Name: Activación de la célula de Müller glía en un modelo de regeneración en el pez cebra y degeneración retiniana inducida por láser (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 27 s
Description: Aprende a inducir daño retiniano focal con láser en Danio rerio y monitorear cambios celulares in vivo mediante OCT. Este método permite estudiar la activación de la glía de Müller durante la regeneración retiniana.

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Agradecemos a Martin Zinkernagel, MD, PhD y Miriam Reisenhofer, PhD por su aportación científica a establecer el modelo y Federica Bisignani su excelente asistencia técnica.

todos los experimentos se adhirió a la declaración para el uso de animales en investigación de visión de la Asociación para la investigación en visión y Oftalmología (ARVO) y oftálmica y respetar las normas relacionadas de las autoridades gubernamentales.
 1. animales <ol><li>TgBAC mantener (gfap:gfap-GFP) pez cebra 167 tensión de (AB) de edades comprendidas entre 6-9 meses en condiciones normales en el agua con una temperatura de 26,5 ° C y 14/10 h luz/oscuridad 18.</li>
	<li>Siga las pautas de cuidado de los animales de las instituciones involucradas para los experimentos con animales después de la aprobación por las autoridades gubernamentales.</li>
</ol> 2. Anestesia sistémica reversible <ol><li>Prepare la solución de sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato (Metanosulfonato) disolviendo 400 mg de polvo de Metanosulfonato en 97,9 mL de agua del tanque y 2.1 mL de 1 M de Tris tampón salino (TBS). Ajustar a pH 7,0 con 1 M Tris (pH 9) y almacenar a 4 ° C en el oscuro hasta un mes. 
	Nota: Metanosulfonato debe estar preparado en agua como las condiciones naturales del animal, preferentemente agua de tanque original.</li>
	<li>Diluir la solución madre 1:25 en agua del tanque y utilizar de inmediato.</li>
	<li>Colocar el pez cebra en una placa de Petri que contenga 50 mL de solución de la anestesia hasta que se vuelven inmóviles y no responden a los estímulos externos (aproximadamente 2-5 min, dependiendo de la edad y peso) de 10 cm.</li>
	<li>Transferir cada pescado con la mano a un soporte de silicona a medida para el tratamiento de láser ( figura 1A). 
	¡PRECAUCIÓN! Los peces pueden permanecer anestesiados fuera de la pecera hasta 10 min solamente.</li>
	<li>Para invertir anestesia tras el tratamiento o la proyección de imagen, coloque el pez cebra en envase que contiene el tanque de agua.</li>
	<li>Para apoyar la recuperación, crear un flujo de agua de tanque fresco sobre las branquias moviendo el pez cebra y hacia atrás en el agua.</li>
</ol> 3. Lesión Focal en la Retina con láser Nota: A 532 nm láser de diodo se utiliza para crear daño luz focal sobre la retina del pez cebra. El montaje experimental del laser permite el establecimiento de una lesión retiniana focal reproducible en pez cebra adulto.
<ol><li>Configurar la potencia del láser: 70 mW; diámetro de antena: 50 μm, duración del pulso: 100 ms. PRECAUCIÓN! El uso de luz laser requiere una protección personal adecuada y el etiquetado de la zona.</li>
	<li>Aplique 1-2 gotas de hidroxipropilmetilcelulosa 2% tópico en el ojo antes del tratamiento y usar un lente de laser de fondo de 2,0 mm para enfocar el haz láser-que apunta en la retina. 
	¡PRECAUCIÓN! hidroxipropilmetilcelulosa gotas son viscosas y puede causar problemas en la respiración si va en las branquias.</li>
	<li>Lugar cuatro láser alrededor del nervio óptico a la izquierda del ojo y utilizar el ojo justo, no tratado como control interno.</li>
</ol> 4. En vivo Proyección de imagen de la morfología de la retina <ol><li>en el día 0, visualizar la retina de pez cebra directamente después de la inducción de láser sin revivir de la anestesia. En todos los demás puntos de tiempo, emplear anestesia general (ver sección 2: anestesia sistémica Reversible). Poner el pez cebra inmovilizado en un soporte de silicona a medida ( figura 1 B, B.1).</li>
	<li>Para obtener imágenes óptimas, cortar una lente de contacto de hidrogel comercialmente disponibles para el ojo del pez cebra (Ø = 5,2 mm, r = 2,70 mm, grueso de centro = 0,4 mm) mediante una perforadora. La superficie cóncava de la lente se llenan de metilcelulosa y colóquelo sobre la córnea.</li>
	<li>Equipar el sistema de OCT con un lente de lámpara de hendidura sin contacto 78D.</li>
	<li>Enfocar la imagen infrarroja (IR) en el IR + modo de OCT ( figura 2A) para visualizar el fondo del ojo y tomar el IR fotos haciendo clic en el &#34; adquirir &#34; botón ( figura 2B) para localizar el manchas en la retina mediante el sistema del laser &#39; software s.</li>
	<li>Visualiza una sección tridimensional de las capas retinianas en el IR + OCT modo y tomar las fotos haciendo clic en el &#34; adquirir &#34; botón ( figura 2B). Observar la gravedad de la lesión en la capa nuclear externa (ONL) (ver sección 3: lesión focal en la retina con láser) en estas imágenes.</li>
	<li>Para revertir la anestesia después del tratamiento o la proyección de imagen de pez cebra en un recipiente que contiene el tanque de agua.</li>
	<li>Para apoyar la recuperación, crear un flujo de agua de tanque fresco sobre las branquias moviendo el pez cebra y hacia atrás en el agua.</li>
	<li>Realizar similares en vivo la proyección de imagen de morfología retiniana en el día 1, 3, 7, 14 y 6 semana.</li>
</ol> 5. La hematoxilina &#38; eosina (H &#38; E) tinción <ol><li>eutanasia pez cebra por inmersión en frío (4 ° C) solución de anestesia en hielo durante al menos 10 minutos y enucleate los ojos inmediatamente por medio de pinzas curvas pequeñas.</li>
	<li>Fijar los ojos todo en paraformaldehído al 4% (PFA) en tampón fosfato salino (PBS) a 4 ° C durante 20 h y luego deshidratar las muestras en una serie gradual de alcohol (xileno, etanol 100% durante 5 minutos dos veces, 100% durante 5 minutos dos veces y etanol 70%, etanol 96% por 3 min dos veces 3 mi n una vez). 
	¡PRECAUCIÓN! PFA puede ser irritante a los ojos, la nariz y la vía respiratoria superior. PFA es un conocido cancerígeno humano y un sospecha peligro reproductivo.</li>
	<li>Incrustar las muestras en parafina, corte 5 μm secciones en el nivel de la cabeza del nervio óptico y montar en portaobjetos de vidrio.</li>
	<li>Mancha las secciones deparaffinized con solución de hematoxilina ácido 0,1% durante 5 minutos y sumergir el portaobjetos dos veces en agua destilada después de sumergir el portaobjetos en la mezcla de ácido clorhídrico (HCl en 250 mL de 2 mL 25% agua destilada agua) y amonio (amoníaco de 25% de 2 mL en 250 mL de la mezcla agua destilada). Mancha las secciones con solución acuosa de eosina G 0.5% por 3 min después del desarrollo de la hematoxilina manchas por agua del grifo durante al menos 10 min</li>
	<li>Montar las diapositivas deshidratadas en medio de montaje de resina acrílica y observe los portaobjetos en el microscopio de luz.</li>
</ol> 6. Inmunohistoquímica para la activación de MC <ol><li>calentar las secciones deparaffinized en tampón de recuperación de antígeno (Tris-EDTA + 0.05% detergente no iónico, pH 9.0) durante 3 minutos en un apropiado de vapor o en microondas 10-15 min y lavar tres veces con TBS para 5 minutos cada uno.</li>
	<li>Bloqueo de círculo las secciones con una silicona de la pluma y añadir 100 μl solución (TBS + suero normal de cabra 10% + 1% albúmina de suero bovino, pH 7,6) a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
	<li>Tinción con anticuerpos policlonales de conejo anti-glial proteína ácida fibrilar (GFAP) y la glutamina sintetasa (GS) anticuerpo monoclonal de ratón, tanto en una dilución de 1: 200 (40 μl por muestra). Incubar el portaobjetos en una cámara humidificada a 4 ° C durante la noche. Lavar tres veces con TBS + 0,1% Tween 20 durante 5 minutos.</li>
	Anticuerpos secundarios <li>visualización de acabado con el apropiado. Este protocolo utiliza una cabra anti-conejo IgG H &#38; anticuerpo secundario L verde para GFAP y una cabra anti-ratón IgG H &#38; rojo brillante L de GS, en una dilución de 1: 500 a temperatura ambiente durante 1 h.</li>
	<li>Montar el portaobjetos con medio de montaje con DAPI y observe los portaobjetos en el microscopio de fluorescencia.</li>
</ol>

