Activación de la célula de Müller glía en un modelo de regeneración en el pez cebra y degeneración retiniana inducida por láser

El objetivo general de este video es mostrar cómo monitorear los cambios celulares in vivo después de un daño retiniano focal inducido por láser en el pez cebra. Este modelo puede ayudarlo a responder preguntas clave de la regeneración de la retina, como los cambios morfológicos, la cinética, así como los tipos de células involucradas. La principal ventaja de esta técnica es que, al inducir una lesión focal, se pueden investigar los procesos biológicos directamente en el sitio de la lesión.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la regeneración de la retina del pez cebra, también se puede aplicar para estudiar el mecanismo de reparación en diferentes modelos animales. Prepare una solución madre de anestésico disolviendo 400 miligramos de polvo de tricaína en 97,9 milímetros de agua del tanque y 2,1 milímetros de TBS de un molar. Ajuste a pH 7.0 con un tris molar a pH 9.

Para hacer la solución de trabajo, diluya la solución madre de tricaína de 1 a 25 en el agua del tanque y transfiera 50 mililitros a una placa de Petri. Luego, coloque el pez cebra en la solución anestésica durante dos a cinco minutos hasta que quede inmóvil y no responda a los estímulos externos. Transfiera cada pez a mano a un soporte de alfiler de silicona hecho a medida para el tratamiento con láser.

La anestesia adecuada es fundamental para el bienestar del animal y el éxito del procedimiento. Por lo tanto, la solución de tricaína recién preparada es fundamental, y el tiempo fuera del agua no debe exceder los 10 minutos. Configure la potencia de salida del láser marcado de 532 nanómetros a 70 milivatios, la duración del pulso a 100 milisegundos y el diámetro de la antena a 50 micras.

A continuación, aplique una o dos gotas de hidroxipropilmetilcelulosa al 2% en el ojo. Cuando aplique metilcelda en el ojo, asegúrese de que la solución viscosa no entre en las branquias. A continuación, utilice una lente láser de fondo de ojo de 2 milímetros para enfocar el haz de puntería láser en la retina.

Coloque cuatro puntos láser alrededor del nervio óptico en el ojo izquierdo y use el ojo derecho sin tratar como control interno. Inmediatamente después de la inducción láser, coloque el pez cebra aún anestesiado en un soporte de alfiler de silicona hecho a medida en el área de imágenes. Para obtener imágenes óptimas, corte una lente de contacto de hidrogel disponible en el mercado para que se ajuste al ojo del pez cebra por medio de una perforadora.

Llene la superficie cóncava del cristalino con metilcelulosa y luego colóquela sobre la córnea. Equipe el sistema de tomografía de coherencia óptica con una lente de lámpara de hendidura sin contacto 78D. Enfoque la imagen infrarroja en el modo IR más OCT para visualizar el fondo del ojo.

A continuación, tome las imágenes IR haciendo clic en el botón adquirir para localizar los puntos láser en la retina. A continuación, visualice una sección tridimensional de las capas de la retina en modo IR más OCT, y tome las fotografías haciendo clic en el botón adquirir. Observe la gravedad de la lesión en la capa nuclear externa en estas imágenes.

Para revertir la anestesia después del tratamiento y la toma de imágenes, coloque el pez cebra en un recipiente que contenga agua del tanque. Para apoyar la recuperación, cree un flujo de agua dulce del tanque sobre las branquias moviendo el pez cebra hacia adelante y hacia atrás en el agua. Inmediatamente después del tratamiento con láser, se localizó una señal hiperreflectante difusa en la retina externa.

Se extendía desde el epitelio pigmentado de la retina hasta la capa plexiforme externa. La señal hiperreflectante difusa está ausente en la retina del ojo control no lesionado. Una señal hiperreflectante difusa similar detectada el primer día después de una lesión.

Después del tercer día, esta señal difusa se volvió más organizada y densa. Se observó constantemente en la capa nuclear externa, extendiéndose hacia la capa de fotorreceptores. Después de la primera semana, hubo una disminución significativa en el tamaño promedio de la lesión y solo se detectó una pequeña señal hiperreflectante.

A partir del día 14 hasta el último punto de tiempo investigado, los puntos láser ya no eran visibles en las imágenes IR y OCT, y la morfología de la retina es comparable al lado de control, que se ve aquí. La tinción con H&E se empleó para investigar el alcance y la cinética de la degeneración y regeneración de la retina. Esta imagen muestra la sección de control.

Esta imagen muestra la tinción de H&E tres días después de la lesión, cuando la pérdida máxima de fotorreceptores es evidente. Se realizó inmunohistoquímica para visualizar los marcadores de células gliales, glutamina sintetasa, en rojo, y proteína ácida fibrilar glial, en verde. Esta imagen muestra una retina de control donde hay muy poca fluorescencia verde, lo que es indicativo de GFAP.

La señal de GFAP se reguló al alza al tercer día después de la lesión, mientras que la señal de glutamina sintetasa roja permaneció sin cambios. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la microscopía de dos fotones, así como el análisis celular y molecular para estudiar la implicación de las células moleculares en los mecanismos de reparación endógena. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo inducir daño focal en la retina del pez cebra y monitorear in vivo los siguientes procesos degenerativos y regenerativos.