Name: Radiación acelerada Biodosimetry automática por identificación del cromosoma dicéntrico (ADCI) y estimación de dosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprende a estimar dosis de radiación biológica mediante el software ADCI que automatiza la detección de cromosomas dicéntricos en imágenes de células en metafase. Esta herramienta acelera significativamente el análisis de biodosimetría.

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Agradecemos a Dr. Ruth Wilkins, Radiobiología y protección en salud de Canadá y Farrah Flegal, laboratorios nucleares canadienses y su personal de laboratorio para el acceso a los datos de imagen de metafase de los laboratorios de citogenética biodosimetry. Este trabajo fue apoyado por un contrato de construcción en Canadá programa de innovación para CytoGnomix (no. de serie EN579-172270/001/SC). La versión inicial de la ADCI y desarrollo de algoritmos fueron apoyados por el fondo de innovación occidental; las ciencias naturales y Consejo de investigación de ingeniería de Canadá (NSERC Discovery Grant 371758-2009); Servicio de salud pública de los Estados Unidos (DART-dosis CMCR, 5U01AI091173-0); la Fundación Canadiense para la innovación; Cátedras de investigación de Canadá y CytoGnomix Inc.

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PKR y JHMK cofundó CytoGnomix, que es comercialización de ADCI y posee patentes relacionadas. YL y BCS son empleados de CytoGnomix. ADCI es registrado y patentado el método de localización del centrómero en ADCI (nos Pat. No. 8.605.981; Pat de alemán. Núm. 112011103687).

