Name: Imágenes en vivo de la migración de células epiteliales de mama después del agotamiento transitorio de TIP60 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Aprende a monitorizar la migración celular en tiempo real mediante imágenes en vivo de células epiteliales de mama MCF10A con agotamiento de TIP60. Este método permite visualizar cambios dinámicos en la metástasis del cáncer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Agradecemos a los miembros del laboratorio Jai por su útil discusión y comentarios. S.J. fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de investigación de Singapur y el Ministerio de Educación de Singapur en sus centros de investigación de la iniciativa de excelencia al cáncer la ciencia Instituto de Singapur (R-713-006-014-271), los médicos nacionales Consejo de investigación (CBRG-NIG; BNIG11nov001 y CS-IRG; R-713-000-162-511), el fondo de investigación del Ministerio de Educación (MOE AcRF nivel 1 T1-2012 Oct -04). Y.Z. G.S.C. y C.Y.T. fueron apoyados por una beca de postgrado otorgada por el Instituto de ciencia cáncer de Singapur, Universidad Nacional de Singapur.

1. preparación
<ol><li>Preparar medio de cultivo MCF10A: modificado Eagle Medium (DMEM de Dulbecco) F12 (1:1) con 5% caballo suero 20 ng/mL del factor de crecimiento epitelial, hidrocortisona 0.5 mg/mL, la toxina del cólera 100 ng/mL e insulina de 10 μg/mL.</li>
	<li>Preparar medio libre de suero: DMEM/F12 (1:1) con 20 ng/mL del factor de crecimiento epitelial, hidrocortisona 0.5 mg/mL, la toxina del cólera 100 ng/mL e insulina de 10 μg/mL.</li>
	<li>Utilice la siguiente secuencia de siRNA: siControl: Forward: 5'-CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT-3' Reverso: 5'-UCGAAGUAUUCCGCGUACGdTdT-3' siTIP60: Forward: 5'-UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT-3' Reverso: 5'-UCAUAGCUGAACUCGAUCAdTdT-3'</li>
	<li>Utilice platos de cultivo celular de 10 cm y placas de 24 pocillos.</li>
</ol>2. transitorio agotamiento del siRNA usando TIP60
<ol><li>El día 1, alícuotas de 15 μl de reactivo de transfección (p. ej., Lipofectamine RNAiMAX) y 2 mL de reducción medio de suero (por ejemplo, Opti-MEM) y mezclan con 10 μl de cada siRNA (10 μm de valores), respectivamente.</li>
	<li>Incubar la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos.</li>
	<li>1 x 106 MCF10A células junto con 3 mL de medio de cultivo en un plato de 10 cm de la semilla. Contar las células usando un hemocitómetro.</li>
	<li>Agregar la mezcla de siRNA gota a gota en el plato de 10 cm.</li>
	<li>Agite el plato para asegurarse de que las células se distribuyen igualmente antes de poner en la incubadora de 37 ° C.</li>
	<li>Después de 6 h de incubación, sustituir el medio que contiene siRNA con 8 mL de medio de cultivo fresco.</li>
	<li>Día 2, preparar otra tanda de mezclas de siRNA e incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos.</li>
	<li>Aspire a 8 mL de medio de cultivo añadido el día 1 y reemplazarlo con 3 mL de medio de cultivo fresco.</li>
	<li>Añadir el segundo lote de la mezcla de siRNA a los platos gota a gota. Agite los platos para asegurar que los reactivos se mezclan completamente antes de ponerlos en la incubadora.</li>
	<li>Después de 6 h, sustituir el medio que contiene siRNA con 8 mL de medio de cultivo fresco.</li>
</ol>3. semillas células para el ensayo de cicatrización
<ol><li>El día 3, deseche el medio y las células una vez con 2 mL de tampón fosfato salino (PBS) tampón de lavado. Desechar el tampón de PBS.</li>
	<li>Trypsinize las células tratadas con siTIP60 y siControl añadiendo 1 mL de 1 x de buffer de tripsina-EDTA a la placa. Vuelva a colocarlo en la incubadora durante 20 minutos.</li>
	<li>Añadir 4 mL de medio de cultivo completo a cada plato, resuspender las células mediante pipeteo y transferirlos a un tubo de 15 mL.</li>
	<li>Centrifugue a 200 g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda las células con 5 mL de medio sin suero y contar las células usando un hemocitómetro.</li>
	<li>Preparar una suspensión de 6 x 105 células/mL de siControl y siTIP60; Asegúrese de que las células estén bien mezcladas. Añadir 500 μl de la suspensión celular a un pozo de una placa de 24 pocillos para garantizar 100% de confluencia. Semillas 5 a 6 pozos cada siControl y siTIP60.</li>
	<li>Agitar suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás y lateralmente para asegurar incluso la distribución. Evitar un movimiento circular. Dejar la placa en la incubadora durante 24 h.</li>
	<li>Las células restantes para comprobar la eficacia de la precipitación de TIP60 de la cosecha. Para ello, centrifugar la suspensión de células restantes a 200 g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.</li>
