Preparación de muestras para análisis de Endopeptidomic en el líquido cefalorraquídeo humano
4 de diciembre de 2017
Se presenta un método para el análisis de espectrometría de masa de péptidos endógenos en humanos del líquido cerebroespinal (CFS). Por medio de filtración de corte de peso molecular, fraccionamiento la cromatografía, análisis de espectrometría de masa y una posterior combinación de estrategias de identificación de péptidos, fue posible ampliar la peptidome CSF conocido casi diez veces en comparación con a estudios previos.
El objetivo de este protocolo es preparar y analizar muestras de líquido cefalorraquídeo humano para el análisis de LC-MS de péptidos endógenos. Un paso de prefraccionamiento de péptidos antes de la LC-MS aumenta el número de péptidos identificados y permite la detección de péptidos CSF de abundancia relativamente baja. Los péptidos endógenos en el LCR son moléculas de calcio que no se han explorado ampliamente y que potencialmente pueden incluir nuevos biomarcadores importantes de trastornos neurodegenerativos. Este método permite una caracterización exhaustiva del peptidomo del LCR mediante espectrometría de masas. Las principales ventajas de este método son que permite la inyección de péptidos de LCR de baja abundancia y es compatible con las técnicas de marcaje isobárico multiplex, por lo que es aplicable para estudios clínicos. Hasta ahora hemos aplicado este método principalmente al análisis del líquido cefalorraquídeo. Pero tenemos datos preliminares que indican que, con pequeñas modificaciones, también se puede utilizar para el análisis de muestras de plasma y tejido. Comience descongelando 1,5 mililitros de líquido cefalorraquídeo a temperatura ambiente en una batidora de rodillos. Una vez descongelado, transfiera el contenido a tubos de polipropileno de 10 mililitros. Y agregue 80 microlitros de un molar TAB como agente tampón. A continuación, añada 0,65 mililitros de un clorhidrato de guanidinio de ocho molares para disolver los agregados de proteínas y el vórtice suavemente a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, a 60 microlitros de TCEP acuoso de 200 milimolares, e incubar a 55
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Descripción general
Este estudio presenta un método para el análisis espectrométrico de masas de péptidos endógenos en el líquido cefalorraquídeo humano (LCR). Mediante el uso de filtración por corte de peso molecular, prefraccionamiento cromatográfico y análisis espectrométrico de masas, la investigación amplía significativamente el peptidoma del LCR conocido, mejorando la identificación de péptidos de baja abundancia que podrían servir como biomarcadores para trastornos neurodegenerativos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Espectrometría de masas
- Descubrimiento de biomarcadores
Antecedentes
- Los péptidos endógenos en el LCR tienen un potencial significativo en la identificación de trastornos neurodegenerativos.
- Los péptidos del LCR de baja abundancia no han sido ampliamente estudiados.
- Los métodos existentes han proporcionado datos limitados sobre el peptidoma del LCR.
Objetivo del estudio
- Mejorar la identificación y caracterización de péptidos endógenos en el LCR humano.
- Proporcionar una visión más completa del peptidoma del LCR.
- Explorar el potencial de nuevos biomarcadores en condiciones neurodegenerativas.
Métodos Utilizados
- Espectrometría de masas con prefraccionamiento de muestras de LCR.
- Incluye descongelación y procesamiento de alícuotas de 1,5 mililitros de LCR con reactivos específicos.
- Compatible con técnicas de etiquetado isobárico multiplex.
- Puede adaptarse para el análisis de muestras de plasma y tejido con modificaciones menores.
Resultados principales
- El método permite la detección de un número significativamente mayor de péptidos en comparación con estudios previos.
- Los hallazgos clave indican la presencia de péptidos de baja abundancia que no habían sido explorados previamente.
- Proporciona información que podría conducir al descubrimiento de nuevos biomarcadores.
Conclusiones
- Este estudio demuestra un enfoque eficiente para caracterizar el peptidoma del LCR.
- La versatilidad del método abre nuevas vías para estudios clínicos sobre trastornos neurodegenerativos.