Posibilidades y limitaciones del software
El protocolo descrito en este artículo presenta el procedimiento paso a paso típico utilizado en ADCI para importar y procesar imágenes citogenéticas metafase, crear radiación curvas de calibración y estimar dosis biológicas en individuos o muestras expuestas a desconocido niveles de radiación. Sin embargo, no es necesario llevar a cabo estas instrucciones secuencialmente. Por ejemplo, muchas muestras de la prueba de dosis desconocida pueden ser procesadas y analizan usando la misma curva de calibración de las. Además, una vez finalizado el proceso, la selección de la imagen y DC filtrado de modelos pueden ser iterado por el usuario. Aplicación de un modelo de selección de imagen apropiada depende de las características y calidad de los datos de imagen de metafase, que a su vez se basa en el protocolo de laboratorio utilizado para preparar las células y los criterios de rigor utilizados para seleccionar las celdas con automatizado sistemas de captura de metafase. Morfologías cromosoma diferirá entre biodosimetry y laboratorios de citogenéticos, y por lo tanto, los modelos de selección de imagen deben ser evaluados por el usuario para determinar si los modelos de selección de imagen predefinidos suministrados con el software serán adecuados para producir estimaciones de dosis exacta, o si custom modelos con definidas por el usuario umbrales deben ser creado. Basándonos en nuestra experiencia, la eficacia de los modelos de selección de imagen está influenciada por la fuente y la calidad de las imágenes de la célula. Los usuarios pueden diseñar sus propios criterios de selección de imagen utilizando diferentes combinaciones de filtros para eliminar falsos positivos DCs modelos de selección de imagen y los correspondientes valores de umbral para seleccionar imágenes que desee. Hay flexibilidad en la entrada de las curvas de calibración y estimación de la dosis, como coeficientes de la curva lineal cuadrática y de frecuencias de DC pueden ser modificados o introducidos manualmente.
Aunque el software es completamente automatizado, imágenes pueden ser manualmente revisadas y seleccionadas. Esta capacidad está disponible para incluir o eliminar imágenes procesadas individualmente a través de la función de visor del microscopio en el GUI principal. Sin embargo, debido a la automatización, el software es significativamente más eficiente en comparación con el manual de puntuación de las imágenes de la metafase y contando DCs. Una muestra compuesta de 1000 imágenes puede procesarse en 20 (tiff) a 40 minutos (jpg) en una estación de trabajo rendimiento de núcleos múltiples. Este software será particularmente útil en situaciones de tiempo crítico o mano de obra intensiva, como los eventos en que varios individuos han estado expuestos o se sospecharon que han sido expuestos a la radiación, o donde tiempo-sensible el diagnóstico y tratamiento las decisiones son fundamentales.
Detección precisa y exacta de alto rendimiento de DCs, así como estimación de la dosis son necesarios para la evaluación de la radiación sin vigilancia. Otras alternativas disponibles para el software no cumplen con estos requisitos. Un análisis citogenético asistida de usuario, basados en imágenes (DCScore, Metasystems17) sistema requiere verificación manual de DCs de candidato, debido a un error alta tasa atribuible a sin corregir solapamientos entre los cromosomas y el sistema no determina dosis de radiación. DCScore no sería tan eficaz como la ADCI en un acontecimiento de la radiación que implica a un gran número de personas potencialmente expuestas. Sistemas de abertura grande microscopio pueden recoger imágenes de múltiples células de la metafase18, sin embargo, ellos no analizarlos. "CABAS"19 y "Estimar la dosis"20 software pueden generar calibración curvas y estimación de la dosis, pero no score DCs. Otros ensayos de biodosimetry que no se basan en el análisis DC incluyen H2AX fluorescencia, fluorescencia en situ hibridación con ADN sondas dirigidas a ciertos cromosomas, genes, ensayo del micronúcleo y orina y respiratorio. Estos métodos son menos específicos y sensibles para radiaciones ionizantes, pueden ser más costosos, en algunos casos, son más lentos y generalmente no se han estandarizado a través de varios laboratorios de referencia. La mayoría de estas técnicas no detectan radiación estable de respuestas, por lo que no se puede utilizar para la evaluación de largo plazo (&#62; post exposición de 7 días) de dosis de radiación. Por el contrario, esto puede evaluar a personas hasta a la exposición después de 90 días y puede procesar datos de cualquier microscopio de laboratorio de citogenética sistema de imagen. Sin embargo, si se extrae una muestra de &#62; 4 semanas posterior a la exposición, sensibilidad se reduce debido a la decadencia de las aberraciones dicéntrico1,2,3 y el software actualmente no corregir las frecuencias de DC por los retrasos en el muestreo individuos expuestos.
Este software tiene algunas limitaciones. Modelos de selección de imagen existentes seleccione sobre todo imágenes de metafase aceptable, pero en algunos casos, no eliminar imágenes insatisfactoria, que pueden reducir la precisión en la detección de DC. Sigue siendo una pregunta abierta cómo diseñar un modelo de selección de imagen satisfactorio que elimina todas las células en metafase inadecuados. El software proporciona estimaciones precisas para las muestras expuestas a dosis más altas de radiación (≥ 2 Gy). A pesar de progresos considerables en la reducción del número de falsos positivos de DCs16, estos objetos no han sido eliminados. Reducir las células en metafase calidad en dosis bajas de radiación (especialmente &#60; 1 Gy) son más propensos a detecciones positivas falsas de la DC. Por lo tanto, las muestras de baja dosis no se incluyeron al generar la curva de calibración utilizada para la estimación de la dosis de prueba de las muestras de HC. Si se desea una curva que contiene muestras de dosis baja, un valor más bajo de la SVM Sigma reduce cuentas falsos positivas en muestras de baja dosis pero puede resultar en un menor rendimiento de DC en muestras de alta dosis. Figura 8 se compara la curva HC utilizada para la estimación de la dosis (Sigma = 1.5) con una curva de calibración ajuste con muestras adicionales de dosis baja en el valor de sigma menor de SVM (1.0). En muestras con un número insuficiente de células de la metafase o imágenes de metafase de mala calidad, no puede ser posible estimar precisamente los riesgos biológicos en dosis baja, potencialmente resultando en desviaciones de dosis físicas exceda 0,5 Gy.
El software no puede valorar con precisión los tipos de radiación Si sus curvas de dosis-respuesta mejor ajustan un modelo lineal o casi lineal. Hasta el momento, ha sido probado solamente con las muestras expuestas a rayos Gamma y X. Si se examina otra fuente de radiación, los usuarios garantizarán muestras de calibración y prueba están expuestas al mismo tipo de radiación. El software usa máxima verosimilitud o mínimos cuadrados para construir una curva dosis-respuesta utilizando un modelo lineal cuadrática. Hay actualmente ninguna opción de imponer una curva lineal estricto ajuste, apropiado para exposiciones de partículas de alta energía, sin embargo dicha funcionalidad estará disponible en el futuro.
Desarrollo futuro
Nuestros esfuerzos se centran en la mejora de modelos de selección de imagen y medición precisa de la dosis, en particular de las muestras expuestas a dosis bajas de radiación. Versiones posteriores de software proporcionará medidas de error estándar en las estimaciones de dosis e intervalos de confianza en las curvas de calibración. Además, una versión high-performance computing del software para la supercomputadora gen azul (BG/Q, IBM) está en desarrollo para la evaluación oportuna de individuos expuestos en un evento de radiación de baja masa. Algunos de los componentes del software ya han sido probados y desplegados en esta plataformaLass = "xref" &gt; 11.

