la muestra correspondiente e incubar 1 h a temperatura ambiente en agitación suave. El reactivo etiquetado isobárico comprende un grupo de NHS-éster que reacciona con las aminas primarias presentes en el péptido N-termini, así como con residuos de lisina.</li>
	<li>Añadir 8 μl de 5% hidroxilamina (hidroxilamina concentración activa: 0,16%) y agitar suavemente a temperatura ambiente por 20 min para calmar la reacción de etiquetado. Puesto que las muestras por separado con combinar, asegurar que el etiquetado reacción se apaga. Por adición de una abundancia de grupos amino en forma de hidroxilamina, reactivo etiquetado isobárico restantes se permite reaccionar y así es inertizado.</li>
	<li>Combinar el contenido de cada una de las 10 muestras etiquetadas individualmente en un tubo de polipropileno solo 15 mL.</li>
	<li>Añadir 6,4 mL de agua desionizada para la muestra combinada y vortex brevemente para reducir la concentración de AcN del 12% al 3% y a la concentración de GdnHCl GdnHCl a por debajo de 1 M como se ha observado una mayor concentración a veces causar lixiviación de sustancias poliméricas de los dispositivos de filtro.</li>
</ol>4. el peso Molecular de corte filtrado
<ol><li>Para eliminar el potencial de contaminantes, afección el MWCO filtros cargando 10 mL acuosa 1 M GdnHCl, 25 mM TEAB y centrifugar 15 min a 2.500 x g y RT, descartar el paso (FT).</li>
	<li>El volumen de toda la muestra en el filtro de la carga (CSF no etiquetados de 5 mL (paso 2.5) o 10 mL con etiqueta isobarically CSF (paso 3.9)) y centrifugar por 30 min a 2.500 x g y RT, dejo el flujo a través (FT) en el recipiente. El resultado de la filtración es que péptidos y proteínas de pequeño tamaño se separan de más proteínas y residual de restos celulares. Este paso puede verse como el equivalente al uso de la digestión proteolítica de las proteínas peptidomic para generar péptidos en experimentos de la proteómica.</li>
	<li>Coloque 5 mL de 25 mM TEAB (acuosa) en los filtros y centrifugar 15 min a 2.500 x g y RT, para aumentar la recuperación de péptidos.</li>
	<li>Vórtice de la FTs combinada de los dos pasos anteriores (total 10 mL de no etiquetar o 15 mL de muestra de isobarically etiquetados) y proceder a la acidificación de la muestra.</li>
</ol>5. el salado y muestra limpiar por extracción en fase sólida
<ol><li>Acidificar la muestra filtrada de paso 4.4 antes de la extracción en fase sólida (SPE). La acidificación se realiza con el fin de mejorar la interacción de soluto (péptido) con la fase estacionaria del cartucho de SPE.</li>
	<li>Para la muestra no etiquetada (volumen 10 mL): Añadir 550 μl de 1% de ácido trifluoroacético (TFA) - volumen total de la muestra: mL 10,55 con 0.05% TFA.</li>
	<li>Para la muestra etiquetada isobárico (volumen 15 mL): agregue 20 mL 0.1% TFA a acidificar y baja concentración de AcN del 3% al 1% - volumen total de la muestra: 30 mL con 0.066% TFA. Nota: TFA se agrega también para su función como un reactivo de emparejamiento iónico, que mejora la retención de los péptidos no se capaz de interacción hidrofóbica suficientemente fuerte con el material de embalaje del cartucho SPE a conservarse.</li>
	<li>Si pH > 3, valorar la muestra con ácido fosfórico al 20% hasta pH de la muestra es < 3.</li>
	<li>Condición de los cartuchos SPE por la adición de 1 mL de 84% AcN, 0,1% de ácido fórmico (FA) y desechar los pies repetir una vez. Acondicionado del cartucho filtro es necesaria para eliminar sustancias no deseadas que lo contrario se procederá a la elución junto con los péptidos en los pasos posteriores; acondicionado, aumenta la permeabilidad del filtro.</li>
	<li>Equilibre el cartucho SPE por la adición de 1 mL de 0.1% TFA, descartar FT. repetir una vez. Asegurar que el filtro no funcione en seco después de la última etapa de equilibrado - mantener un pequeño volumen en la parte superior del filtro. Equilibrado del filtro de cartucho se realiza con el fin de preparar el filtro para retener péptidos mediante la eliminación de la sustancia hidrófoba (acetonitrilo) a la izquierda de la etapa de acondicionado.</li>
	<li>Cargar el volumen de toda la muestra (mL 10,55 para muestras no etiquetadas o 30 mL para muestras isobarically etiquetados), en varias partes si es necesario y deje los pies en residuos. Asegúrese de que el cartucho no funcione en seco entre rondas de carga de la muestra o después de que se haya cargado el último volumen de la muestra - mantener un pequeño volumen en la parte superior del filtro.</li>
	<li>Pasar 1 mL de 0.1% TFA sobre los filtros para eliminar sales y reactivos y descartar la repetición de pies de una vez. Asegúrese de que el cartucho no funcione en seco después de cada paso de lavado - mantener un volumen pequeño de líquido en la parte superior del cartucho.</li>
	<li>1.5 lugar de micro enlace bajo mL centrifugar tubos bajo el cartucho y eluir la muestra al pasar 1 mL de 84% AcN, 0.1% FA sobre el cartucho.</li>
	<li>Eliminar los solventes de la muestra de sal por evaporación en una centrífuga de vacío ejecute sin calefacción activa hasta que se seque, almacenar a-80 ° C o proceder de inmediato a fraccionamiento de alto pH.</li>