<ol><li>Haddad, S., Chen, C. A., Santangelo, S. L., Seddon, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+age-related+macular+degeneration%3A+a+review+of+progress+to+date%5BTitle%5D)+AND+%22Surv.+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">The genetics of age-related macular degeneration: a review of progress to date.</a> Surv. Ophthalmol. 51 (4), 316-363 (2006).</li>
<li>Stefano Ferrari, S., Di Iorio, E., Barbaro, V., Ponzin, D., Sorrentino, F. S., Parmeggiani, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+Pigmentosa%3A+Genes+and+Disease+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Genomics%22%5BJournal%5D)">Retinitis Pigmentosa: Genes and Disease Mechanisms.</a> Curr Genomics. 12 (4), 238-249 (2011).</li>
<li>Berson, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinitis+pigmentosa.+The+Friedenwald+Lecture%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinitis pigmentosa. The Friedenwald Lecture.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 34 (5), 1659-1676 (1993).</li>
<li>Strettoi, E. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4688370/">A Survey of Retinal Remodeling.</a> Front Cell Neurosci. 9, 494(2015).</li>
<li>Hartong, D. T., Berson, E. L., Dryja, T. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17113430">Retinitis pigmentosa.</a> Lancet. 368, 1795-1809 (2006).</li>
<li>Wang, D. Y., Chan, W. M., Tam, P. O., Baum, L., Lam, D. S., Chong, K. K., Fan, B. J., Pang, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+mutations+in+retinitis+pigmentosa+and+their+clinical+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Gene mutations in retinitis pigmentosa and their clinical implications.</a> Clin Chim Acta. 351 (1-2), 5-16 (2005).</li>
<li>Pierce, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathways+to+photoreceptor+cell+death+in+inherited+retinal+degenerations%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Pathways to photoreceptor cell death in inherited retinal degenerations.</a> BioEssays. 23, 605-618 (2001).</li>
<li>Tackenberg, M. A., Tucker, B. A., Swift, J. S., Jiang, C., Redenti, S., Greenberg, K. P., Flannery, J. G., Reichenbach, A., Young, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muller+cell+activation%2C+proliferation+and+migration+following+laser+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Vis%22%5BJournal%5D)">Muller cell activation, proliferation and migration following laser injury.</a> Mol. Vis. , 1886-1896 (2009).</li>
<li>Newman, E., Reichenbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+M%C3%BCller+cell%3A+a+functional+element+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Müller cell: a functional element of the retina.</a> Trends Neurosci. 19 (8), 307-312 (1996).</li>
<li>Kubota, R., Hokoc, J. N., Moshiri, A., McGuire, C., Reh, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+study+of+neurogenesis+in+the+retinal+ciliary+marginal+zone+of+homeothermic+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Dev+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">A comparative study of neurogenesis in the retinal ciliary marginal zone of homeothermic vertebrates.</a> Brain Res Dev Brain Res. 134, 31-41 (2002).</li>
<li>Zhao, T. T., Tian, C. Y., Yin, Z. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+M%C3%BCller+cells+occurs+during+retinal+degeneration+in+RCS+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Activation of Müller cells occurs during retinal degeneration in RCS rats.</a> Adv Exp Med Biol. 664, 575-583 (2010).</li>
<li>DiCicco, R. M., Bell, B. A., Kaul, C., Hollyfield, J. G., Anand-Apte, B., Perkins, B. D., Tao, Y. K., Yuan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+Regeneration+Following+OCT-Guided+Laser+Injury+in+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Retinal Regeneration Following OCT-Guided Laser Injury in Zebrafish.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (10), 6281-6288 (2014).</li>
<li>Bilotta, J., Saszik, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+zebrafish+as+a+model+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Dev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The zebrafish as a model visual system.</a> Int. J. Dev. Neurosci. , 621-629 (2001).</li>
<li>Fausett, B. V., Goldman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+alpha1+tubulin-expressing+M%C3%BCller+glia+in+regeneration+of+the+injured+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A role for alpha1 tubulin-expressing Müller glia in regeneration of the injured zebrafish retina.</a> J Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).</li>
<li>Yurco, P., Cameron, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Responses+of+M%C3%BCller+glia+to+retinal+injury+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Responses of Müller glia to retinal injury in adult zebrafish.</a> Vision Res. 45, 991-1002 (2005).</li>