Biodosimetry de radiación utiliza marcadores biológicos, sobre todo las aberraciones cromosómicas como translocaciones cromosómicas para medir dosis de radiación que las personas están expuestas a los cromosomas dicéntrico (DCs). Una dosis absorbida biológicamente puede ser diferente de la dosis física medida por instrumentos debido a la variabilidad entre individuos. Del mismo modo, la radiación de una cierta dosis física puede producir diferentes exposiciones biológicas debido a condiciones fisiológicas o ambientales subyacentes. Conocimiento de la dosis biológica es de particular importancia para el diagnóstico y tratamiento.
El ensayo de DC es el estándar de oro de la Organización Mundial de la salud (OMS) y la Agencia Internacional de energía atómica (OIEA) para evaluar la exposición a la radiación biológica en las personas. Fue el primer ensayo recomendado por el OIEA y la OMS para la evaluación de dosis de radiación. Frecuencia de CC es relativamente estable durante aproximadamente 4 semanas después de la exposición de radiación1 y su correlación cuantitativa con dosis de radiación emitida es exacta, que hacen DCs el biomarcador ideal. La relación entre la dosis de radiación (referenciados en unidades de Gray [Gy]) y la frecuencia de DC (se hace referencia como número de DCs por célula) puede expresarse como una función lineal cuadrática.
El análisis citogenético de DC ha sido el estándar industrial para unos 55 años2. Se ha realizado manualmente, requiere 1-2 días para analizar los datos del microscopio de una muestra de sangre solo. Varios cientos a varios miles de imágenes se necesitan para estimar con precisión la exposición a la radiación dependiendo de la dosis3. En dosis superiores a 1 Gy, OIEA recomienda un mínimo de 100 DCs detectarse. Examen de 250-500 imágenes de metafase es práctica común en laboratorios citogenética biodosimetry. Para muestras con exposiciones &#60; 1 Gy, 3.000-5.000 imágenes se sugieren debido a las probabilidades más bajas de formación de CC. En cualquier caso, es una tarea intensa de mano de obra.
Laboratorios de citogenética biodosimetry crean su propio en vitro curvas de calibración de biodosimetry de radiación antes de evaluar la dosis biológicas en muestras de prueba. Muestras de sangre de individuos normales, control están expuestas a la radiación y los linfocitos son cultivados y preparados para análisis de cromosomas de la metafase. Con estas muestras, biológicos dosis recibidas están calibrados a las conocida dosis físicas emitidas por una fuente de radiación estándar. Después de que se registran imágenes de la célula metafase, expertos examinan imágenes, contar DCs y calcular las frecuencias de DC para cada muestra. Una curva de calibración se construye ajustando una curva lineal cuadrática a las frecuencias de DC a todas las dosis. A continuación, expuestos en la muestra de individuos pueden inferirse comparando las frecuencias de DC a las dosis calibradas en la curva o si se especifica en la fórmula cuadrática lineal correspondiente.
Han automatizado tanto la detección de DCs y determinación para agilizar este procedimiento utilizando el software de la dosis. Identificador de cromosoma dicéntrico y dosis estimador (ADCI) utiliza técnicas de procesamiento de imágenes basado en el aprendizaje máquina para detectar y discriminar los cromosomas dicéntrico (DCs) de monocentric cromosomas (MCs) y otros objetos y automatiza la radiación estimación de dosis. El software pretende significativamente reducir o eliminar la necesidad de verificación manual de cuentas DC y para acelerar el cálculo de dosis mediante la automatización. Se ha desarrollado con la participación de los laboratorios de referencia biodosimetry en Health Canada (HC) y laboratorios nucleares canadienses (CNL). Sus comentarios se asegurarán de que rendimiento continuará satisfacer los criterios de la OIEA para este ensayo.
El software realiza las siguientes funciones: 1) filtrado DCs y seleccionando imágenes de célula metafase óptima para el análisis, reconocimiento de cromosoma 2), DC detección y determinación de frecuencia de DC y 3) estimación de la dosis de radiación de dosis calibrada, datos de radiación citogenética. Este software procesa grupos de imágenes de la metafase de la misma persona (llamados una muestra), cuenta el número de DCs en el uso de cada imagen de técnicas de procesamiento y devuelve la dosis estimada de radiación recibida por cada muestra en unidades de Grays (Gy).
El software ha sido diseñado para manejar una gama de estructuras cromosómicas, cuentas y densidades. Sin embargo, el algoritmo realiza óptimamente en imágenes de metafase que contiene un complemento completo cercano de cromosomas lineales, bien separados4. Imágenes que contienen altamente comprometidos sets de cromosomas, múltiples células, las células en metafase incompleta, hermana separación de cromátidas hermanas, núcleos, objetos no cromosómicas y otros defectos pueden reducir la precisión del algoritmo. Dedicado a modelos de selección de imagen y otros segmentación objeto umbrales pueden filtrar hacia fuera la mayoría de imágenes óptimas y DCs positivos falsos.
Detección del cromosoma dicéntrico se realiza cuando se procesa una imagen. El algoritmo intenta determinar que objetos de una imagen son los cromosomas y luego localiza las dos regiones más probables que los centrómeros de cada cromosoma. A continuación, una serie de diferentes ayuda Vector máquina (SVM) modelos de aprendizaje distinguir los cromosomas como DCs o normal, los cromosomas monocentric. Los modelos SVM difieren en sensibilidad y especificidad de detección de DC (ver paso 3.1.4 abajo), que pueden afectar a las frecuencias de DC que se determinan en una muestra.
ADCI procesos conjuntos de Giemsa (o DAPI) teñido de imágenes digitales de la metafase (en formato TIFF o JPG) para una o más muestras. El software analiza DCs en las muestras de calibración y prueba de las muestras. Las físicas dosis (Gy) de muestras de calibración son conocidos y se utilizan en la generación de una curva de calibración. Las dosis físicas y biológicas de los individuos con riesgos desconocidos se infieren por el software de la curva de calibración generada por la máquina. Aunque los laboratorios usan técnicas comparables, las curvas de calibración de diferentes laboratorios varían a menudo3. Ambas muestras de prueba y curva de calibración desde el mismo laboratorio deben ser procesados para la estimación de la dosis exacta en las muestras de prueba.
