Name: Preparación de hidrogeles inyectables basados en quitosano y su aplicación en cultivos celulares 3D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-29T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Aprende a preparar hidrogeles inyectables de quitosano mediante química de iminas dinámicas para cultivos celulares tridimensionales. Este método permite ajustar las propiedades mecánicas y aplicar la terapia celular de forma mínimamente invasiva.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Esta investigación fue apoyada por la nacional Science Foundation de China (21474057 y 21604076).

PRECAUCIÓN: consulte todas las hojas de datos de seguridad del material (MSDS) antes de su uso. Utilice prácticas de seguridad apropiadas cuando se realizan experimentos de química, incluyendo el uso de una campana y equipo de protección personal (gafas, guantes, bata de laboratorio, etc.). El protocolo requiere célula estándar de manejo de técnicas (esterilización, recuperación de la célula, célula pases, congelación de células, tinción de células, etc.).
 1. preparación de hidrogeles <ol><li>síntesis de benzaldehído terminaron di-functionalized polietilenglicol (PEG DF) <ol><li>previa desecación de PEG polímero <ol><li>peso 4,00 g PEG (4.000 MW, 1.00 mmol), Transvasar a un matraz de fondo redondo (250 mL) y añadir tolueno (100 mL). 
			Nota: Otras clavijas con distintos pesos moleculares puede trabajar para la formación del hidrogel pero conducirá a rigidez diferentes.</li>
			<li>Calentar la solución por una pistola de calor (o una placa alrededor de 40 ° C) suavemente para ayudar a disolver los polímeros. Después de disuelven todos los polímeros, utilizar un evaporador para eliminar todos los solventes. Repita este proceso seco y disolver dos veces para hacer la espiga seca polímeros. 
			PRECAUCIÓN: Esto debe realizarse en una campana de humos con extremo cuidado. Tolueno es inflamable.</li>
		</ol></li> <li>Reacción de terminación benzaldehído de PEG <ol><li>añadir un agitador magnético y tetrahidrofurano (THF, 100 mL) al matraz y disolver con un agitador de PEG. Añadir 4-carboxybenzaldehyde (0,90 g, 6.0 mmol) y 4-dimethylaminopyridine (0,07 g, 0,6 mmol) secuencialmente a las soluciones para todos los sólidos se disuelven completamente.</li>
			<li>Agregar N, N &#39;-diciclohexilcarbodiimida (DCC, 1,25 g, 6.0 mmol) para la solución y añadir un tubo de secado que se llena con anhidro CaCl 2 al matraz. Mantener la reacción con agitación a temperatura ambiente (~ 20 ° C) para alrededor de 12 h.</li>
		</ol></li> <li>Proceso de la post-reacción <ol><li>filtrar los blancos sólidos generados en la solución de vacío después de que termine la reacción. Verter la solución en éter dietílico frío (500 mL), bajo agitación para precipitar los sólidos blancos. Reunir todos los sólidos blanco, filtro y secar los sólidos en una campana de humos.</li>
			<li>Disolver los sólidos blancos en THF otra vez, filtrar cualquier sólidos insolubles blanco, verter la solución en el éter dietílico frío fresco para precipitar los sólidos blancos y secarlo. Repita este proceso dos o tres veces y luego colocar los blancos sólidos en un horno de secado al vacío (20 ° C, 0.1 mbar) para secarlas totalmente. Recoger el polvo blanco como el producto final: benzaldehído terminada DF PEG.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Preparación de hidrogeles <ol><li>pesar diferentes cantidades de DF PEG (0,11 g, 0.028 mmol; 0,22 g, 0.055 mmol; 0,44 g, 0.110 mmol) en un tubo (10 mL), añadir agua desionizada (5,0 mL) y utilizar un vórtice o un agitador magnético para ayudar a disolver el polímero.</li>
		<li>Glicol quitosano (0,495 g, 6.18 x 10 -3 mmol) en agua desionizada (15,0 mL) en un tubo (50 mL) se disuelven y utilice un vortex durante unos minutos para homogeneizar la solución de quitosano (3% en peso).</li>
		<li>Añadir la solución de quitosano de glicol (0,2 mL, 3% en peso) y soluciones de PEG DF (0,2 mL) secuencialmente en un tubo (2.0 mL). Use un vortex para mezclar las soluciones homogéneamente para los hidrogeles forma en varios minutos. Siga las proporciones en la tabla 1 para hidrogeles de fuerzas mecánicas diferentes. 