<li>Ashutosh, P. J., Roesch, K., Cepko, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+neurogenic+potential+of+M%C3%BCller+gial+cells+in+the+vertebrate+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Development and neurogenic potential of Müller gial cells in the vertebrate retina.</a> Prog Retin Eye Res. 28 (4), 249-262 (2009).</li>
<li>Xia, X., Ahmad, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unlocking+the+Neurogenic+Potential+of+Mammalian+M%C3%BCller+Glia%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Unlocking the Neurogenic Potential of Mammalian Müller Glia.</a> Int J Stem Cells. 9 (2), 169-175 (2016).</li>
<li>Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrand%2C+M+%22Zebrafish%3A+A+Practical+Approach%22">Zebrafish: A Practical Approach</a>. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , IRL Press. 7-38 (2002).</li>
<li>Riepe, R. E., Norenburg, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M%C3%BCller+cell+localisation+of+glutamine+synthetase+in+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Müller cell localisation of glutamine synthetase in rat retina.</a> Nature. 268 (5621), 654-655 (1977).</li>
<li>Derouiche, A., Rauen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coincidence+of+L-glutamate%2FL-aspartate+transporter+%28GLAST%29+and+glutamine+synthetase+%28GS%29+immunoreactions+in+retinal+glia%3A+evidence+for+coupling+of+GLAST+and+GS+in+transmitter+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance.</a> J Neurosci Res. 42 (1), 131-143 (1995).</li>
<li>Bignami, A., Dahl, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+radial+glia+of+M%C3%BCller+in+the+rat+retina+and+their+response+to+injury.+An+immunofluorescence+study+with+antibodies+to+the+glial+fibrillary+acidic+%28GFA%29+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein.</a> Exp Eye Res. 28 (1), 63-69 (1979).</li>
<li>Sherpa, T., Fimbel, S. M., Mallory, D. E., Maaswinkel, H., Spritzer, S. D., Sand, J. A., Li, L., Hyde, D. R., Stenkamp, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion+cell+regeneration+following+whole-retina+destruction+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Ganglion cell regeneration following whole-retina destruction in zebrafish.</a> Dev Neurobiol. 68 (2), 166-181 (2008).</li>
<li>Cameron, D. A., Carney, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+mosaic+patterns+in+the+native+and+regenerated+inner+retina+of+zebrafish%3A+implications+for+retinal+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Cell mosaic patterns in the native and regenerated inner retina of zebrafish: implications for retinal assembly.</a> J Comp Neurol. 416 (3), 356-367 (2000).</li>
<li>Raymond, P. A., Barthel, L. K., Bernardos, R. L., Perkowski, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+characterization+of+retinal+stem+cells+and+their+niches+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular characterization of retinal stem cells and their niches in adult zebrafish.</a> BMC Dev Biol. 6, 36(2006).</li>
<li>Bailey, T. J., Davis, D. H., Vance, J. E., Hyde, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral-domain+optical+coherence+tomography+as+a+noninvasive+method+to+assess+damaged+and+regenerating+adult+zebrafish+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Spectral-domain optical coherence tomography as a noninvasive method to assess damaged and regenerating adult zebrafish retinas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 53 (6), 3126-3138 (2012).</li>
<li>Koinzer, S., Saeger, M., Hesse, C., Portz, L., Kleemann, S., Schlott, K., Brinkmann, R., Roider, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correlation+with+OCT+and+histology+of+photocoagulation+lesions+in+patients+and+rabbits%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">Correlation with OCT and histology of photocoagulation lesions in patients and rabbits.</a> Acta Ophthalmol. 91 (8), e603-e611 (2013).</li>
<li>Wan, J., Zheng, H., Chen, Z. L., Xiao, H. L., Shen, Z. J., Zhou, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+regeneration+of+photoreceptor+from+M%C3%BCller+glia+after+retinal+degeneration+in+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+Res%22%5BJournal%5D)">Preferential regeneration of photoreceptor from Müller glia after retinal degeneration in adult rat.</a> Vision Res. (2), 223-234 (2008).</li>
<li>Thomas, J. L., Thummel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+light+damage+paradigm+for+use+in+retinal+regeneration+studies+in+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish.</a> J Vis Exp. (80), e51017(2013).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Regeneración, degeneración retiniana en el pez cebra ha sido investigada por diferentes enfoques como de muerte celular mediada por la citotoxina22, lesión mecánica23y lesiones térmicas24. Se empleó un 532 nm diodo láser para dañar la retina de pez cebra. Por lo tanto, nuestro modelo ofrece varias ventajas. Por ejemplo, creamos rápidamente un área bien definida de lesión localizada en la retina externa, específicamente en la capa de PRs. Además, este...