Este software ofrece velocidad, precisión y escalabilidad que direcciones la productividad necesaria para manejar un evento en el que muchos individuos simultáneamente deben ser probados. Fue desarrollado desde 2008-20174,5,6,7,8,9,10,11,12 ,13. Utilizando hardware de ordenador recientes, este escritorioSoftware de la PC puede procesar y estimación de la dosis de radiación en una muestra de 500 equivalentes de genoma de metafase en 10-20 min 4. El código se basa en un sistema de segmentación de la imagen propia y algoritmos para el análisis del cromosoma de aprendizaje de máquina. Análisis experto de cada cromosoma expuesta a radiaciones Gy 3 dieron exactitudes comparables a la ADCI. En un conjunto de 6 muestras de exposiciones desconocidas (usadas previamente en un ejercicio de competencia internacional), el software calcula dosis dentro de 0,5 Gy de los valores obtenidos mediante revisión manual de los mismos datos por HC y CNL, cumpliendo con los requisitos de la AIEA para triage biodosimetry. Además, la estandarización entre laboratorios y reproducibilidad de dosis estima beneficio de tener un DC común, automatizado algoritmo de puntuación. Sin embargo, el software permite la personalización de imagen de criterios de filtrado y selección, que permite diferencias en métodos de preparación de cromosoma y las fuentes de calibración radiación a tenerse en cuenta.
Este software es una interfaz gráfica de usuario (GUI) - sistema que analiza conjuntos de imágenes de cromosomas con Giemsa (o DAPI) - tinción las células en metafase para anomalías que resultan de la exposición a la radiación ionizante. Los sistemas de imagen digital son fotografiados con un sistema de microscopio de luz (o epifluorescente) y cada juego corresponde a una muestra diferente. El software utiliza técnicas para detectar y discriminar DCs de MCs y otros objetos de procesamiento de imágenes. Filtros de segmentación derivada empíricamente entonces automáticamente eliminan falsos positivos DCs sin afectar ciertos DCs. Finalmente, el software automáticamente filtra imágenes indeseables basados en diferentes propiedades de imagen metafase de mala calidad de imágenes con los modelos de selección de imagen de las (o especificado por el usuario). Estas imágenes incluyen aquellos que contienen excesiva o insuficiente cantidad de objetos "ruidosos", múltiples cromosomas superpuestos, imágenes faltan cromosomas de la metafase, números excesivos de la hermana chromatids4. Los datos de imagen automáticamente curado se utilizan para generar la curva de calibración de la dosis de muestras de dosis conocidas y se utilizan para estimar las exposiciones de prueba de las muestras expuesta a dosis desconocidas.
Salida del software puede ser visto y guardado como: salida 1) basada en textos vistos en la consola, 2) parcelas que pueden ser guardados como imágenes y 3) los informes en formato HTML. Muchos aspectos del software son personalizables para adaptarse a las necesidades específicas de diferentes laboratorios. Los laboratorios individuales generalmente proporcionan muestras de calibración y prueba preparados y recogidos basan en el protocolo citogenético validado en ese laboratorio. Esto mantiene la uniformidad de la preparación de la muestra y permite que las curvas de calibración generadas a partir de muestras de calibración para aplicarse significativo para poner a prueba las muestras derivadas usando el mismo protocolo. También pueden crear curvas de calibración de coeficientes de la curva o de frecuencias de DC a dosis definidas. Las estimaciones de dosis más exactas se obtienen por filtrar imágenes de calidad inferiores y DCs positivos falsos (FPs). Selección de subconjuntos de imagen óptima dentro de cada muestra se logra con 'Modelos de selección de imagen' que eliminan imágenes mediocre que tienden a introducir FPs. Una serie de modelos previamente validados se incluyen con el software, sin embargo más modelos con umbrales personalizados y filtros pueden creados y guardados, por parte del usuario.
Una vez que el software se carga correctamente, se presenta la interfaz gráfica principal de usuario (GUI) (ver figura 1). Desde esta interfaz, muestras, cada uno que consiste en una carpeta de archivos de imagen de metafase celular, puede ser seleccionado y procesada para identificar DCs, curvas de calibración pueden ser creadas y en comparación y se puede determinar la dosis de exposición de radiación de las muestras.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56245/56245fig1.jpg"> 
Figura 1: Los sectores principales de la interfaz gráfica de usuario incluir: una lista de las muestras (1), una lista de calibración de las curvas (2), el proceso de cola (3), que controla el estado de detección de DC en cada conjunto de imágenes de cada muestra, una parcela pantalla (4), que resume la estadísticas u otras propiedades cuantitativas de un conjunto de imágenes de muestras o curvas de calibración y una consola (5) que contiene un texto descriptivo como salidas de cada operación realizada por el programa. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56245/56245fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>El</td> software <td>CytoGnomix</td><td>NA</td><td>ADCI se publica en un archivo de paquete de instalación binario para Microsoft Windows 7, 8, 8.1 y 10; se requieren 235 Mb de almacenamiento en disco para una instalación típica. El software ha sido probado con procesadores Intel o AMD x86-64; se recomienda al menos 1 Gb de RAM. Los análisis se han evaluado en un ordenador configurado con un procesador Intel I7 y 16 Gb de RAM. El funcionamiento de ADCI requiere una licencia activa y un dongle de hardware basado en USB, que debe permanecer conectado mientras se ejecuta el software. El dongle codifica la fecha de caducidad del software. Cada vez que se inicia el software, se lee esta fecha. El software permitirá el acceso al programa si la fecha y hora actuales preceden a la marca de fecha y hora de vencimiento. La extensión de una licencia de software caducada se puede lograr obteniendo un nuevo dongle o renovando la licencia con una clave actualizada al inicio.</td></tr><tr><td>Imágenes digitales de núcleos celulares en metafase</td><td>Ejemplos: Metasistemas, Leica Microsystems</td><td>M-Search (Metasistemas), Cytovision (Leica) software</td><td>Formato TIFF de alta resolución; normalmente >250 imágenes digitales generadas con un sistema de captura de imágenes de microscopio (objetivo de aumento mínimo de 63X, aumento ocular de 10X).</td></tr><tr><td>MSI Leopard Pro (recomendado, opcional)</td><td>Micro-Star International</td><td>MSI GP62 6QF 480CA Leopard Pro Estación</td><td>de trabajo de alto rendimiento multinúcleo.</td></tr></tbody></table>

