Preparación de hidrogeles inyectables basados en quitosano y su aplicación en cultivos celulares 3D

El objetivo general de este protocolo es preparar un hidrogel de quitosano inyectable para el cultivo celular tridimensional para su uso posterior en tratamientos terapéuticos. Este método puede responder a preguntas en el campo del hidrogel autorreparable, como por ejemplo, cómo hacer un hidrogel autocurativo sumergiéndolo por completo y cómo usarlo para el cultivo celular en 3D. La ventaja de esta técnica es que, mediante la compatibilidad con hidrogel autorreparable que se puede preparar de una manera muy sencilla, y el uso de un cultivo celular en 3D.

Este hidrogel también es inyectable, por lo que se puede utilizar como portador para la terapia celular. Ahora, el Sr. Yongsan Li le mostrará cómo hacer el hidrogel y cómo hacer el cultivo celular en 3D con este hidrogel. Yongsan Li es nuestro estudiante graduado de nuestro laboratorio.

Para hacer los hidrogeles, primero sintetiza DF PEG. En una campana extractora, pese cuatro gramos de 4.000 PEG de peso molecular en un matraz de fondo redondo y agregue 100 mililitros de tolueno. Luego, para disolver los polímeros, caliente la solución.

Después de que todos los polímeros se disuelvan, use un evaporador para eliminar todos los solventes. Luego, repita el proceso de mezclar el tolueno y evaporarlo dos veces más para preparar los polímeros PEG secos. A continuación, utilizando un agitador magnético y 100 mililitros de DHF, disuelva los polímeros.

A continuación, disuelva 0,9 gramos de 4-carboxibenzaldehído en la solución. A continuación, disuelva 0,07 gramos de dimetilaminopiramida en la solución. Ahora agregue 1,25 gramos de DCC en un tubo de secado lleno de cloruro de calcio anhidro.

Ahora deje que la reacción se revuelva a temperatura ambiente durante unas 12 horas. Al día siguiente, use 500 mililitros de éter dietílico frío para precipitar los sólidos blancos y use la filtración al vacío para recolectar los sólidos. Deseche el soluto y seque los sólidos con buena ventilación.

A continuación, disuelve los sólidos blancos en 100 mililitros de THF. Cualquier sólido blanco insoluble debe filtrarse antes de continuar. Ahora precipite los sólidos disueltos usando éter dietílico fresco y frío.

A continuación, utilice la filtración al vacío para recoger los sólidos y deje que se sequen de nuevo. Repita este proceso dos o tres veces y luego coloque los sólidos blancos en un horno de secado al vacío para secarlos por completo. El polvo blanco resultante es el producto final: DF PEG terminado en benzaldehído.

Para encapsular las células en el hidrogel para el cultivo, primero disuelva 0,44 gramos de DF PEG en dos mililitros de medio de crecimiento celular en un tubo de cuatro mililitros. Agrupe la mezcla en una solución del 20% en peso. A continuación, esterilice la solución.

Cárguelo en una jeringa de 10 mililitros y presiónelo a través de un filtro retenedor de bacterias de 0,22 micras. Ahora mezcle 0,165 gramos de glicol-quitosano con cuatro mililitros de medios de cultivo celular, usando un vórtice para hacer una solución de quitosano del 4% en peso. A continuación, esterilice la solución con otro filtro retenedor de bacterias de 0,22 micras.

A continuación, recoja las células, como las células L929, utilizando tripsina. Lave las células recolectadas y vuelva a suspenderlas en medios a 3,75 millones de células por mililitro. En el siguiente paso, las células se plantan en una matriz 3D.

Seguir estos pasos con precisión es fundamental para producir el éxito. Ahora mezcle 0,4 mililitros de la suspensión celular con 0,4 mililitros de solución de quitosano usando un vórtice. Pipetea esta mezcla en el centro de una placa de Petri de dos centímetros de diámetro y pipetea 0,2 mililitros de la solución DF PEG en la placa.

A continuación, utilice un pipeteo suave para inducir la formación del hidrogel. Evalúe la formación del hidrogel inclinando el plato y observando la viscosidad de la solución. Para probar la inyectabilidad de las células encapsuladas, haga la misma preparación en una jeringa de 10 mililitros.

Luego, después de que se forme el hidrogel, expulse lentamente el hidrogel a través de una aguja de calibre 48 en la placa de Petri. A continuación, agregue un mililitro de medio de cultivo a la mezcla de hidrogel y celda en la placa y transfiera la placa a una incubadora para el cultivo. Cada dos días, cambie el medio, superponiendo el cultivo de células de hidrogel 3D.

Para preparar las células encapsuladas en hidrogeles para la obtención de imágenes, primero enjuague los hidrogeles con un mililitro de PBS dos veces. A continuación, tiñe los hidrogeles con una solución de diacetato de fluoresceína y una solución de yoduro de propidio. Superponga 0,5 mililitros de ambas soluciones sobre el hidrogel e incube el hidrogel durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Después de la breve incubación con las soluciones de tinción, aspire todos los solventes. Ahora observe los hidrogeles usando microscopía confocal, con excitación a 488 nanómetros para ver células vivas y excitación a 543 nanómetros para ver células muertas. Recopile pilas de imágenes con cortes de dos micras para validar la distribución de las células en el hidrogel.

Células L929. Una línea celular típica de ratón y fibra de vidrio con una rigidez tisular en un entorno in vivo de aproximadamente 5.600 pascales se encapsuló en un hidrogel. Su viabilidad fue extremadamente alta durante todo el proceso de cultivo, y lograron una densidad celular notable.

Después de siete días de cultivo en el hidrogel, el número de células aumentó en un 200%Los hidrogeles que fueron expulsados a su placa de cultivo celular a través de una aguja de calibre 48 pudieron autocurarse para reformar un hidrogel integrado después de aproximadamente una hora. Después de siete días en cultivo, estas células también proliferaron drásticamente. Se pudo encontrar evidencia de eventos de fisión celular en los que algunas células aparecieron divididas en dos.

El ensayo vivo-muerto mostró una viabilidad muy alta, demostrando la proliferación celular exitosa en el hidrogel 3D después de la inyección. Esta tasa de proliferación celular fue aproximadamente 3/4 de la de las células no inyectadas después de siete días de cultivo. Por lo tanto, aunque la fuerza de corte durante la inyección tiene un efecto negativo medible, las células inyectadas seguían siendo bastante proliferativas.

Después de ver este video, debe saber cómo preparar un hidrogel autocurativo y cómo usar este hidrogel para el cultivo celular en 3D y cómo administrar la célula con este hidrogel. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una hora si se realiza correctamente. Después del mejor procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la inyección in vivo para la terapia celular o la administración de fármacos.