La visión es probablemente el sentido más esencial del ser humano y su deficiencia tiene un alto impacto socio-económico. En el mundo industrializado, enfermedades degenerativas de la retina responsables de la mayoría de la pérdida de la visión y ceguera entre la población adulta1. Retinitis pigmentosa (RP) es la causa hereditaria más común de ceguera en personas entre las edades de 20 y 60 años, que afecta a aproximadamente 1,5 millones de personas en todo el mundo2,3. Es una familia heterogénea de enfermedades hereditarias de retinales caracterizada por la pérdida progresiva de los fotorreceptores (PRs) seguida por degeneración del epitelio retiniano del pigmento y, posteriormente, gliosis y remodelación del interior de las neuronas4. El curso de la enfermedad puede explicarse por la pérdida incremental de los dos tipos de células de PR, generalmente a partir de barras, que son responsables de la visión acromática en luz dévil y conos, que son esenciales para color visión y agudeza visual5. Un defecto genético único es suficiente para causar RP. Hasta ahora más de 130 mutaciones en genes de más de 45 se han asociado con la enfermedad6. Esto conduce a diferentes fenotipos de la enfermedad y es una de las razones que la terapia génica no generalizables y así un acercamiento terapéutico complicado. Por lo tanto, hay una necesidad urgente de desarrollar nuevos enfoques terapéuticos generales para el tratamiento de degeneraciones retinianas en cegar enfermedades.
Degeneración retiniana a menudo implica la pérdida de PR; por lo tanto, la muerte celular PR es una característica distintiva de los procesos degenerativos de la retina7. Ya se ha demostrado que estimula la muerte celular de PR Müller glia celular (MC) activación y proliferación8. MCs, el tipo de célula glial importante en la retina vertebrado, se consideraban ser nada más que un "pegamento" entre las neuronas de la retinales. En los últimos años, muchos estudios han demostrado que MCs actuar como algo más que mera estructural de apoyo9. Entre las diferentes funciones, MCs participa también en la neurogénesis y reparación de10. De hecho, en respuesta a factores difusibles de la retina degeneración, MCs aumentan significativamente la expresión de la proteína ácida fibrilosa glial (GFAP). Por lo tanto, el etiquetado de GFAP puede utilizarse como un marcador de activación de MC como una respuesta secundaria a lesión de retina y degeneración11.
Recientemente, hemos desarrollado una adaptación de la novela de lesión focal usando un laser para inducir la degeneración retiniana en el pez cebra (Danio rerio). Lesión focal es ventajoso para el estudio de ciertos procesos biológicos como la migración de células en el sitio lesionado y la sincronización precisa de eventos que tienen lugar durante la regeneración retiniana12. Además, el pez cebra se ha convertido en importante en la investigación visual debido a las similitudes entre su sistema visual y la de otros vertebrados. Brutas características morfológicas e histológicas de las retinas de humanas y teleósteos muestran algunas diferencias. Por consiguiente, las retinas de humanos y de pez cebra contienen las mismas clases de células principales en el mismo modelo de capas, donde fotorreceptores sensibles a la luz ocupan la capa más externa, mientras que las neuronas de proyección retiniana, las células del ganglio, residen en el interior capa neuronal, próxima a la lente. Las interneuronas retinianas, amacrinas, bipolar y células horizontales, localización entre los fotorreceptores y del ganglio celular capas13. Además, la retina de pez cebra es dominado por el cono y por lo tanto más cerca de la retina humana que, por ejemplo, la retina roedor intensamente estudiada. Una fascinante diferencia entre Teleosteos y mamíferos es la neurogénesis persistente en la retina de peces y la regeneración retiniana después del daño. En el pez cebra, MCs puede dedifferentiate y mediar la regeneración en la retina lesionada14,15. En pollo, MCs tienen cierta capacidad también para volver a entrar en el ciclo celular y dedifferentiate. Después de lesión retiniana en peces adultos, MCs adoptar ciertas características del progenitor y las células madre migran al tejido retiniano dañado y producir nuevas neuronas16. Perfil de expresión génica de MCs mamíferos reveló inesperadas similitudes con progenitores retinianos, y evidencia de potencial neurogénico intrínseco de MCs en pollo, roedor y retina incluso humana crece17. Sin embargo, por qué la respuesta regenerativa en aves y mamíferos es menor comparada con la respuesta robusta en peces no se entiende todavía. Por lo tanto, la comprensión de los mecanismos de reparación endógena en el pez cebra puede sugerir estrategias para estimular la regeneración retiniana en mamíferos y humanos. Empleando el mecanismo de reparación endógena de MCs como una herramienta terapéutica para el tratamiento de pacientes con la degeneración retiniana tendría un impacto excepcional para nuestra sociedad.
En el presente, ofrecemos los pasos necesarios para emplear el modelo de la degeneración y regeneración en investigación oftálmica. Nos centramos primero en inducir daño focal en la retina neurosensorial, luego en la proyección de imagen de eventos a la sitio de la lesión y finalmente visualizable de las MCs adyacentes. El protocolo general es relativamente fácil de realizar y abre una amplia variedad de posibilidades para evaluar la retina luego.