</ol>6. fase de reversa de offline alto pH HPLC muestra fraccionamiento
<ol><li>
Preparación de fases móviles acuosas de alto pH (HpH): HpH tampón A: Agua pura HpH Buffer B: 84% AcN Buffer de HpH C: 25 mM NH4OH Tampón de carga de HpH: 2,5 mM NH4OH, 2% AcN Nota: Carga de HpH tampón se utiliza como buffer de muestra y la solución de transporte</li>
	<li>Volver a disolver la muestra en 16 μl de tampón de carga de HpH por agitación suave durante 20 min.</li>
	<li>Carga 15 μl de la muestra en un sistema HPLC con un colector de fracciones internas para placas de 96 pozos profundos configurado según baño et al. 20 con alteraciones menores. Fraccionar en un flujo de 100 μl/min sobre una columna de separación pH-estable (μm 3.5 C18, 2,1 x 250 mm) y recoger una fracción por minuto sobre un gradiente lineal de 60 min.</li>
	<li>Use gradiente tiempo-lo siguiente: t = 0 min, B = 1%, C = 10%; t = 4 min, B = 1%, C = 10%, iniciar colección de fracciones; t = 76 min, B = 70%, C = 10%; colección de fracciones de final; t = 76,5 min, B = 85%, C = 10%; t = 80 min, B = 85%, C = 10%; t = 80,5 min, B = 1%, C = 10% y t = 90 min, B = 1%, C = 10%.</li>
	<li>Recoger fracciones repetitivamente en 12 pozos en un patrón circular, concatenando así fracciones separadas por 12 minutos, resultando en 12 fracciones, cada una con 6 fracciones sub concatenados.</li>
	<li>Eliminar el disolvente de muestras por centrifugación vacío a RT y 3000 rpm hasta que se seque y almacenar las muestras a-80 ° C antes del análisis por LC-MS.</li>
</ol>7. LC-MS
<ol><li>
Preparación de fases móviles acuosas: Tampón A: 0.1% FA Tampón B: FA 0.1%, 84% de AcN Tampón de carga: 0,05% TFA, 2% AcN Nota: Carga del buffer se usa como solución de transporte, tampón y fase móvil para la bomba de carga.</li>
	<li>Volver a disolver cada una de las 12 fracciones por la adición de 6 μl de tampón de carga y agitación a temperatura ambiente por 20 min</li>
	<li>Muestra de carga 5 μL en un HPLC flujo nano, en configuración de columna de trampa (columna de la trampa: 75 μm x 2 cm, C18, 100 Å tamaño de los poros, tamaño de partícula de 3 μm; columna de separación: C18, 75 μm x 500 m m, 100 Å tamaño de los poros, tamaño de partícula de 2 μm y realizar la separación del péptido con un caudal de 150 nL/min usando el siguiente gradiente: t = 0 min, B = 2%; t = 10 min, B = 2%; t = 11 min, B = 7%; t = 100 min, B = 26%; t = 170 min, B = 45%; t = 175 min, B = 80%; t = min 181, B = 2% y t = 210 min, B = 2%.</li>
	<li>
Realizar MS en el espectrómetro de masas de alta resolución híbrido conectado a la HPLC mediante una interfaz de nano-ESI. Registrar espectros de análisis completo en modo de MS en una configuración de resolución de 120.000 (2.0e5 destino AGC) sobre la gama de m/z 350-1.400.
	<ol>
<li>Operar el espectrómetro de masas en el modo de adquisición de datos dependientes, seleccione espectros MS/MS de los picos más intensos diez superior con m/z > 150 y en la intensidad gama 1.0e4-1.0e5 para análisis de iones fragmento. Aislar los iones precursores usando una ventana de aislamiento de cuadrupolo de 1 m/z, tiempo de inyección máxima de 100 ms y la lente de RF en el 60%.</li>
		<li>Aplicar exclusión dinámico con un tiempo de exclusión de 15 s y una tolerancia de ±10 ppm de m/z . Realizar la fragmentación de la energía de la colisión mayor disociación (HCD) de la célula y registrar adquisiciones MS/MS en el orbitrap en una configuración de resolución de 50.000 (valor del objetivo AGC de 5.0e4).</li>
	</ol>
</li>
</ol>8. péptido identificación
<ol><li>
Para la identificación de péptidos enviar los archivos .raw resultantes de los análisis de espectrometría de masa para un motor de búsqueda de proteómica aplicando los siguientes valores: Nota: En nuestro anterior estudio15, tres motores de búsqueda; Mascota v2.4, Sequest HT y picos v7.5 fueron utilizados en paralelo y la configuración especificada aquí trabajaban los tres motores de búsqueda, a menos que se especifique lo contrario. La mayoría de los ajustes es universal para la identificación de péptidos/proteínas y debe tener valores correspondientes en cualquier motor de búsqueda determinado. Selector de espectro: Precursor de mínima masa: 350 Da Max. precursor de masa: Da 5.000 Tipo de exploración: completo Umbral de señal/ruido: 1,5 Búsqueda de base de datos de secuencia Base de datos: UniProt_SwissProt [version2015_11] Taxonomía: Homo sapiens Enzima: ninguno Max. faltaron las divisiones: 0 Instrumento (mascota solamente): ESI-trampa Longitud mín. de péptido (SequestHT solamente): 6 Max. longitud del péptido (SequestHT solamente): 144 Tolerancia total de precursor: 15 ppm Fragmento de la tolerancia de masa: Da 0.05 Modificaciones estáticas: Carbamidomethyl (C); [Si la identificación] TMT10plex (N-Term) Modificaciones dinámicas: oxidación (M); [Si la identificación] TMT10plex (K) Péptido-espectro coincide con validador (PSM) Percolador (mascota y Sequest HT sólo) o fusión de señuelo (solo los picos) Objetivo FDR: 0.01 Validación basada en: valor de q</li>
</ol>