radiación acelerada biodosimetry automática por identificación del cromosoma dicéntrico (adci) y estimación de dosis

Expedited Radiation Biodosimetry by Automated Dicentric Chromosome Identification (ADCI) and Dose Estimation

Dosis de radiación biológica puede estimarse de frecuencias dicéntrico cromosoma en las células en metafase. Realizar estos ensayos citogenéticos cromosoma dicéntrico es tradicionalmente un proceso manual intensivo no muy adecuado para manejar el volumen de las muestras que requieran examen a raíz de un evento de siniestro total. Software automatizado de identificador de cromosoma dicéntrico y dosis estimador (ADCI) automatiza este proceso al examinar conjuntos de imágenes de metafase mediante técnicas de procesado de imagen basado en el aprendizaje de máquina. La selecciona software imágenes apropiadas para análisis mediante la eliminación de imágenes inadecuadas, clasifica cada objeto como una que contiene el centrómero cromosoma o no-cromosoma, más distingue los cromosomas como los cromosomas monocentric (MCs) o dicéntrico cromosomas (DCs), determina la frecuencia de DC en una muestra y calcula la dosis de radiación biológica mediante la comparación de frecuencia de DC de muestra con las curvas de calibración computadas usando muestras de calibración. Este protocolo describe el uso del software de la ADCI. Por lo general, calibración (dosis conocida) y prueba (dosis desconocida) conjuntos de imágenes de la metafase se importan para realizar la estimación de la dosis exacta. Imágenes óptimas para su análisis se pueden encontrar automáticamente mediante filtros de imagen preestablecidos o también pueden ser filtradas a través de la inspección manual. El software procesa imágenes dentro de cada muestra y frecuencias de DC se computan en los diferentes niveles de rigor para llamar a DCs, usando una máquina de aprendizaje. Curvas de calibración lineal cuadrática se generan basados en frecuencias de DC en las muestras de calibración expuestas a dosis conocidas de físicas. Dosis de prueba de las muestras expuesta a niveles de radiación inciertas se estiman a partir de sus frecuencias de DC con estas curvas de calibración. Informes pueden ser generados bajo petición y proporcionan Resumen de los resultados de una o más muestras, de una o más curvas de calibración o de estimación de dosis.

El análisis citogenético cromosoma dicéntrico (DC) cuantifica la exposición a la radiación ionizante. El software automatizado de identificador de cromosoma dicéntrico y estimador de dosis con precisión y rápidamente calcula dosis biológica de DCs en las células en metafase. Distingue los cromosomas monocentric y otros objetos de DCs y calcula la dosis de radiación biológica de la frecuencia de DCs.

Radiación acelerada Biodosimetry automática por identificación del cromosoma dicéntrico (ADCI) y estimación de dosis

Biological radiation dose can be estimated from dicentric chromosome frequencies in metaphase cells. Performing these cytogenetic dicentric chromosome ...