<table><tbody><tr><td>Solución ácida de hematoxilina</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>2852</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>A07030</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>5470</td><td></td></tr><tr><td>Dako Pen</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Medio de montaje DAPI</td><td>Vector Labs, Burlingame, CA, EE. UU.</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Eosina G solución acuosa 0.5%</td><td>Carl Roth, Arlesheim, Suiza</td><td>X883.2</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>2860</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Eukitt</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>3989</td><td></td></tr><tr><td>Cabra anti-conejo IgG H& L Alexa Fluor&reg; 488</td><td>Life Technologies, Zug, Suiza</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>IgG antiratón de cabra H& L Alexa Fluor&reg; 594</td><td>Life Technologies, Zug, Suiza</td><td>A11020</td><td></td></tr><tr><td>Suero normal de cabra</td><td>Dako, Glostrup, Danmark</td><td>X0907</td><td></td></tr><tr><td>Lente de contacto de hidrogel</td><td>Johnson & Johnson AG, Zug, Suiza</td><td>n.a.1-Day</td> <td>Acuvue</td></tr><tr><td>Hidroxipropilmetilcelulosa húmeda 2%</td><td>OmniVision, Neuhausen, Suiza</td><td>n.a.Methocel</td> <td>2%</td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>A5040</td><td>Tricaína, MS-222</td></tr><tr><td>Visulas 532s</td><td>Carl Zeiss Meditec AG, Oberkochen, Alemania</td><td>n.a.532</td> <td>nm</td></tr><tr><td>láser Ratón anticuerpo monoclonal anti-GS</td><td>Millipore, Billerica, MA, EE. UU</td>. Sistema de imagen <td>MAB302</td><td></td></tr><tr><td>HRA + OCT</td><td>Heidelberg Engineering, Heidelberg, Alemania</td><td>n.a.Spectralis</td><td></td></tr> <tr><td>Heidelberg Eye Explorer</td><td>Heidelberg Engineering, Heidelberg, Alemania</td><td>n.a.Versión</td> <td>1.9.10.0</td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>P5368</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal anti-GFAP para conejos</td><td>Invitrogen, Waltham, MA, EE. UU</td>. <td>180063</td><td></td></tr><tr><td>Soporte de alfileres de silicona</td><td>Huco Vision AG Switzerland</td><td>n.a.Cortado</td> <td>a mano a partir de la estera de silicona de la bandeja de esterilización en consecuencia.</td></tr><tr><td>Lámpara de hendidura BM900</td><td>Haag-Streit AG, Koeniz, Suiza</td><td>n.a.Adaptador</td><td></td></tr> de <tr><td>lámpara de hendidura</td><td>Iridex Corp., Mountain View, CA, EE.UU</td>. <td>N.A.Portaobjetos</td><td></td></tr> <tr><td>de vidrio Superfrost Plus</td><td>Gehard Menzel GmbH, Braunschweig, Alemania</td><td>10149870</td><td></td></tr><tr><td>TgBAC (gfap:gfap-GFP) zf167 (AB) strain</td><td>KIT, Karlsruhe, Alemania</td><td>15204</td><td>http://zfin.org/ZDB-ALT-100308-3</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada Tris (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>P5912</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>78D lente de lámpara de hendidura sin contacto</td><td>Volk Optical, Mentor, OH, EE. UU.</td><td>V78C</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Sigma-Aldrich, Buchs, Suiza</td><td>534056</td><td></td></tr><tr><td>Lente láser de fondo de ojo</td><td>Ocular Instruments, Bellevue, WA, EE. UU.</td><td>OFA2-0</td><td></td></tr><tr><td>2100 Retriever</td><td>Aptum Biologics Ltd., Southampton, Reino Unido</td><td>R2100-EU</td><td>Vapor</td></tr></tbody></table>