	<li>Aislar RNA usando un reactivo comercial, siguiendo el protocolo del fabricante y proceder a la polimerización en cadena cuantitativa en tiempo real para evaluar la eficacia de la precipitación.</li>
</ol>4. crear la herida
<ol><li>Ver bajo un microscopio de contraste de fase para asegurar que las células están completamente contactadas. Observar las células bajo el microscopio (4 X, 10 X y 20 aumentos) para asegurar que las células se unen totalmente que ha formado una monocapa confluente de células. Nota: las células siControl generalmente fije mejor que las células siTIP60. Se espera porque el agotamiento de TIP60 hace que las células mesenquimales como mas20. Aquí, se utiliza un microscopio de contraste de fase de luz blanca de mesa normal.</li>
	<li>Para generar la herida, raye suavemente una línea recta por el centro del pozo con una pipeta de 200 μL; la longitud de la herida generada es igual que el diámetro del pozo. Repita este paso para todos los pozos restantes. Utilice una nueva pipeta para cada pozo.</li>
	<li>Suavemente Lave bien cada uno 5 veces con suero medio para eliminar las células separadas.</li>
	<li>Añadir 1 mL de medio sin suero a cada pozo y proceder a la proyección de imagen de células vivas.</li>
</ol>5. configuración de las imágenes de células vivas
<ol><li>Encienda el microscopio y la temperatura de control al menos 1 h antes de configurar células vivas imágenes para asegurar que la temperatura en la cámara alcanza los 37 ° C.</li>
	<li>Encienda el suministro de gas de dióxido de carbono (CO2) antes de iniciar la proyección de imagen de células vivas. Fijar el CO2 concentración al 5%.</li>
	<li>Coloque la placa de 24 pocillos sobre la platina del microscopio y seleccione el objetivo con 10 aumentos para la proyección de imagen. Directa de la luz emitida a los oculares en vez de la cámara y ajustar el enfoque para localizar la herida y las células alrededor de él. Nota: en este caso, se utilizó luz blanca con contraste de fases.</li>
	<li>Utilice un sistema observador de células vivas para marcar la posición de la herida en cada pozo. Nota: La etapa automatizada del sistema de proyección de imagen de células vivas permite la adquisición de imágenes en múltiples posiciones. Imágenes son tomadas en cada posición marcada una vez cada intervalo.</li>
	<li>Establecer la condición de tiempo: 1 h intervalo y duración 72 h; Según esta configuración, el sistema tomará fotos en cada posición marcada cada hora durante 72 h. configurar cualquier intervalo de tiempo deseado y período de seguimiento. Nota: Aquí, una duración de 72 horas es mejor ya que estas células empiezan a morir después de 72 h en medio libre de suero.</li>
</ol>6. seguimiento de movimiento de unicelular
<ol><li>Exportar los datos después de 72 h. exportar los datos como imágenes en formato JPEG y vídeos en formato AVI. Nota: Esto es importante porque el software ImageJ puede reconocer solamente vídeos en formato AVI. Las velocidades de migración diferentes célula entre las células siTIP60 y siControl pueden observarse claramente en el video.</li>
	<li>Abrir el video AVI en el software ImageJ.</li>
	<li>Abrir el plugin de MTrackJ (el plugin debe ser descargado e instalado por separado): Plugins > MtrackJ.</li>
	<li>Añadir una pista para las células elegido en el video haciendo clic en la opción "Agregar" en la barra de herramientas de MtrackJ. Seleccione una celda en el extremo del frente del invasor y una célula que puede migrar por cuenta propia (migración unicelular). Seguir el movimiento de las células solicitadas en el video y trazarlos usando MtrackJ.</li>
	<li>Medir la distancia de movimiento haciendo clic en la pestaña de "medida" en la barra de herramientas. Nota: Aquí, casi no hay células en el siControl movido como las células, lo que dificulta medir sola célula movimiento, considerando que muchas de las células siTIP60 se trasladó como células individuales. Sin embargo, el movimiento de células situadas en el frente invasor puede todavía remontar y calcula en células siControl y siTIP60.</li>
	<li>Guardar el vídeo con las pistas en formato AVI.</li>
</ol>7. cuantificación de la capacidad de la migración celular
<ol><li>Para la cuantificación, seleccione imágenes en 0 h y h "n", donde "n" se refiere al punto de tiempo cuando las células siTIP60 o siControl han cerrado totalmente la herida. Nota: Aquí, 48 h fue elegido, como las heridas en las células siTIP60 se cerraron casi por completo.</li>
	<li>Cuantificar la migración por ciento con ImageJ utilizando la siguiente fórmula: (área de la herida a las 0 h - zona de la herida en "n" h) / área de la herida 0 h x 100.</li>
</ol>