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<li>Moglich, A., Krieger, F., Kiefhaber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+for+the+effect+of+urea+and+guanidinium+chloride+on+the+dynamics+of+unfolded+polypeptide+chains%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular basis for the effect of urea and guanidinium chloride on the dynamics of unfolded polypeptide chains.</a> J Mol Biol. 345 (1), 153-162 (2005).</li>
<li>Hölttä, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Integrated+Workflow+for+Multiplex+CSF+Proteomics+and+Peptidomics+Identification+of+Candidate+Cerebrospinal+Fluid+Biomarkers+of+Alzheimer%E2%80%99s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">An Integrated Workflow for Multiplex CSF Proteomics and Peptidomics Identification of Candidate Cerebrospinal Fluid Biomarkers of Alzheimer’s Disease.</a> J Proteome Res. 14 (2), 654-663 (2014).</li>
</ol>

No hay intereses contrapuestos, financieros o de otros, entre los autores se han divulgado.

La introducción de un alto pH RP HPLC fraccionamiento previo paso a un protocolo previamente desarrollado para la recuperación de péptidos endógenos de ultrafiltración de peso molecular11 reducción de la complejidad relativa de la muestra y lo permitido para una 5 veces mayor volumen de muestra a ser estudiada. Esto, a su vez, incrementó la concentración del subconjunto de péptidos presentes en cada fracción y así mejora las posibilidades de detectar péptidos abundantes bajas.
<p class="jove_c...