		Nota: Utilice el método de inversión del tubo para determinar si el hidrogel ha formado ya.</li>
	</ol></li> <li>Análisis de reología <ol><li>llevar a cabo análisis de reología en un reómetro rotacional con una placa de acero paralelo (diámetro: 20 mm). Para la prueba de congelación, Difunda la solución de quitosano de glicol (0,2 mL, 3% en peso) en una placa inferior. Luego, añadir disoluciones acuosas de PEG DF (0.2 mL, 2% en peso) uniformemente gota a gota sobre la superficie de la solución de quitosano y mezclar rápidamente con una pipeta. Más bajo abajo de la placa superior y comenzar a test</li>
		<li>De hidrogel &#39; prueba de rigidez de s, cortar un hidrogel en un círculo (diámetro: 20 mm) y medir el módulo de almacenamiento (G &#39;) valores versus análisis de frecuencia en la tensión del 1%. G típico &#39; valores en s rad 6,3 &#8722; 1 se enumeran en la tabla 1. 
		Nota: Llevar a cabo los análisis reológicos de hidrogel 0.5 h después de la formación del hidrogel para estabilización de vínculo dinámico del hidrogel.</li>
		<li>Para el hidrogel &#39; s uno mismo-healable propiedad prueba, corta un hidrogel para piezas y juntar las piezas para self-heal a una pieza integral. Luego cortar el hidrogel para hacer un círculo (diámetro: 20 mm) y el Reómetro para llevar a cabo el análisis de la reología.</li>
	</ol></li></ol> 2. 3D cultivo celular en hidrogeles <ol><li>preparación de soluciones de gelificación de hidrogel <ol><li>pesar DF PEG (0,44 g, 0.11 mmol) en un tubo estéril (4,0 mL), añadir en medios de cultivo celular (RPMI-1640, 2.0 mL) y utilice un vortex o agitador para ayudar a disolver el polímero para obtener la solución de polímero (20% de peso). Cargar la solución en una jeringa (10,0 mL) y luego la esterilización haciéndola pasar por un filtro de retención de bacterias micrones (0,22 μm).</li>
		<li>Pesar del glicol quitosano (0,165 g, 2.06 x 10 -3 mmol) en un tubo estéril (15,0 mL), añadir en medios de cultivo celular (RPMI-1640, 4,0 mL) y agitar para ayudar a disolver el polímero para obtener la solución de quitosano de glicol (4,0% en peso). Cargar la solución en una jeringa (10,0 mL) y filtrarla con un filtro de 0,22 μm bacterias retentiva.</li>
	</ol></li> <li>Cultivo de célula en hidrogeles PRECAUCIÓN: realizar todos los procedimientos relacionados en una campana de cultivo de tejidos de la célula. Se espera que los conocimientos básicos de la técnica estéril.
	<ol><li>Preparación de la suspensión celular <ol><li>cultura elución de L929 células en RPMI-1640 suplementado con 10% FBS, penicilina 5% (10 mL) en una Petri dish (diámetro 10 cm) e incubar a 37 ° C, 5% CO 2. Cambiar el medio cada día antes de su uso.</li>
			<li>Cosechar las células de la elución de L929 con PBS con tripsina (0,025% de w/v) y EDTA (0.01% w/v), luego centrifugar (70 x g, 5 min) y resuspender las células en el Medio RPMI-1640 (1,0 mL). Realizar el recuento celular mediante operación estándar del tablero de conteo de sangre. Resuspenda las células para regular la concentración de células a ~ 3.75 x 10 6 células/mL.</li>
		</ol></li> <li>Encapsulación celular en hidrogeles <ol><li>mezclar las suspensiones celulares de elución de L929 (0,4 mL, 3.75 x 10 6 células mL -1) con solución de quitosano de glicol (0,4 mL) en un tubo (4,0 mL) en el vórtex. Pipetear la solución de quitosano de elución de L929 glicol (0,8 mL) en el centro de un plato de Petri confocal (diámetro 2,0 cm). Pipetear las soluciones PEG DF (0,2 mL) en el mismo plato y pipetee suavemente para mezclar la solución e inducir la formación de hidrogel. 