activación de la célula de müller glía en un modelo de regeneración en el pez cebra y degeneración retiniana inducida por láser

M&#252;ller Glia Cell Activation in a Laser-induced Retinal Degeneration and Regeneration Model in Zebrafish

Una fascinante diferencia entre Teleosteos y mamíferos es el potencial de toda la vida de lo teleósteos retina retina neurogénesis y regeneración después de daño severo. Investigar los caminos de la regeneración en el pez cebra podría traer nuevas ideas para desarrollar estrategias innovadoras para el tratamiento de enfermedades degenerativas de la retina en los mamíferos. En este documento, nos centramos en la inducción de una lesión focal en la retina externa en pez cebra adulto por medio de un láser de diodo de 532 nm. Una lesión localizada permite investigar los procesos biológicos que tienen lugar durante la degeneración retiniana y regeneración directamente en el área de daño. Usando la tomografía de coherencia óptica no invasivos (OCT), hemos sido capaces de definir la ubicación de la regeneración posterior área y monitor dañada en vivo. De hecho, la proyección de imagen OCT produce imágenes de alta resolución, transversales de la retina de pez cebra, proporcionando información que antes sólo estaba disponible con análisis histológicos. Para confirmar los datos de OCT en tiempo real, se realizaron cortes histológicos y la respuesta regenerativa después de la inducción de la lesión retiniana fue investigado por immunohistochemistry.

OCT en tiempo real: para analizar el papel de MCs en reparación retiniana, utilizamos un modelo de lesión láser induce una zona bien delimitada de daño en la retina de pez cebra. El sitio de daño era reflejado por medio de OCT en vivo por primera vez (día 0) en 60 minutos después de la lesión (figura 3). Para compensar la óptica del ojo de pescado, una lente de contacto a medida se puso en la córnea. Inmediatamente después del tratam...

El pez cebra es un popular modelo animal para estudiar mecanismos de degeneración/regeneración retiniana en vertebrados. Este protocolo describe un método para inducir lesiones localizadas interrumpir la retina externa con mínimo daño a la retina interna. Posteriormente, hacemos un seguimiento en vivo la morfología retiniana y la respuesta de la glía de Müller durante la regeneración retiniana.

Activación de la célula de Müller glía en un modelo de regeneración en el pez cebra y degeneración retiniana inducida por láser

A fascinating difference between teleost and mammals is the lifelong potential of the teleost retina for retinal neurogenesis and regeneration after ...