<ol><li>Sun, Y., Jiang, X., Chen, S., Fernandes, N., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+Tip60+histone+acetyltransferase+in+the+acetylation+and+activation+of+ATM%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A role for the Tip60 histone acetyltransferase in the acetylation and activation of ATM.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (37), 13182-13187 (2005).</li>
<li>Sykes, S. M., Stanek, T. J., Frank, A., Murphy, M. E., McMahon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+the+DNA+binding+domain+regulates+transcription-independent+apoptosis+by+p53%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Acetylation of the DNA binding domain regulates transcription-independent apoptosis by p53.</a> J Biol Chem. 284 (30), 20197-20205 (2009).</li>
<li>Jha, S., Shibata, E., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Rvb1%2FTip49+is+required+for+the+histone+acetyltransferase+activity+of+Tip60%2FNuA4+and+for+the+downregulation+of+phosphorylation+on+H2AX+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Human Rvb1/Tip49 is required for the histone acetyltransferase activity of Tip60/NuA4 and for the downregulation of phosphorylation on H2AX after DNA damage.</a> Mol Cell Biol. 28 (8), 2690-2700 (2008).</li>
<li>Sapountzi, V., Logan, I. R., Robson, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+functions+of+TIP60%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cellular functions of TIP60.</a> Int J Biochem Cell Biol. 38 (9), 1496-1509 (2006).</li>
<li>Squatrito, M., Gorrini, C., Amati, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip60+in+DNA+damage+response+and+growth+control%3A+many+tricks+in+one+HAT%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tip60 in DNA damage response and growth control: many tricks in one HAT.</a> Trends Cell Biol. 16 (9), 433-442 (2006).</li>
<li>Sun, Y., Xu, Y., Roy, K., Price, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+damage-induced+acetylation+of+lysine+3016+of+ATM+activates+ATM+kinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA damage-induced acetylation of lysine 3016 of ATM activates ATM kinase activity.</a> Mol Cell Biol. 27 (24), 8502-8509 (2007).</li>
<li>Sykes, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acetylation+of+the+p53+DNA-binding+domain+regulates+apoptosis+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Acetylation of the p53 DNA-binding domain regulates apoptosis induction.</a> Mol Cell. 24 (6), 841-851 (2006).</li>
<li>Tang, Y., Luo, J., Zhang, W., Gu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip60-dependent+acetylation+of+p53+modulates+the+decision+between+cell-cycle+arrest+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tip60-dependent acetylation of p53 modulates the decision between cell-cycle arrest and apoptosis.</a> Mol Cell. 24 (6), 827-839 (2006).</li>
<li>Chen, G., Cheng, Y., Tang, Y., Martinka, M., Li, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tip60+in+human+melanoma+cell+migration%2C+metastasis%2C+and+patient+survival%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Role of Tip60 in human melanoma cell migration, metastasis, and patient survival.</a> J Invest Dermatol. 132 (11), 2632-2641 (2012).</li>
<li>Gorrini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tip60+is+a+haplo-insufficient+tumour+suppressor+required+for+an+oncogene-induced+DNA+damage+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tip60 is a haplo-insufficient tumour suppressor required for an oncogene-induced DNA damage response.</a> Nature. 448 (7157), 1063-1067 (2007).</li>
<li>Jha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Destabilization+of+TIP60+by+human+papillomavirus+E6+results+in+attenuation+of+TIP60-dependent+transcriptional+regulation+and+apoptotic+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Destabilization of TIP60 by human papillomavirus E6 results in attenuation of TIP60-dependent transcriptional regulation and apoptotic pathway.</a> Mol Cell. 38 (5), 700-711 (2010).</li>
<li>Kim, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+of+a+metastasis+suppressor+gene+by+Tip60+and+beta-catenin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation of a metastasis suppressor gene by Tip60 and beta-catenin complexes.</a> Nature. 434 (7035), 921-926 (2005).</li>
<li>Sakuraba, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+Tip60+gene+as+a+potential+marker+for+the+malignancy+of+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Anticancer+Res%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of Tip60 gene as a potential marker for the malignancy of colorectal cancer.</a> Anticancer Res. 29 (10), 3953-3955 (2009).</li>
<li>Subbaiah, V. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E3+ligase+EDD1%2FUBR5+is+utilized+by+the+HPV+E6+oncogene+to+destabilize+tumor+suppressor+TIP60%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">E3 ligase EDD1/UBR5 is utilized by the HPV E6 oncogene to destabilize tumor suppressor TIP60.</a> Oncogene. , (2015).</li>
<li>Friedl, P., Wolf, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-cell+invasion+and+migration%3A+diversity+and+escape+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms.</a> Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).</li>
<li>Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massague, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastasis%3A+from+dissemination+to+organ-specific+colonization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization.</a> Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).</li>
<li>Zijl, F., Krupitza, G., Mikulits, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+steps+of+metastasis%3A+cell+invasion+and+endothelial+transmigration%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Initial steps of metastasis: cell invasion and endothelial transmigration.</a> Mutat Res. 728 (1-2), 23-34 (2011).</li>
<li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanisms+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 178-196 (2014).</li>
<li>Liang, C. C., Park, A. Y., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+scratch+assay%3A+a+convenient+and+inexpensive+method+for+analysis+of+cell+migration+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro.</a> Nat Protoc. 2 (2), 329-333 (2007).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TIP60+inhibits+metastasis+by+ablating+DNMT1-SNAIL2-driven+epithelial-mesenchymal+transition+program%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">TIP60 inhibits metastasis by ablating DNMT1-SNAIL2-driven epithelial-mesenchymal transition program.</a> J Mol Cell Biol. , (2016).</li>
<li>Riahi, R., Yang, Y., Zhang, D. D., Wong, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+wound-healing+assays+for+probing+collective+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Autom%22%5BJournal%5D)">Advances in wound-healing assays for probing collective cell migration.</a> J Lab Autom. 17 (1), 59-65 (2012).</li>
<li>Jonkman, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+the+wound+healing+assay+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Adh+Migr%22%5BJournal%5D)">An introduction to the wound healing assay using live-cell microscopy.</a> Cell Adh Migr. 8 (5), 440-451 (2014).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Se sabe que en el proceso de migración de la célula, las células pueden cualquiera movimiento en forma de fichas de adherentes; racimos flojos; o células individuales, aisladas. El modo y la dinámica de invasión celular pueden variar de un estado a otro, y el fenotipo puede cambiar dentro de las horas. El ensayo de cicatrización tradicional se basa en fotografías instantáneas de un microscopio con un intervalo de tiempo, tales como de 12 o 24 horas. Esto hace difícil de capturar la dinámica de cierre de la herida y el pa...