			Nota: Evaluar la formación del hidrogel inclinando la caja Petri.</li>
			<li>Para el cultivo de celular directo, añadir cantidades adicionales de medio de cultivo RPMI-1640 (1,0 mL) sobre el hidrogel. Poner los célula encajado los hidrogeles (1,0 mL, 1,5 wt % glicol quitosano, 4,0% en DF PEG, 1,5 × 10 6 células mL -1) en una incubadora (37 ° C, 5% CO 2) y cambiar el medio cada día. Preparar para la proyección de imagen de la célula en día 1, 3, 5 y 7 después de la encapsulación de la célula.</li>
		</ol></li> <li>Para el cultivo posterior de celular 3D en hidrogeles después de la inyección, preparar celular cargado hidrogel (1,0 mL, consulte el paso 2.2.2) en una jeringa (10,0 mL, aguja de 48 G). Después de las formas de hidrogel, inyecte lentamente el hidrogel en una placa de Petri para la proyección de imagen confocal. Añadir una cantidad adicional de medios de cultivo (1,0 mL) sobre el hidrogel y cambiarlo todos los días. Poner el plato Petri en una incubadora (37 ° C, 5% CO 2) y prepararse para luego la proyección de imagen. 
		PRECAUCIÓN: Por favor verificar y seguir el protocolo de operación de seguridad de una jeringa de.</li>
	</ol></li> <li>Análisis de la viabilidad celular <ol><li>observación Confocal <ol>
			<li>Enjuague los hidrogeles con PBS (1,0 mL) dos veces. Mancha de los hidrogeles con fluoresceína diacetato (FDA, 0.5 mL, 0.05 mg/mL) y soluciones de (PI, 0.08 mg/mL y 0,5 mL) de yoduro de propidio durante 15 min. Después de la tinción, quite todos los solventes.</li>
			<li>Observar los hidrogeles utilizando un microscopio confocal en longitudes de onda de excitación de 488 nm y 543 nm para visualizar en vivo y muerto de las células, respectivamente. Tomar z-pilas a través de cada profundidad de 2 μm de los hidrogeles para validar una distribución uniforme de las células a lo largo de. 
			Nota: FDA tiñe células vivas mientras las células muertas de las manchas de la PI.</li>
		</ol></li> <li>Degradar el hidrogel (1,0 mL) con ácido acético (HAc, 3% v, 1,0 mL) por 5 min y pipeta en un tubo (4,0 mL). Recoge las células de la centrífuga (70 x g, 5 min) y resuspender las células en el medio de cultivo RPMI-1640 celular (1,0 mL). Realizar la célula cuenta con un tablero de conteo de sangre.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Hoffman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug.+Deliver.+Rev%22%5BJournal%5D)">Hydrogels for biomedical applications.</a> Adv. Drug. Deliver. Rev. 64, 18-23 (2012).</li>
<li>Seliktar, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+cell-compatible+hydrogels+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Designing cell-compatible hydrogels for biomedical applications.</a> Science. 336 (6085), 1124-1128 (2012).</li>
<li>Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrogels+as+extracellular+matrix+mimics+for+3D+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture.</a> Biotechnol. Bioeng. 103 (4), 655-663 (2009).</li>
<li>Sawicki, L. A., Kloxin, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-mediated+Formation+and+Patterning+of+Hydrogels+for+Cell+Culture+Applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Light-mediated Formation and Patterning of Hydrogels for Cell Culture Applications.</a> J. Vis. Exp. (115), (2016).</li>
<li>Haycock, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+cell+culture%3A+a+review+of+current+approaches+and+techniques%5BTitle%5D)+AND+%223D+Cell+Culture%3A+Methods+and+Protocols%22%5BJournal%5D)">3D cell culture: a review of current approaches and techniques.</a> 3D Cell Culture: Methods and Protocols. , 1-15 (2011).</li>
<li>Breslin, S., O’Driscoll, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture%3A+the+missing+link+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug.+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture: the missing link in drug discovery.</a> Drug. Discov. Today. 18 (5), 240-249 (2013).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/255762985_Facilely_prepared_inexpensive_and_biocompatible_self-healing_hydrogel_A_new_injectable_cell_therapy_carrier">Facilely prepared inexpensive and biocompatible self-healing hydrogel: a new injectable cell therapy carrier.</a> Polym. Chem. 3 (12), 3235-3238 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., Tao, L., Li, S., Wei, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+multiresponsive+and+dynamic+chitosan-based+hydrogels+for+controlled+release+of+bioactive+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Synthesis of multiresponsive and dynamic chitosan-based hydrogels for controlled release of bioactive molecules.</a> Biomacromolecules. 12 (8), 2894-2901 (2011).</li>