El objetivo general de este video es mostrar cómo monitorizar cambios celulares in vivo tras un daño retiniano focal inducido por láser en pez cebra. Este modelo puede ayudarle a responder preguntas clave sobre la regeneración retiniana, tales como los cambios morfológicos, la cinética y los tipos celulares implicados. La principal ventaja de esta técnica es que, al inducir una lesión focal, los procesos biológicos pueden investigarse directamente en el sitio de la lesión.Aunque este método puede proporcionar información sobre la regeneración de la retina de pez cebra, también puede aplicarse para estudiar el mecanismo de reparación en diferentes modelos animales. Prepare una solución stock de anestésico disolviendo 400 miligramos de polvo de tricaina en 97,9 mililitros de agua de acuario y 2,1 mililitros de TBS uno molar. Ajuste a pH 7,0 con tris uno molar a pH 9.Para preparar la solución de trabajo, diluya la solución stock de tricaina 1 a 25 en agua de acuario y transfiera 50 mililitros a una placa de Petri. Luego, coloque los peces cebra en la solución anestésica durante dos a cinco minutos hasta que queden inmóviles y no respondan a estímulos externos. Transfiera cada pez manualmente a un soporte de pinzas de silicona hecho a medida para el tratamiento con láser.Una anestesia adecuada es fundamental para el bienestar del animal y el éxito del procedimiento. Por lo tanto, la solución recién preparada de tricaina es crucial, y el tiempo fuera del agua no debe superar ampliamente los 10 minutos. Configure la potencia de salida del láser de 532 nanómetros a 70 milivatios, la duración del pulso a 100 milisegundos y el diámetro aéreo a 50 micrones.Luego, aplique una o dos gotas de hidroxipropil metilcelulosa al 2 % en el ojo. Al aplicar metilcelulosa en el ojo, asegúrese de que la solución viscosa no entre en las branquias. A continuación, utilice una lente de láser de fondo de 2 milímetros para enfocar el haz láser de puntería en la retina.Coloque cuatro puntos láser alrededor del nervio óptico en el ojo izquierdo y utilice el ojo derecho, sin tratamiento, como control interno. Inmediatamente después de la inducción con láser, coloque el pez cebra aún anestesiado sobre un soporte personalizado de pasadores de silicona en el área de imagen. Para obtener imágenes óptimas, corte una lente de contacto de hidrogel disponible comercialmente para adaptarla al ojo del pez cebra mediante un perforador de papel.Llene la superficie cóncava de la lente con metilcelulosa, luego colóquela sobre la córnea. Equipe el sistema de tomografía de coherencia óptica con una lente de lámpara de hendidura no contactante de 78D. Enfoque la imagen infrarroja en el modo IR más OCT para visualizar el fondo del ojo.Luego, tome las imágenes de IR haciendo clic en el botón de adquisición para localizar los puntos del láser en la retina. A continuación, visualice una sección tridimensional de las capas retinianas en modo IR más OCT, y tome las imágenes haciendo clic en el botón de adquisición. Observe la gravedad de la lesión en la capa nuclear externa en estas imágenes.Para revertir la anestesia después del tratamiento y la obtención de imágenes, coloque los peces cebra en un recipiente que contenga agua de acuario. Para favorecer la recuperación, cree un flujo de agua de acuario fresca sobre las branquias moviendo los peces cebra hacia adelante y hacia atrás en el agua. Inmediatamente después del tratamiento con láser, se localizó una señal hiperreflejante difusa en la retina externa.Se extendía desde el epitelio pigmentado de la retina hasta la capa plexiforme externa. La señal hiperreflejante difusa está ausente en la retina del ojo control no lesado. Se detectó una señal hiperreflejante difusa similar el día uno después de la lesión.Después del tercer día, esta señal difusa se volvió más organizada y densa. Se observó de forma constante en la capa nuclear externa, extendiéndose hacia la capa de fotorreceptores. Tras la primera semana, hubo una disminución significativa del tamaño medio de la lesión, y solo se detectó una pequeña señal hiperreflejante.A partir del día 14 hasta el punto temporal más tardío investigado, las marcas láser ya no eran visibles en las imágenes de IR y OCT, y la morfología de la retina es comparable al lado control, como se observa aquí. Se utilizó tinción con H&E para investigar el grado y la cinética de la degeneración y regeneración retiniana. Esta imagen muestra la sección control.Esta imagen muestra la tinción con H&E tres días después de la lesión, cuando la pérdida máxima de fotorreceptores es evidente. Se realizó inmunohistoquímica para visualizar los marcadores de células gliales, la glutamina sintetasa en rojo y la proteína ácida fibrilar glial en verde. Esta imagen muestra una retina control en la que hay muy poca fluorescencia verde, lo que indica la presencia de GFAP.La señal de GFAP se reguló al alza en el día tres posterior a la lesión, mientras que la señal roja de la glutamina sintetasa permaneció sin cambios. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la microscopía de dos fotones, así como análisis celulares y moleculares, con el fin de estudiar la participación de las células moleculares en los mecanismos endógenos de reparación. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo inducir un daño focal en la retina del pez cebra y cómo monitorear in vivo los procesos degenerativos y regenerativos posteriores.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este video muestra un procedimiento para inducir la degeneración de la retina en peces cebra adultos utilizando lesiones por láser. El láser se dirige a las células fotorreceptoras de la retina, lo que provoca la muerte celular y un proceso degenerativo. Este daño activa las células de la glía de Müller (MG), lo que lleva a su desdiferenciación en progenitores de células madre que ayudan en la regeneración de la retina.