Proteína VIH Tat interactivo 60 kDa (TIP60) es una lisina acetiltransferasa que puede acetylate histonas y proteínas no histonas1,2. Sus funciones se encuentran que tienen implicaciones en múltiples vías de señalización, incluyendo transcripción, reparación del daño de la DNA y apoptosis1,3,4,5,6, 7 , 8. Además, TIP60 es a menudo o en casos de cáncer y su regulación a la baja se correlaciona con la metástasis de cáncer y supervivencia pobre precios9,10,11,12, 13,14. Metástasis tumoral es la principal causa de muerte relacionada con cáncer. Es un proceso multi-step, y el paso inicial de la metástasis implica la migración y la invasión de células tumorales en los tejidos adyacentes15,16. Para ello, las células del tumor primero deben separar de la masa del tumor primario, ya sea en la forma de una hoja de células colectivamente invasores o como independiente de las células17. Durante este proceso, las células del tumor a menudo se someten a epitelial de transición mesenquimal (EMT), resultando en cambios en la morfología y la célula adherencia capacidad17,18.
Se han desarrollado algunas técnicas para estudiar la migración y capacidad de invasión del tumor de las células en vitro. Entre ellos, la cicatrización es más eficiente y económico19. En primer lugar, este método implica la creación de un espacio artificial en una monocapa confluente de células, lo que permite a las células migrar y cerrar la brecha. En segundo lugar, se pueden capturar imágenes de los espacios al principio y al final del experimento. Por último, una comparación de cierre de brecha se utiliza para determinar la tasa de migración de la célula. Un microscopio de contraste de fase se utiliza generalmente para capturar imágenes para los ensayos convencionales de cicatrización. Otra de las ventajas del ensayo de cicatrización es que en parte se asemeja en vivo la migración celular tumoral. Del mismo modo a metástasis de tumor en vivo , migración celular en la cicatrización de los ensayos muestra la migración colectiva de hojas epiteliales y la migración de las células individuales separadas.
Sin embargo, la migración celular es conocida por ser dinámico y es necesario documentar el movimiento de las células en tiempo real. Por ejemplo, un ensayo de cicatrización convencional no permite un investigador analizar sola célula movimiento. Por otro lado, las células cultivadas para los ensayos de cicatrización suelen ser sediento de suero para inhibir la proliferación celular. Esto se hace para descartar la posibilidad de cierre de la brecha debido a la proliferación celular. Sin embargo, todavía habrá algunos proliferación y muerte celular e imágenes de contraste de fase tomadas antes y después del experimento son incapaces de distinguir entre ellos.
La técnica de imágenes de células vivas dirige a esta limitación de ensayos convencionales de cicatrización. Utilizando un microscopio de proyección de imagen en vivo combinado con un incubador de CO2 y control de la temperatura adecuada, los investigadores pueden medir el tamaño de la brecha y su velocidad de cierre en el tiempo mientras que rastrear el movimiento de migración activa de células ubicadas en las puntas de los frente invasivo. Por lo tanto, la aplicación de células vivas para controlar la migración de células de la proyección de imagen no sólo proporcionará el mejor visualización de la migración de la célula, pero también permite la posibilidad de diferenciar entre la migración celular y proliferación celular, proporcionando así más Análisis fiable de la migración de la célula.
En este estudio, las células epiteliales de la mama MCF10A fueron utilizadas para demostrar la combinación de la cicatrización análisis y proyección de imagen para estudiar el papel de TIP60 en migración celular con células vivas. El agotamiento de los TIP60 resultados en habilidades de aumento de la migración de células MCF10A.