Biomarcadores en líquido cefalorraquídeo (LCR) están transformando actualmente investigación en enfermedades neurodegenerativas. En la enfermedad de Alzheimer, el trastorno neurodegenerativo más común, afectando a más 60 millones de personas en todo el mundo1,2, un trío de biomarcadores de la beta amiloide péptido, estabilización de microtúbulos de proteína tau y un fosforilados forma de tau, puede detectar la enfermedad con alta sensibilidad y especificidad y ha sido incluido en los criterios de investigación diagnóstica3. En otras enfermedades neurodegenerativas como la enfermedad de Parkinson y esclerosis múltiple, estudios proteómicos han identificado a numerosos candidatos de biomarcadores, algunas de las cuales actualmente están siendo evaluados en estudios clínicos4,5 ,6.
Junto a las proteínas, CSF también contiene una gran cantidad de péptidos endógenos7,8,9,10,11,12. Que constituyen productos de escote de muchas proteínas derivado del cerebro, estos péptidos también representan una fuente potencialmente importante de biomarcadores de la enfermedad. Para aumentar el inventario de péptidos endógenos identificados en LCR humana y permiten análisis de endopeptidomic de la CFS en estudios clínicos, se desarrolló un método para la preparación de la muestra y el análisis por LC-MS (un esquema breve protocolo ha sido incluido en la figura 1 ). La aplicación de este método en un estudio reciente resultó en la identificación de péptidos endógenos casi 16.400 del CSF en muestras de CSF combinadas de varios individuos de diagnósticos no específicos, ampliando el conocido endopeptidome de CSF diez veces13. El método puede utilizarse opcionalmente junto con enfoque etiquetado isobárica para la cuantificación.
Preparación de la muestra
La fuente principal de la masa de proteína en LCR es los componentes del plasma (albúmina e inmunoglobulinas) pasar por encima de la sangre cerebral barrera14,15. Su abundancia alta dificulta la detección de componentes de la muestra bajo abundante, derivado del cerebro. Péptidos endógenos pueden ser fácilmente separados de las proteínas alto abundante, lo que permite un mayor volumen de extracto de péptido CSF a utilizarse para el análisis de LC-MS, lo que permite la detección de péptidos inferior abundante.
En el protocolo presentado aquí, filtración de peso molecular (MWCO) de corte sirvió para separar los péptidos de la CSF de la fracción de proteína; un método que se ha utilizado en varios anteriores estudios8,9,10,11,12,16. El paso de filtración fue seguido por un paso de fraccionamiento anterior RP HPLC offline realizado sobre un gradiente de fase móvil de alto pH. Realizando dos pasos RP HPLC en tándem, con el pH siendo la principal distinción, la diferencia en selectividad entre los dos pasos resulta principalmente de la retención de péptidos alterados como consecuencia de Estados de carga distintos péptidos. La solicitud de fraccionamiento antes de péptidos de alto pH antes de LC-MS en condiciones ácidas ha demostrado ser eficaz en el aumento de péptidos identificación17,18e incluso a ser superior para este fin en complejo biológico muestras en comparación con más separación orthogonal modos19, como fuerte gato-ion exchange (SCX) y RP20. Para acortar el tiempo de análisis, se utilizó un esquema de concatenación, puesta en común cada fracción 12th (p. ej., fracciones 1, 13, 25, 37 y 49), que debido a la alta energía de RP HPLC todavía en gran medida evita la elución de péptidos de diferente fracciones en el LC-MS paso20,21.
Identificación de péptidos
Identificación del péptido en peptidomic estudios difiere de estudios proteómicos en que ninguna hendidura de la enzima se puede especificar en la búsqueda de la base de datos, y como consecuencia, las tasas de identificación son generalmente más bajo11. Un reciente estudio13 demostró que las tasas de identificación de péptidos endógenos obtenidos con Sequest y mascota mejoraron sustancialmente cuando el valor por defecto que el algoritmo del programa respectivo se modificó mediante la puntuación de adaptación algoritmo de percolador, indicando que algoritmos de puntuación óptima para péptidos endógenos se diferencian de la de péptidos trípticos13. En ese estudio, identificación basada en la secuenciación de novo de péptidos automático utilizando el software de picos (BSI) fue encontrado para ser complementario a los motores de búsqueda basada en huellas digitales dos fragmento iones, resultando en un conjunto mayor de identificados péptidos.