El objetivo general de este protocolo basado en software es estimar con precisión y rapidez la dosis biológica de radiación en todo el cuerpo a partir de cromosomas dicéntricos encontrados en conjuntos de imágenes de células en metafase filtradas automáticamente, utilizando técnicas de procesamiento de imágenes basadas en aprendizaje automático. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la respuesta ante un evento de exposición masiva a la radiación. Será necesario examinar oportunamente un gran número de muestras para determinar la dosis de radiación.La principal ventaja de este software es la automatización del filtrado de imágenes, la generación de curvas de calibración, la detección de cromosomas dicéntricos y la estimación de la dosis de radiación. Estas son tareas que tradicionalmente consumen mucho tiempo y requieren gran esfuerzo manual. Aunque este método puede proporcionar información sobre la biodosimetría citogenética por radiación, también podría aplicarse para seleccionar las mejores imágenes cromosómicas para los análisis diagnósticos de enfermedades genéticas hereditarias y adquiridas.Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando comenzamos a desarrollar métodos de análisis de imágenes cromosómicas para puntuar automáticamente la fluorescencia dentro de dos imágenes de hibridación. Colegas habían indicado que la capacidad actual para probar a múltiples individuos expuestos también era muy limitada. Abra el software y cree una nueva muestra desde el menú.Luego, seleccione la carpeta que contiene las imágenes de metafase para analizar. En el aviso, proporcione un ID único para identificar la muestra. Solo se pueden usar caracteres alfanuméricos, guiones bajos y guiones.Luego, proporcione una descripción de la muestra si lo desea. Repita este proceso para agregar conjuntos adicionales de imágenes de muestras. Se requiere un mínimo de tres conjuntos de muestras de calibración para el análisis, pero utilice siete o más para obtener buenos resultados.Deben abarcar desde cero hasta cinco grays de exposición a la radiación. Una vez cargadas todas las muestras, selecciónelas en la lista de muestras y añádalas a la cola de procesamiento. Luego, procese todas las muestras para identificar diversas propiedades dentro de cada imagen.Se muestra el progreso del procesamiento. Una vez que el procesamiento haya finalizado, haga clic en la marca de verificación verde y guarde las muestras procesadas como archivos de muestra. Antes de continuar, es recomendable visualizar las imágenes procesadas en el Visor de Imágenes de Metafase.Destaque las muestras de la lista y abra el visor. Luego, navegue a través de las imágenes. Dentro del visor de imágenes, se pueden aplicar filtros.Varios modelos de selección de imágenes se incluyen con el software. El filtrado analizará las propiedades identificadas durante el procesamiento. Si se desea, se puede crear un modelo personalizado desde cero y guardarlo para su uso repetido.Si se utiliza el Asistente de calibración de curvas descrito en la siguiente sección, el modelo se aplica durante ese paso. Utilice el Asistente de calibración de curvas para analizar los archivos de muestras del proceso. Para un buen ajuste de la curva, incluya al menos siete muestras de calibración desde cero hasta cinco grises.En la primera página del asistente de macro, marque con una casilla cada muestra de calibración deseada. Para cada muestra de calibración, especifique la dosis de radiación en el campo de texto adyacente. En la página siguiente, seleccione un modelo preestablecido de selección de imagen.En la página siguiente, seleccione un valor de Sigma SVM desde el cuadro desplegable. Se recomienda un valor de 1.4 o 1.5 para estimaciones de dosis mayores a un gray. De lo contrario, utilice un valor de 1.0.En la página final, revise todas las opciones seleccionadas. Si parecen correctas, finalice el proceso de selección. Ahora aparecerá un cuadro de diálogo predefinido para crear una curva.Especifique una identidad única para la curva en el cuadro de texto y luego presione Validar datos para asegurarse de que el contenido de la lista de dosis de respuesta tenga el formato correcto. Verifique que todos los campos de la lista de dosis de respuesta estén resaltados en verde, lo que indica datos válidos. A continuación, envíe los datos para su análisis utilizando el botón Aceptar y siga las indicaciones para guardar los resultados.Para realizar el análisis de estimación de dosis, inicie la macro del asistente que se encuentra en el menú de Estimación de Dosis. Primero, seleccione una curva de calibración previamente