<table><tbody><tr><td>Célula MCF10A</td><td>ATCC</td><td>CRL-10317TM</td><td>Célula epitelial de mama</td></tr><tr><td>Medios DMEM/F12 (1:1)</td><td>Gibco</td><td>11330-032 Medios de</td><td>cultivo MCF10A</td></tr><tr><td>Factor de crecimiento epitelial (EGF)</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>Suplementos para medios de cultivo MCF10A Toxina</td></tr> del <tr><td>cólera</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-8052</td><td>Suplementos para medios</td></tr> <tr><td>de cultivo MCF10AHidrocortisona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H-0888</td><td>Suplementos para medios de cultivo MCF10A</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-1882</td><td>Suplementos para medios de cultivo MCF10A</td></tr><tr><td>Suero doméstico</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td>Suplementos para medios de cultivo MCF10A</td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>para MCF10A desprender de la placa</td></tr><tr><td>Hemacitómetro</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td>Para célula de recuento</td></tr><tr><td>Opti-MEM medios de suero reducidos</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>Para mezcla de siRNA</td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAiMAX</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>56532</td><td>Reactivo Transfect</td></tr><tr><td>Reactivo Trizol</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>15596-026</td><td>Para extracción de ARNm</td></tr><tr><td>iScript Kit de síntesis de ADNc</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8891</td><td>Para ADNc generación</td></tr><tr><td>iTaq Universal SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>172-5125</td><td>Para qPCR en tiempo real</td></tr><tr><td>7500 Sistema de PCR rápido en tiempo real</td><td>Biosystems</td><td></td><td>Mecanismo de qPCR en tiempo real</td></tr><tr><td>Plato de 10 cm</td><td>Greiner bio-one</td><td>664160</td><td>Para experimento de derribo</td></tr><tr><td>placa de 24 pocillos</td><td>Cellstar</td><td>662160</td><td>Para ensayo de cicatrización de heridas</td></tr><tr><td>siControl siRNA</td><td>Self diseñado</td><td>por propio</td><td>CGUACGCGGAAUACUUCGAdTdT</td></tr><tr><td>siTIP60 siRNA</td><td>Autodiseñado</td><td>Diseño propio</td><td>UGAUCGAGUUCAGCUAUGAdTdT</td></tr><tr><td>Observador de células vivas</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Zeiss Observador de células invertidas para experimentos con células vivas</td></tr></tbody></table>