<table><tbody><tr><td>&nbsp; 1 M bicarbonato de trietilamonio</td><td>Fluka, Sigma-Aldrich</td><td>17902-100ML</td><td>TEAB</td></tr><tr><td>&nbsp; 8 M Clorhidrato de guanidinio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7294-100ML</td><td>GdnHCl</td></tr><tr><td>Clorhidrato de tris(2-carboxietil)fosfina</td><td>Pierce</td><td>20490</td><td>TCEP</td></tr><tr><td>Yodoacetamida</td><td>SIGMA</td><td>I1149-5G</td><td>IAA</td></tr><tr><td>Hidroxilamina 50% (p/p)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>457804-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo, Far UV, HPLC grado de gradiente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>271004-2L</td><td>AcN</td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Fluka, Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>56302-1mL-F</td><td>FA</td></tr><tr><td>Ácido trifluoroacético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508-10AMP</td><td>TFA</td></tr><tr><td>Solución de hidróxido de amonio</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>30501-1L-1M</td><td>NH4OH</td></tr><tr><td>Unidad de filtro centrífugo Amicon Ultra-15 con membrana Ultracel-30</td><td>Filtro Merck Millipore</td><td>UFC903024</td><td>MWCO</td></tr><tr><td>Sep-Pak C18, 100 mg</td><td>Aguas</td><td>WAT023590</td> columna <td>SPE</td></tr><tr><td>Resprep Colector SPE de 12 puertos&nbsp;</td><td>Restek</td><td>26077</td><td>Colector de vacío</td></tr><tr><td>TMT10plex Juego de reactivos de etiquetas isobáricas</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>90110</td><td>TMT10plex</td></tr><tr><td>UltiMate 3000 RSLCnano LC System</td><td>Dionex</td><td>5200.0356</td><td>Separación de muestras en línea</td></tr><tr><td>Ultimate 3000 RPLC Sistema binario de separación rápida</td><td>Dionex</td><td>IQLAAAGABHFAPBMBEZ</td><td>Fraccionamiento de alto pH fuera de línea</td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion Tribrid espectrómetro de masas</td><td>Thermo Scientific</td><td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td><td>Espectrómetro de masas para el análisis de muestras</td></tr><tr><td>Proteome Discoverer 2.0&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>IQLAAEGABSFAKJMAUH</td><td>Plataforma de búsqueda de proteómica</td></tr><tr><td>Mascot v2.4</td><td>Matrix Science</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Motor de búsqueda de proteómica</td></tr><tr><td>Sequest HT</td><td>Thermo</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Motor de búsqueda de proteómica</td></tr><tr><td>PICOS v7.5&nbsp;</td><td>Soluciones Bioinformáticas Inc.)</td><td>&nbsp;-&nbsp;</td><td>Motor de búsqueda de proteómica</td></tr><tr><td>Aclamar PepMap 100, 75 y micro; m x 2 cm, C18, 100 y Aring; tamaño de poro, 3 y micro; m tamaño de partícula</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>164535</td><td>Columna de trampa (nano HPLC)</td></tr><tr><td>Acclaim PepMap C18, 75 y micro; m x 500 mm, 100&Aring; tamaño de los poros,&nbsp; 2 y micro; m tamaño de partícula</td><td>Thermo Fisher Scientific</td> Columna de separación de <td>164942</td><td>(nano HPLC)</td></tr><tr><td>Savant SpeedVac Concentradores de alta capacidad</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SC210A-230</td><td>SpeedVac/Concentrador</td></tr><tr><td>de vacío XBridge Peptide BEH C18 Columna, 130&Aring;, 3.5 &micro; m, 2,1 mm X 250 mm</td><td>Columna</td><td>de separación de</td> aguas <td>186003566 (micro HPLC)</td></tr></tbody></table>

preparación de muestras para análisis de endopeptidomic en el líquido cefalorraquídeo humano