<li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2015/TB/c4tb01705f#!divAbstract">An injectable hydrogel formed by in situ cross-linking of glycol chitosan and multi-benzaldehyde functionalized PEG analogues for cartilage tissue engineering.</a> J. Mater. Chem. B. 3 (7), 1268-1280 (2015).</li>
<li>Ding, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dynamic+and+self-crosslinked+polysaccharide+hydrogel+with+autonomous+self-healing+ability%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">A dynamic and self-crosslinked polysaccharide hydrogel with autonomous self-healing ability.</a> Soft Matter. 11 (20), 3971-3976 (2015).</li>
<li>Wei, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-healing+gels+based+on+constitutional+dynamic+chemistry+and+their+potential+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Self-healing gels based on constitutional dynamic chemistry and their potential applications.</a> Chem. Soc. Rev. 43 (23), 8114-8131 (2014).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulus-regulated+3D-cell+proliferation+in+an+injectable+self-healing+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid.+Surface.+B%22%5BJournal%5D)">Modulus-regulated 3D-cell proliferation in an injectable self-healing hydrogel.</a> Colloid. Surface. B. 149, 168-173 (2017).</li>
<li>Tseng, T. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Injectable%2C+Self%E2%80%90Healing+Hydrogel+to+Repair+the+Central+Nervous+System%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">An Injectable, Self‐Healing Hydrogel to Repair the Central Nervous System.</a> Adv. Mater. 27 (23), 3518-3524 (2015).</li>
<li>Yu, L., Ding, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Injectable+hydrogels+as+unique+biomedical+materials%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">Injectable hydrogels as unique biomedical materials.</a> Chem. Soc. Rev. 37 (8), 1473-1481 (2008).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2017/py/c7py00112f#!divAbstract">Improving Tumor Chemotherapy Effect by Using an Injectable Self-healing Hydrogel as Drug Carrier.</a> Polym. Chem. , (2017).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/Content/ArticleLanding/2012/CC/c2cc34745h#!divAbstract">A magnetic self-healing hydrogel.</a> Chem. Commun. 48 (74), 9305-9307 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2017/py/c6py01704e#!divAbstract">Synthesis of an injectable, self-healable and dual responsive hydrogel for drug delivery and 3D cell cultivation.</a> Polym. Chem. 8 (3), 537-534 (2017).</li>
<li>Yang, C., Tibbitt, M. W., Basta, L., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+memory+and+dosing+influence+stem+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Mechanical memory and dosing influence stem cell fate.</a> Nat. Mater. 13 (6), 645-652 (2014).</li>
<li>Geerligs, M., Peters, G. W., Ackermans, P. A., Oomens, C. W., Baaijens, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+viscoelastic+behavior+of+subcutaneous+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Biorheology%22%5BJournal%5D)">Linear viscoelastic behavior of subcutaneous adipose tissue.</a> Biorheology. 45 (6), 677-688 (2008).</li>
<li>Banerjee, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+hydrogel+modulus+on+the+proliferation+and+differentiation+of+encapsulated+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The influence of hydrogel modulus on the proliferation and differentiation of encapsulated neural stem cells.</a> Biomaterials. 30 (27), 4695-4699 (2009).</li>
<li>Benoit, D. S., Schwartz, M. P., Durney, A. R., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+functional+groups+for+controlled+differentiation+of+hydrogel-encapsulated+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Mater%22%5BJournal%5D)">Small functional groups for controlled differentiation of hydrogel-encapsulated human mesenchymal stem cells.</a> Nat. Mater. 7 (10), 816-823 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El hidrogel en este protocolo (figura 1) tiene dos componentes principales: el quitosano de glicol polímero natural y una sintética benzaldehído terminaron gelator polímero DF PEG, que son ambos materiales biocompatibles. Síntesis de DF PEG se presentan mediante una reacción de modificación de un solo paso. PEG de peso molecular 4.000 fue elegida en el presente Protocolo en preocupaciones de solubilidad, eficacia de la modificación, así como rigidez de hidrogel. Una serie de hidrogeles con d...