creada desde el cuadro desplegable. Sus propiedades aparecerán a continuación.En la página siguiente, active las muestras de prueba de exposición desconocida para incluirlas en la estimación de la dosis. En la página siguiente, revise la descripción y las propiedades del modelo de selección de imágenes aplicado durante la generación de la curva de calibración. Cada muestra debe analizarse utilizando el mismo modelo.Al estimar la dosis de una muestra expuesta a una cantidad desconocida de radiación, recomendamos encarecidamente aplicar a estos datos el mismo modelo de selección de imágenes que se utilizó para generar la curva de calibración de dosis. En la página siguiente, asegúrese de que el valor de Sigma SVM utilizado durante la generación de la curva de calibración complete los campos. Realice correcciones si es necesario.En la página final, revise todas las opciones seleccionadas. Si parecen correctas, finalice el proceso de selección y presione Aceptar en el cuadro de diálogo del calculador de dosis predefinido para realizar la estimación de la dosis. Los resultados de la estimación de la dosis se muestran en la consola en formato de tabla para cada muestra de prueba en grays.Junto con los datos tabulares, se mostrarán gráficos de los datos en el área de trazado. Después de introducir una muestra, preparar la curva de calibración o estimar una dosis, es recomendable generar un informe de muestra, una curva o un informe de dosis para crear un registro completo de su análisis. Ahora genere un Informe de Estimación de Dosis.Cuando se solicite, proporcione un nombre para el informe o utilice la opción de exploración para modificar una carpeta de informe existente. Las capacidades de auditoría, los problemas de integridad del archivo de registro y las opciones estadísticas se revisan en el protocolo escrito. El software se probó utilizando muestras de imágenes citogenéticas expuestas a radiación ionizante que se obtuvieron de los laboratorios de biodosimetría de Health Canada y de Canadian Nuclear Laboratories.Estas muestras fueron generadas y analizadas manualmente por expertos en ambos laboratorios. El software utilizó filtros automatizados de selección de imágenes en las muestras para eliminar una amplia variedad de imágenes no utilizables. En el ejemplo actual, las mejores 250 imágenes fueron seleccionadas automáticamente para cada muestra.C fue excluido porque contenía demasiados cromosomas superpuestos, y D tiene un número excesivo de cromátidas hermanas separadas. El software podría marcar incorrectamente algunos objetos como cromosomas dicéntricos, como el objeto dos. Esto infla los conteos de dicéntricos en las muestras.Los filtros de falsos positivos excluyen estos objetos de los cálculos de frecuencia de dicéntricos. Después del filtrado, las ocurrencias de cromosomas dicéntricos en una población de células de una muestra irradiada siguen una distribución de Poisson, en comparación con el conjunto de datos sin filtrar. Las estadísticas de bondad de ajuste de chi-cuadrado mostraron que los resultados de los datos filtrados son mucho más confiables.En última instancia, las mediciones automatizadas estuvieron dentro de 0,3 grises de las dosis puntuadas manualmente, con algunas excepciones. Una muestra que presentaba un mal ajuste a la distribución de Poisson no fue precisa. Esta era una muestra de menor calidad.Contenía demasiadas imágenes con cromosomas dicéntricos clasificados incorrectamente debido a la separación de cromátidas hermanas. Sin embargo, los resultados del análisis automatizado aún se encontraban dentro de los límites de triaje especificados por el OIEA. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar el software para seleccionar automáticamente imágenes óptimas mediante modelos de selección de imágenes, crear curvas de calibración, realizar la detección automatizada de cromosomas dicéntricos en la estimación de dosis de radiación y generar informes.Una vez dominada, esta técnica puede estimar la dosis de una muestra que contiene 500 imágenes de metafase en de 10 a 20 minutos a partir de un conjunto existente de imágenes de células en metafase. Es importante recordar hacer uso de la funcionalidad automatizada que proporciona el software. Es posible la selección manual de imágenes.Sin embargo, hacerlo reduce la eficiencia y puede no ser tan reproducible como los procedimientos automatizados. Esta técnica permitirá a los investigadores en el campo de la biodosimetría explorar nuevas preguntas en la investigación de radiación que involucran estudios poblacionales que no podrían realizarse prácticamente en el pasado.