imágenes en vivo de la migración de células epiteliales de mama después del agotamiento transitorio de tip60

Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

La cicatrización es eficiente y una de las maneras más económicas para el estudio de la migración celular in vitro. Convencionalmente, se toman imágenes al principio y al final de un experimento usando un microscopio de contraste de fase, y se evalúan las capacidades de migración de las células por el cierre de heridas. Sin embargo, movimiento celular es un fenómeno dinámico, y un método convencional no permite rastrear movimiento unicelular. Para mejorar el actuales análisis de cicatrización, utilizamos técnicas de imágenes de células vivas para controlar la migración de la célula en tiempo real. Este método permite determinar la tasa de migración de la célula basada en una sistema de seguimiento de la célula y proporciona una distinción más clara entre la migración celular y proliferación celular. Aquí, se demuestra el uso de imágenes de células vivas en la cicatrización de ensayos para el estudio de las capacidades diferentes de la migración de células epiteliales de mama por la presencia de TIP60. Como la motilidad celular es altamente dinámica, nuestro método ofrece más ideas en los procesos de cicatrización que una instantánea del encierro de la herida con las tradicionales técnicas de imagen utilizadas para los ensayos de la cicatrización.

Esquema general del ensayo de migración de células vivas basadas en la proyección de imagen de células Figura 1A es un esquema de este protocolo. MCF10A células transfected con siControl demostrada morfología epitelial típica. Después de la depleción de TIP60, células MCF10A eran más mesenquimales comparado a las células control (figura 1B).
...

Aquí, presentamos el seguimiento en tiempo real de la migración de la célula en un ensayo de cicatrización utilizando células epiteliales de mama MCF10A TIP60-agotado. La aplicación de técnicas de imagen de células vivas en nuestro protocolo nos permite analizar y visualizar sola célula movimiento en tiempo real y a través del tiempo.

Imágenes en vivo de la migración de células epiteliales de mama después del agotamiento transitorio de TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

El objetivo general de este procedimiento es observar los efectos de la eliminación de genes específicos de interés sobre la migración celular. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en la metástasis del cáncer, como la migración de células cancerosas. La principal ventaja de esta técnica es que permite monitorear la migración celular dinámica en tiempo real.Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando estábamos observando cambios en la morfología celular tras la administración del paciente de TIP60, un supresor tumoral. Comience sembrando un millón de células epiteliales de mama en tres mililitros de medio de cultivo por placa de 10 centímetros. Añada gota a gota la mezcla SRINA incubada a temperatura ambiente durante 20 minutos al cultivo celular experimental.Agite manualmente ambos platillos para asegurar que las células se distribuyan uniformemente antes de colocarlos en un incubador a 37 grados Celsius. Después de seis horas, reemplace los sobrenadantes con ocho mililitros de medio de cultivo fresco por platillo y regrese los cultivos al incubador. A la mañana siguiente, reemplace los sobrenadantes con tres mililitros de medio de cultivo fresco por pl

live-imaging-breast-epithelial-cell-migration-after-transient

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Un dispositivo de microfluidos en compartimientos para la investigación de la migración de células madre del cáncer se describe. Esta novedosa plataforma crea un microambiente celular viable y permite la visualización microscópica de locomoción de células vivas. Muy móviles células cancerosas se limitan a estudiar los mecanismos moleculares de la infiltración agresivo, que puede conducir a terapias más eficaces en el futuro.