- Implicaciones potenciales para comprender los mecanismos neuronales e identificar marcadores de enfermedad.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método mejora la detección de péptidos endógenos de baja abundancia en el líquido cefalorraquídeo humano, un biofluido clave para el descubrimiento de biomarcadores de enfermedades neurodegenerativas. Al reducir la complejidad proteica mediante fraccionamiento con membranas de corte molecular (MWCO) y mejorar la cobertura de péptidos mediante prefraccionamiento por RP-HPLC a pH elevado, aumenta la sensibilidad analítica para los esfuerzos de validación de objetivos terapéuticos. El enfoque facilita la reducción del riesgo mecanicista al permitir un perfilado más profundo del peptidoma, lo que puede orientar la confianza temprana en objetivos terapéuticos y la selección de biomarcadores predictivos en programas de descubrimiento de fármacos para el sistema nervioso central.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la interrogación de poblaciones endógenas de péptidos que reflejan procesos fisiopatológicos del sistema nervioso central, apoyando la prueba de hipótesis sobre dianas terapéuticas.
- Valor operativo: Reduce la interferencia del rango dinámico causada por las proteínas abundantes en el LCR, mejorando la detección de péptidos señalizadores de bajo nivel relevantes para la modulación de vías.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Genera patrones reproducibles de fraccionamiento de péptidos que permiten lecturas consistentes mediante LC-MS/MS para la estandarización de ensayos.
- Valor operativo: Compatible con etiquetado isobárico multiplex, lo que permite el análisis comparativo del peptidoma entre cohortes de enfermedad y controles en flujos de trabajo de cribado de biomarcadores.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Facilita el descubrimiento de biomarcadores al identificar péptidos derivados del LCR que podrían correlacionarse con los mecanismos de enfermedades neurodegenerativas.
- Valor operativo: Adaptable a muestras de plasma y tejidos con modificaciones menores, lo que permite la validación cruzada de muestras en procesos de traslación.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en la fase inicial del descubrimiento, apoyando la exploración hipótesis-dirigida del peptidoma antes de las etapas de identificación de candidatos y validación preclínica.
- Biología del Descubrimiento: Apoya el perfilado sin sesgo de péptidos endógenos para aclarar las vías asociadas a enfermedades y reducir los riesgos en la selección de dianas.
- Detección: Permite la identificación de péptidos con alta confianza mediante la reducción de la complejidad de la muestra y una mejor separación cromatográfica.
- Análisis: Genera datos cuantitativos de péptidos resueltos por fraccionamiento, compatibles con multiplexación basada en etiquetas para estudios comparativos.
- Investigación Traducional: Proporciona una base para la alineación de biomarcadores al vincular los cambios en el peptidoma del LCR con procesos neurodegenerativos.
- Reutilización Empresarial: El flujo de trabajo principal—filtración por límite de peso molecular (MWCO), fraccionamiento a pH elevado y LC-MS—puede estandarizarse entre laboratorios para obtener análisis reproducibles del peptidoma.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta el rendimiento de identificación de péptidos y permite la detección de especies de baja abundancia que pueden servir como indicadores mecanicistas o de estado de enfermedad.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante la prefraccionamiento estandarizado y reduce la variabilidad técnica en el análisis de biofluidos complejos.
- Valor estratégico: Potencia la confianza en las decisiones durante la validación de dianas al ampliar el espacio biológico observable en el LCR.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización de biomarcadores ajustada al riesgo mediante una cobertura más amplia del peptidoma y una detección de señales mejorada.
Consideraciones de Implementación
- Se requiere experiencia en el manejo de LCR, inhibición de proteasas y peptidómica basada en espectrometría de masas.
- El instrumental debe incluir sistemas de CL-EM/EM capaces de compatibilidad con fraccionamiento a pH alto y detección sensible de péptidos.
- La estandarización entre sitios requiere selección consistente de filtros MWCO, concatenación del fraccionamiento y parámetros de identificación basados en software.
- La adaptación al plasma o tejido exige optimizar las condiciones de lisis, agotamiento y fraccionamiento para tener en cuenta la complejidad matricial diferente.
- Las limitaciones prácticas incluyen la posible pérdida de péptidos durante la filtración y la necesidad de un control cuidadoso de contaminación debido al análisis de objetivos de baja abundancia.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Title
1:12
Pre-treatment of Bulk Volume CSF without Quantification
2:24
Pre-treatment of Small Volume CSF Samples with Isobaric Labeling
4:00
MWCO Filtration, Desalting, and Sample Clean-up by Solid Phase Extraction
6:00
Offline High-pH Reverse Phase HPLC Sample Fractionation
7:09
LC-MS Analysis
7:47
Results: Peptide Identification After LC-MS Analysis
9:13
Conclusion