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Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Estamos desarrollando una técnica dinámica de exposición de adaptación con nuestra exploración del haz de rayos X digitales del sistema. En lugar de exponer un objeto de manera uniforme, la exposición se adapta en función de la opacidad del objeto. Aquí se muestra un experimento en un fantasma antropomórfica que resultó en un ahorro de dosis de 30%.

Dosis de rayos X a través de la reducción de la exposición de adaptación en imagen fluoroscópica

Un número creciente de dispositivos de terapia de radiación ofrecen la ventaja de la entrega de la dosis a través de muy pequeñas vigas al tumor, lo que permite una mayor conformidad y dosis más altas por fracción. Muchos detectores diferentes se pueden utilizar para la dosimetría de estos pequeños campos. En el presente estudio, el efecto de la recombinación de iones es investigado por una cámara de ionización líquido utilizando un sistema de radioterapia estereotáctica.

Caracterización de los efectos de recombinación en una cámara de ionización líquido utilizado para la dosimetría de un acelerador de radiocirugía

Vías de reparación del ADN son esenciales para el mantenimiento de la integridad genómica y la prevención de la mutación y el cáncer. El objetivo de este protocolo es cuantificar la inestabilidad genómica mediante la observación directa de las aberraciones cromosómicas en metafase se propaga a partir de células B de ratón utilizando hibridación in situ fluorescente (FISH) para las repeticiones teloméricas de ADN.

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La detección de Inter-Aberraciones cromosómicas estables por fluorescencia múltiple<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (mFISH) y cariotipo espectral (SKY) en ratones irradiados

Este protocolo detalla la preparación clínicamente implementable de biomuestras de PBMC y plasma de alta calidad en el sitio del ensayo clínico que se pueden utilizar para el análisis de biomarcadores traslacionales.

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Puesta en marcha del irradiador y dosimetría para la evaluación de los parámetros LQ α y β, esquema de dosificación de radiación y deposición de dosis in vivo

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Evaluación de la resección final global de DOBLE cadena de ADN utilizando el etiquetado brdU-DNA junto con imágenes de discriminación del ciclo celular

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Un método automatizado de puntuación microscópica para el ensayo de focos γ-H2AX en linfocitos de sangre periférica humana

Se describe el flujo de trabajo de citomorfología digital automatizada de la sangre periférica y la médula ósea. Tras la preparación estandarizada de la frota y tinción, un escáner captura imágenes de las muestras. El software impulsado por IA localiza, registra y clasifica preliminarmente las células nucleadas, seguido de una revisión experta. El enfoque está en las clasificaciones celulares erróneas críticas con potencial de diagnóstico erróneo.

Flujo de trabajo para citomorfología digital automatizada de sangre periférica y médula ósea, teniendo en cuenta las clasificaciones celulares erróneas críticas

Aprende a estimar dosis de radiación biológica mediante el software ADCI que automatiza la detección de cromosomas dicéntricos en imágenes de células en metafase. Esta herramienta acelera significativamente el análisis de biodosimetría.

Radiación acelerada Biodosimetry automática por identificación del cromosoma dicéntrico (ADCI) y estimación de dosis

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