Evaluación de la migración de las células madre del cáncer compartimentar Utilizando dispositivos de microfluidos y imágenes de células vivas

Procesos celulares, tales como la migración celular tradicionalmente han sido estudiados en dos dimensiones, las superficies de plástico rígido. Este informe describe una técnica para visualizar de manera directa la localización de proteínas y el análisis de la dinámica de proteínas en las células que migran de una manera más fisiológicamente relevantes, matriz tridimensional.

Células vivas imágenes de la migración de las células que expresan proteínas de fluorescencia etiquetado en una matriz tridimensional

Imagen de lapso de tiempo se utiliza para evaluar el comportamiento de las células mamarias preneoplásicas primarias epiteliales derivadas de los modelos de ratón genéticamente modificadas de riesgo de cáncer de mama para determinar si existen correlaciones entre los parámetros de comportamiento específicas y distintas lesiones genéticas.

Time-lapse de imágenes de Primaria preneoplásicas células epiteliales mamarias derivadas de los modelos de ratones genéticamente modificados del cáncer de mama

Combinando los enfoques de trasplante de células, marcaje del citoesqueleto y pérdida/ganancia de función, este protocolo describe cómo se puede utilizar la placa precordal prospectiva del pez cebra en migración para analizar la función de un gen candidato en la migración celular in vivo.

analizando<em&gt; En Vivo</em&gt; Migración de células usando trasplantes de células y time-lapse en embriones de pez cebra

Aquí, describimos un método de microscopía de lapso de tiempo a largo plazo para rastrear longitudinalmente células individuales en respuesta a terapias contra el cáncer.

A través del espejo: Microscopía de lapso de tiempo y de seguimiento longitudinal de las células individuales para el Estudio de la terapéutica contra el cáncer

Este protocolo describe el uso de la microscopía multifotónica para realizar extendida time-lapse de las interacciones multicelulares en tiempo real, en vivo a una resolución de una sola célula.

Prolongado lapso de tiempo intravital de imágenes de tiempo real multicelular Dinámica en el microambiente tumoral

En este artículo, presentamos un protocolo que describe un método in vivo para medir la inestabilidad dinámica de los microtúbulos en células de cáncer de mama resistentes a docetaxel (MCF-7TXT). En este método, se utiliza un sistema de imágenes de microscopía de deconvolución para detectar la expresión de GFP-tubulina en las células diana.

Imágenes en vivo para el Estudio de la inestabilidad dinámica de microtúbulos en los cánceres de mama resistentes a taxano

Aquí, describimos la técnicas de imagen de células vivas para medir cuantitativamente la migración y la invasión de células de glioblastoma cerebral tumor con el tiempo y las condiciones de tratamiento múltiples.

Análisis de imágenes de células vivas para estudio Glioblastoma cerebral Tumor células madre migración y la invasión

El actual protocolo describe un método integrado de investigación migración de la célula de cáncer y la invasión en una única plataforma en tiempo real, proporcionando una opción fácilmente reproducible y eficiente para estudiar la morfología y movilidad de la célula.

Un flujo de trabajo Simple migración/invasión usando a un sensor automatizado de células vivas

Aquí presentamos un protocolo para evaluar la dinámica de la formación del husillo y la progresión mitotica. Nuestra aplicación de imágenes de lapso de tiempo permite al usuario identificar células en varias etapas de la mitosis, rastrear e identificar defectos mitoticos, y analizar la dinámica del husillo y el destino de las células mitoticas al exponerse a fármacos antimitoticos.

Imágenes de células vivas para evaluar la dinámica del tiempo metafásico y el destino celular después de las perturbaciones del husillo mitático

Informamos una técnica que permite obtener imágenes en vivo de la dinámica de los microtúbulos en células de glioblastoma (GBM) que invaden el tejido cerebral de un vertebrado. El acoplamiento de la inyección ortotópica de células GBM marcadas con fluorescencia en un cerebro transparente de pez cebra con imágenes intravitales de alta resolución permite la medición de la dinámica del citoesqueleto durante la invasión del cáncer in situ .

Imágenes en vivo de la dinámica de los microtúbulos en células de glioblastoma que invaden el cerebro del pez cebra

Aprende a monitorizar la migración celular en tiempo real mediante imágenes en vivo de células epiteliales de mama MCF10A con agotamiento de TIP60. Este método permite visualizar cambios dinámicos en la metástasis del cáncer.

Imágenes en vivo de la migración de células epiteliales de mama después del agotamiento transitorio de TIP60

Explorar más videos