Sample Preparation for Endopeptidomic Analysis in Human Cerebrospinal Fluid

Este protocolo describe un método para identificar péptidos endógenos en humanos del líquido cerebroespinal (CFS). Para ello, un método previamente desarrollado basado en la filtración de peso molecular (MWCO) de corte y análisis de espectrometría de masa fue combinado con un paso de fraccionamiento la HPLC fase inversa de alto pH fuera de línea.
Secreción en LCR es la principal vía para la eliminación de moléculas de arrojar por las células del sistema nervioso central. Así, muchos procesos en el sistema nervioso central se reflejan en el LCR, haciéndola un líquido valioso de diagnóstico. CSF tiene una composición compleja, que contiene proteínas que abarcan un rango de concentración de 8-9 órdenes de magnitud. Además de proteínas, estudios anteriores han demostrado también la presencia de un gran número de péptidos endógenos. Mientras menos estudiado que las proteínas, estas también pueden tener interés potencial como biomarcadores.
Péptidos endógenos se separaron del contenido de proteína del CSF a través de filtración MWCO. Quitando la mayoría del contenido proteínico de la muestra, es posible aumentar el volumen de la muestra estudiada y así también el importe total de los péptidos endógenos. La complejidad de la mezcla filtrada péptido fue abordada mediante la inclusión de una fase inversa paso de fraccionamiento antes de HPLC (RP) a un pH alcalino antes el análisis por LC-MS. El fraccionamiento fue combinado con un esquema simple concatenación donde 60 fracciones se agruparon en 12, consumo de tiempo de análisis así podría reducirse evitando en gran parte la elución.
Identificación de péptidos automatizada fue realizada usando programas de software de identificación de tres diferentes péptidos/proteínas y posteriormente combinar los resultados. Los diferentes programas fueron complementarios más que comparable con menos del 15% de las identificaciones comprometidos entre los tres.

El método aquí descrito ha sido aplicado y evaluado en tres estudios antes de la introducción de fraccionamiento de la muestra (tabla 1). El primer estudio utilizado LC offline para detectar fracciones de CSF en una placa de destino de MALDI y dio lugar a péptidos endógenos identificados 73011. En los dos estudios siguientes, etiquetado isobárica se empleó. Principalmente en un control de caso de estudio para la identificación y caracterización de potenciales biomarcadores en el CSF endopeptidome ...

Se presenta un método para el análisis de espectrometría de masa de péptidos endógenos en humanos del líquido cerebroespinal (CFS). Por medio de filtración de corte de peso molecular, fraccionamiento la cromatografía, análisis de espectrometría de masa y una posterior combinación de estrategias de identificación de péptidos, fue posible ampliar la peptidome CSF conocido casi diez veces en comparación con a estudios previos.

Preparación de muestras para análisis de Endopeptidomic en el líquido cefalorraquídeo humano

This protocol describes a method developed to identify endogenous peptides in human cerebrospinal fluid (CSF). For this purpose, a previously developed ...

El objetivo de este protocolo es preparar y analizar muestras de líquido cefalorraquídeo humano para el análisis por LC-MS de péptidos endógenos. Un paso de prefraccionamiento de péptidos previo a la LC-MS aumenta el número de péptidos identificados y permite la detección de péptidos del LCR de abundancia relativamente baja. Los péptidos endógenos en el LCR son moléculas de calcio que no han sido ampliamente exploradas y que potencialmente podrían incluir nuevos biomarcadores importantes de trastornos neurodegenerativos. Este método permite una caracterización extensa del peptidoma del LCR mediante espectrometría de masas. Las principales ventajas de este método son que permite la inyección de péptidos del LCR de baja abundancia y es compatible con técnicas de etiquetado isobárico multiplex, lo que lo hace aplicable para estudios clínicos. Hasta ahora, hemos aplicado principalmente este método al análisis del líquido cefalorraquídeo. Sin embargo, contamos con datos preliminares que indican que, con modificaciones menores, también puede utilizarse para el análisis de muestras de plasma y tejidos. Comience descongelando alícuotas de 1,5 mililitros de LCR a temperatura ambiente en un

sample-preparation-for-endopeptidomic-analysis-human-cerebrospinal

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Archivo formol fija y embebidos en parafina (FFPE) muestras clínicas son un material valioso para la investigación de enfermedades. Aquí se demuestra un flujo de trabajo de preparación de muestras permite el análisis en profundidad proteómico de tejidos FFPE microdissected.

Proteómica Preparación de muestras de formol fija y embebidos en parafina de tejidos

Se describe un protocolo de PCR en tiempo real para perfilar microRNAs en el líquido cefalorraquídeo (LCR). Con la excepción de los protocolos de extracción de ARN, el procedimiento se puede extender a ARN extraído de otros fluidos corporales, células cultivadas o muestras de tejido.

Líquido cefalorraquídeo MicroRNA perfiles utilizando cuantitativa en tiempo real PCR

Un protocolo de extracción de proteína común utilizando tampón de urea / tiourea / SDS para el tejido cerebral de ratones humana y permite indentification de proteínas mediante 2D-DIGE y su posterior caracterización en mini inmunotransferencia 2DE. Este método le permite a uno obtener resultados más reproducibles y fiables a partir de biopsias humanas y modelos experimentales.

