Evaluación defectos de obstrucción urinaria cruce por la inyección de tinte de azul de metileno

El objetivo general de este procedimiento es determinar las obstrucciones de las uniones del tracto urinario mediante la inyección de tinte de metileno en los riñones. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo del riñón y el tracto urinario inferior, como la conexión de la vejiga uretal. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un método sencillo para visualizar la estructura del tracto urinario en el peor de los casos, el desarrollo en masa, lo que permite el análisis del desarrollo del tracto urinario.

Para comenzar el experimento, mida 0,1 gramos de polvo de azul de metileno. Disuelva el azul de metileno en 10 mililitros de solución salina tamponada con fosfato 1x o PBS y agite la mezcla. A continuación, filtre la solución de azul de metileno de 10 miligramos por mililitro con un filtro de jeringa para eliminar la obstrucción durante la inyección.

A continuación, ensamble un juego de venas estériles del cuero cabelludo con una jeringa desechable de tres mililitros y llene la jeringa con tres mililitros de solución de azul de metileno filtrada. Limpie las tijeras y pinzas de disección con etanol al 70%. Para recolectar embriones perinatales en E18.5 o E19.5, primero eutanasiar ratones preñados mediante inhalación de dióxido de carbono.

A continuación, realice la luxación cervical de acuerdo con las directrices de los NIH. A continuación, rocíe etanol al 70% en la superficie abdominal ventral del animal. Luego, con las tijeras de disección estériles y las pinzas, abra la cavidad abdominal ventralmente.

Levanta todo el útero y sepáralo del cuerpo por las puntas de los cuernos uterinos. A continuación, enjuague todo el útero con 1x PBS en una placa de Petri. Cortar el útero segmentariamente con tijeras de disección y extraer la placenta decidua con pinzas de disección para exponer los embriones y los sacos vitelinos.

Primero se retira el saco vitelino y luego se retira la membrana amniótica con pinzas de disección para liberar los embriones perinatales. Decapita el embrión con tijeras de disección. Sujete el embrión con su superficie ventral hacia arriba en un microscopio de disección equipado con una cámara digital para obtener imágenes.

Recoge su cola para el genotipado. Con fórceps, desgarre cuidadosamente la piel para abrir la cavidad abdominal del embrión. A continuación, extraiga cuidadosamente el exceso de órganos y tejidos, como el hígado, el estómago y los intestinos, con fórceps, cortándolos o tirando de ellos para exponer los riñones, los uréteres y la vejiga que se encuentran dorsalmente.

Absorba el exceso de sangre del embrión disecado con almohadillas de gasa estériles y luego continúe con la inyección de tinte. Elimine las burbujas en la aguja y el tubo expulsando la solución de azul de metileno de la punta de la aguja mediante presión hidrostática. Levante la jeringa que contiene la solución de tinte por encima del nivel de la punta de la aguja para iniciar el flujo.

Y luego baje la jeringa para detener el flujo. A continuación, inserte la aguja en la pelvis renal cerca del uréter proximal, teniendo cuidado de no alterarla una vez colocada. Realizar la inyección de tinte en un riñón para determinar su obstrucción del tracto urinario.

Después de la inserción de una aguja en la pelvis renal, para el éxito de esta prueba, se debe insertar una aguja en la pelvis renal hacia el uréter, sin pasar por el riñón ni hacia el vaso sanguíneo. Levante la jeringa unos 20 centímetros para proporcionar presión hidrostática y deje que fluyan de 15 a 16 microlitros de la solución de tinte. A continuación, controle el color azul del tinte, empezando primero por la pelvis renal, luego en la longitud del uréter y, por último, en la luz de la vejiga.

Coloque la jeringa hacia abajo para detener el flujo de tinte y retire la aguja del riñón. Hacer un registro de la hidronefrosis del riñón, el hidrouréter y la posición final de la solución de colorante en un cuaderno de laboratorio. Finalmente, realice la inyección del riñón contralateral y deje que el tinte fluya durante 20 segundos en total.

Tome imágenes del riñón, el uréter y la vejiga trazadas con una solución de tinte utilizando la cámara y el programa de imágenes conectado a un microscopio estereoscópico. Después de la inyección en un riñón, el tinte azul de metileno fluye desde la pelvis renal a través del uréter y hacia la vejiga, lo que da como resultado un color azul visible en el uréter y la luz de la vejiga. Aparece un azul más fuerte en la luz de la vejiga debido a un flujo más prolongado aproximadamente 20 segundos después de la inyección de ambos riñones con un tinte, lo que indica la ausencia de obstrucción de la unión del tracto urinario en el segundo sistema urinario.

Cuando se inyecta un hidrouréter anormalmente dilatado, la posición final de la solución de colorante no está clara. Y la obstrucción de la unión ureterovesical o UVJO no se puede verificar a pesar de la ausencia del tinte en la luz de la vejiga porque el hidrouréter anormal se dañó en el medio. Al intentar este procedimiento, es importante recordar calcular el saco de tinte de los embriones perinatales para obtener el sistema urinario intacto.

Y elimine las burbujas para no bloquear el flujo de tinte.