Imágenes en vivo de la migración de células epiteliales de mama después del agotamiento transitorio de TIP60

El objetivo general de este procedimiento es observar los efectos del agotamiento de genes específicos de interés en la migración celular. Este método puede ayudarnos a responder preguntas clave en la metástasis del cáncer, como la migración de las células cancerosas. La principal ventaja de esta técnica es que permite monitorizar la migración celular dinámica en tiempo real.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando observamos cambios en la morfología celular en el paciente con TIP60, un supresor tumoral. Comience sembrando un millón de células epiteliales de mama en tres mililitros de medio de cultivo por plato de 10 centímetros. Agregue 20 minutos de mezcla de SRINA incubada a temperatura ambiente gota a gota al cultivo celular experimental.

Agite manualmente ambos platos para asegurarse de que las células se distribuyan uniformemente antes de colocarlas en una incubadora a 37 grados centígrados. Después de seis horas, reemplace los sobrenadantes con ocho mililitros de medio de cultivo fresco por placa y devuelva los cultivos a la incubadora. A la mañana siguiente, reemplace los sobrenadantes con tres mililitros de medio de cultivo fresco por placa y agregue un segundo parche de mezcla de SIRNA al cultivo celular experimental, como se acaba de demostrar, agitando la placa para asegurarse de que los reactivos estén completamente mezclados antes de devolver las células a la incubadora.

Luego, reemplace los sobrenadantes con ocho mililitros de medio de cultivo fresco después de seis horas e incube los cultivos durante la noche. Al tercer día, lavar las células una vez con dos mililitros de BPS por plato y separar las células de ambas placas con un mililitro de EDTA tripson por plato durante 20 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, detenga la reacción con cuatro mililitros de medio de cultivo completo por placa.

Vuelva a suspender las células mediante pipeteo y transfiera las suspensiones celulares a tubos individuales de 15 mililitros. Recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender los gránulos en cinco mililitros de medio libre de suero por tubo. Después de contar, diluya ambos cultivos celulares a una concentración de 600.000 células por mililitro y agregue 500 microlitros de células de cada cultivo a un pocillo de una placa de 24 pocillos para garantizar el 100% de confluencia.

Cuando se hayan sembrado todas las células, agite suavemente la placa de un lado a otro para asegurar una distribución uniforme y coloque la placa en la incubadora de cultivos celulares durante 24 horas. Para comprobar la eficiencia de knock-down del gen de interés, recoja las células restantes en los tubos de recogida con otra centrifugación y aísle el ARN de los gránulos, utilizando un reactivo comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante para la evaluación cuantitativa de PCR en tiempo real. A la mañana siguiente, al menos una hora antes de comenzar la toma de imágenes de células vivas, encienda el microscopio y controle la temperatura.

Ajuste la temperatura a 37 grados Celsius y el suministro de gas de dióxido de carbono al 5%Cuando la cámara haya alcanzado los 37 grados Celsius, use microscopía de contraste de fase para confirmar que las celdas son confluentes y están completamente unidas al fondo de los pozos. A continuación, utilice una punta de pipeta de 200 microlitros para rascar suavemente una línea recta a lo largo de toda la longitud del centro de cada pocillo y lavar suavemente todos los pocillos cinco veces con medio sin suero para eliminar las células desprendidas. Después del último lavado, agregue un mililitro de medio libre de suero a cada pocillo.

Coloque la placa en la platina del microscopio debajo del objetivo de 10 potencias y dirija la luz emitida a las piezas oculares en lugar de a la cámara. Ajuste manualmente el enfoque para ubicar cada herida y las células que la rodean. A continuación, devuelva la luz emitida a la cámara y utilice un sistema de observación de células vivas para marcar la posición de las heridas y establecer las condiciones de tiempo.

Tome una imagen de las células durante el período de experimento adecuado, luego abra el primer video avi en el software de imagen apropiado y abra el complemento m track j. Haga clic en la pestaña Agregar para agregar una pista para las células individuales y elija una celda en la punta del frente invasivo y una celda que pueda migrar por sí sola. Siga el movimiento de las celdas elegidas en el video usando mtrackJ para rastrear su tráfico.

Luego haga clic en la pestaña de medición para medir la distancia del movimiento de la celda y guardar los videos con las pistas en formato avi. Después de la depleción de TIP60, las células epiteliales de la mama son más mesenquimales en comparación con las células cultivadas de control. De hecho, la expresión de TIP60, así como la expresión de la molécula de adhesión de las células epiteliales, disminuye significativamente después del tratamiento con siTIP60.

Por otro lado, la expresión de genes impulsores de la transición epitelial a mesenquimal específica aumenta con el agotamiento de TIP60. Las imágenes en vivo de los cultivos celulares después de la administración de la herida demuestran una migración celular más rápida de las células tratadas con siTIP60, en comparación con los cultivos siControl, con un aumento significativo en el porcentaje de células migratorias observadas en respuesta a la depleción de TIP60. Además, las células siControl se mueven como una lámina, mientras que dentro de los cultivos siTIP60 se observa más movimiento de una sola célula.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar una técnica de imágenes de células vivas para monitorear los cambios dinámicos de la migración celular.