Modelado de la degeneración y regeneración de la retina en el pez cebra mediante una lesión focal con láser

Fuente: Lahne, M., et.al. Cultivo de explantes de retina de pez cebra transgénico adulto para obtención de imágenes de células vivas mediante microscopía multifotónica. J. Vis. Exp. (2017)Este video muestra imágenes de células vivas de la migración nuclear glial de Müller en explantes de retina de pez cebra incrustados en agarosa después del daño de los fotorreceptores inducido por la luz. El factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) liberado por los fotorreceptores dañados activa las células...

Imágenes de células vivas de la migración nuclear glial de Müller durante la regeneración de la retina del pez cebra

Aunque el sistema nervioso periférico (SNP) es capaz de reparación después de una lesión significativa, poco se sabe acerca de los mecanismos celulares y moleculares que rigen este fenómeno. El uso directo, el pez cebra transgénico y un ensayo de corte transversal del nervio reproducible, podemos estudiar los comportamientos de células gliales dinámicos durante la degeneración del nervio y la regeneración.

Motor transección del nervio y Time-lapse de imágenes de Conductas de células gliales en el pez cebra en vivo

Múltiples protocolos de daño de la luz se han descrito a daños fotorreceptores y, por consiguiente inducir una respuesta de la regeneración de la retina en adultos de pez cebra. Este protocolo describe un método mejorado que se puede utilizar en animales pigmentados y que daña la gran mayoría de la varilla y fotorreceptores de los conos a través de toda la retina.

Una novela ligera Paradigm daños para su uso en estudios de regeneración retiniana en adultos de pez cebra

Aquí demostramos cuantificación de de retina y la regeneración y su impacto en la función visual usando N-metil-N-nitrosourea en el pez cebra adulto. Pérdida de la agudeza visual y la disminución de los números de fotorreceptores fueron seguidos por la proliferación en la capa nuclear interna. Regeneración morfológica y funcional completa ocurrió 30 días después del tratamiento inicial.

Metilnitrosourea (MNU) inducida por la Retina Degeneración y Regeneración en el pez cebra: características histológicas y funcionales

Las manipulaciones dirigidas para causar estrés dirigido o muerte en células individuales han sido relativamente difíciles de lograr. Aquí, se describe un enfoque de ablación de resolución de una sola célula para estresar selectivamente y matar células individuales en cultivos celulares y animales vivos basado en un láser UV confocal estándar.

Desencadenar el estrés celular y la muerte Uso convencional UV láser confocal Microscopía

la regeneración de la retina del pez cebra en su mayoría se ha estudiado el uso de las retinas fijos. Sin embargo, los procesos dinámicos tales como la migración nuclear interkinetic se producen durante la respuesta regenerativa y requieren imágenes de células vivas para investigar los mecanismos subyacentes. A continuación, describimos las condiciones de cultivo y de imagen para controlar interkinetic Migración Nuclear (INM) en tiempo real usando microscopía multifotónica.

Cultura de adulto pez cebra transgénico de retina explantes de Células vivas imágenes de microscopía multifotónica

La ablación láser es una tecnología ampliamente aplicable para el estudio de la regeneración en sistemas biológicos. El protocolo presentado describe el uso de un microscopio confocal de escaneo láser estándar para la ablación láser y la posterior imagen de lapso de tiempo de las células interneuromas regeneradoras en la línea lateral del pez cebra.

Ensayo de regeneración y ablación láser basado en microscopio confocal en células interneuromas de peces cebra

El presente protocolo describe un método para inducir lesiones específicas de tejido y altamente reproducibles en larvas de pez cebra utilizando un sistema de lesiones láser combinado con una plataforma microfluídica automatizada para el manejo de larvas.

Lesiones controladas semiautomatizadas inducidas por láser para estudiar la regeneración de la médula espinal en larvas de pez cebra

El artículo explica cómo extirpar quirúrgicamente los ojos de las larvas vivas de pez cebra como el primer paso hacia la investigación de cómo la entrada de retina influye en el crecimiento y desarrollo del tectum óptico. Además, el artículo proporciona información sobre la anestesia larvaria, la fijación y la disección cerebral, seguida de inmunohistoquímica e imágenes confocales.

Extirpación de ojos en larvas vivas de pez cebra para examinar el crecimiento dependiente de la inervación y el desarrollo del sistema visual

Este protocolo describe la metodología para extirpar genéticamente el epitelio pigmentario de la retina (EPR) utilizando un modelo de pez cebra transgénico. La adaptación del protocolo para incorporar la modulación de la vía de señalización utilizando compuestos farmacológicos es ampliamente detallada. Se desarrolló una plataforma de MATLAB para cuantificar la regeneración de RPE basada en la pigmentación, que se presenta y discute.

Ablación mediada por nitrorreductasa/metronidazol y una plataforma MATLAB (RpEGEN) para estudiar la regeneración del epitelio pigmentario de la retina del pez cebra

Aprende a inducir daño retiniano focal con láser en Danio rerio y monitorear cambios celulares in vivo mediante OCT. Este método permite estudiar la activación de la glía de Müller durante la regeneración retiniana.

Activación de la célula de Müller glía en un modelo de regeneración en el pez cebra y degeneración retiniana inducida por láser

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