La proteína obtenida de cerebro de Consenso, protocolo de extracción para el Estudio de los Derechos Humanos y murino cerebro proteoma Uso de ambas 2D-DIGE y Mini 2DE Immunoblotting

Se describe un alto rendimiento, múltiplex, y el ensayo de líquido cefalorraquídeo proteómica dirigida (CSF) desarrollado con potencial para la traducción clínica. La prueba se puede cuantificar marcadores potenciales y factores de riesgo para la neurodegeneración, tales como las variantes de la apolipoproteína E (E2, E3 y E4), y medir su expresión alélica.

Un alto rendimiento, multiplexado y dirigida proteómico CSF ​​ensayo para cuantificar neurodegenerativas Biomarcadores y apolipoproteína E isoformas Estado

Caracterización del proteoma de camas microvasculares oculares es fundamental para la profunda comprensión de muchas patologías oculares en los seres humanos. Este estudio demuestra un método efectivo, rápido y robusto para la extracción de proteína y preparación de la muestra de pequeños vasos sanguíneos con las arterias ciliares posteriores cortas porcinas como recipientes de modelo de análisis basado en la espectrometría de masas proteómica.

Preparación de muestras para análisis de proteómica basado en la espectrometría de masa de microvasos Ocular

La caracterización espectrométrica de masas de neuropéptidos proporciona información de secuencia, cuantificación y localización. Este flujo de trabajo optimizado no solo es útil para estudios de neuropéptidos, sino también para otros péptidos endógenos. Los protocolos proporcionados aquí describen la preparación de muestras, la adquisición de EM, el análisis de EM y la generación de neuropéptidos en bases de datos utilizando LC-ESI-MS, maldi-MS spotting e imágenes MALDI-MS.

Investigación espectrométrica de masas multifacética de neuropéptidos en Callinectes sapidus

Este método de purificación bioquímica con análisis proteómico basado en espectrometría de masas facilita la caracterización robusta de los núcleos de fibrilla amiloide, lo que puede acelerar la identificación de objetivos para prevenir la enfermedad de Alzheimer.

Purificación bioquímica y caracterización proteómica de núcleos de fibrillas amiloides del cerebro

Aquí, establecemos un protocolo utilizando cantidades mínimas de secciones de tejido cerebral recién congelado y un método de centrifugación de alta velocidad accesible junto con cromatografía de exclusión por tamaño para obtener pequeñas vesículas extracelulares como fuentes de biomarcadores de microARN (miARN) para trastornos neurológicos.

Aprovechamiento del poder de las cargas de microARN en pequeñas vesículas extracelulares liberadas de secciones de cerebro humano recién congeladas 

Este protocolo de investigación describe un flujo de trabajo optimizado para la secuenciación metagenómica de nueva generación (mNGS) del líquido cefalorraquídeo. Al abordar desafíos únicos de las muestras de baja biomasa, el método permite una detección robusta de patógenos en diversos entornos de recursos, proporcionando una base versátil para aplicaciones de investigación en enfermedades neuroinfecciosas.

Secuenciación metagenómica de nueva generación del líquido cefalorraquídeo para la detección de patógenos del sistema nervioso central

El líquido ventricular cefalorraquídeo (LCR) baña las células de la corteza cerebral y neuroepitelial progenitoras durante el desarrollo temprano del cerebro del embrión. Aquí se describe el método desarrollado para aislar CSF ventricular de embriones de roedores de diferentes edades con el fin de investigar su función biológica. Además, demostramos nuestra disección cerebral cortical explantes y técnica de cultivo que permita el crecimiento de explantes con volúmenes mínimos de medio de...

Aislamiento de líquido cefalorraquídeo de embriones de roedores para su uso con disecados explantes cortical cerebral

Aprenda a preparar muestras de líquido cefalorraquídeo humano para análisis de endopeptidómica mediante espectrometría de masas con prefraccionamiento cromatográfico. Este método permite detectar péptidos de baja abundancia y expandir el peptidoma conocido, facilitando el descubrimiento de biomarcadores para trastornos neurodegenerativos.

Preparación de muestras para análisis de Endopeptidomic en el líquido cefalorraquídeo humano

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