Los hidrogeles son materiales de polímero reticulado con grandes cantidades de agua y propiedades mecánicas, suaves, y se han utilizado en muchas aplicaciones biomédicas1,2. Los hidrogeles pueden ofrecer un ambiente suave y húmedo, que es muy similar al entorno fisiológico de las células en vivo. Por lo tanto, los hidrogeles se han convertido en uno de los más populares andamios para celular 3D cultura3,4. Comparado con el cultivo celular 2D de Petri, cultivo celular 3D ha avanzado rápidamente para ofrecer que una matriz extracelular (ECM) mímico el microambiente de las células en contacto con y ensamblar para propósitos de proliferación y diferenciación5. Además, los hidrogeles que contienen polímeros naturales podrían ofrecer ambientes bio-compatibles y promover para que las células proliferan y diferencian3. Hidrogeles derivados de polímeros sintéticos se prefieren para sus componentes simples y claras, que excluye influencias complejas como las proteínas de origen animal o virus. Entre todos los candidatos de hidrogel para el cultivo celular 3D, siempre se prefieren los hidrogeles que fácilmente están preparados y tienen una propiedad constante. La facilidad para ajustar propiedades de hidrogel para adaptarse a requisitos de la investigación es importante como bien6.
Aquí presentamos una fácil preparación de un hidrogel de glicol basados en quitosano utilizando química dinámica imina, que se convierte en una plataforma versátil de hidrogel para celular 3D cultura7. En este método, bien conocido de bio-compatibles de glicol quitosano se utilizan para establecer los marcos de las redes de hidrogel. Sus grupos aminos se reaccionaron con un polietilenglicol benzaldehído terminada como el gelator de polímero para formar la imina dinámica bonos como crosslinkages de hidrogeles8. Bonos de imina dinámica pueden formar y descomponer reversible y sensiblemente al entorno, dotando los hidrogeles con reticulado mecánicamente ajustable redes9,10,11. Debido a su contenido alto de agua, materiales bio-compatibles y fuerzas mecánicas ajustables, el hidrogel se aplica con éxito como un andamio para la elución de L929 células en 3D de la célula cultura12,13. El protocolo aquí detalles de los procedimientos, incluyendo la síntesis del polímero gelator hidrogel preparación, incrustación de célula y cultivo celular 3D.
El hidrogel también muestra varias otras características debido a su crosslinkages imina dinámico, incluyendo su múltiples sensibles a varios estímulos de bio (ácido/pH, piridoxal derivado de la vitamina B6, la papaína de la proteína, etc.), indicando que podría ser el hidrogel inducida que se descomponen bajo condiciones fisiológicas8. El hidrogel es también uno mismo-healable e inyectables, que significa el hidrogel podría ser administrado a través de un método de inyección invasiva mínima y obtener una ventaja en drogas y celulares entregas14,15. Mediante la adición de aditivos funcionales o gelators del polímero específico prediseñado, el hidrogel es compatible para obtener propiedades específicas como magnético, temperatura, pH de receptivo, etc.16,17, que podría satisfacer un amplia gama de necesidades de investigación. Esas propiedades revelan capacidad potencial de hidrogel que un inyectable múltiples portadores de drogas y células en investigación bio-médica en vitro y en vivo y aplicaciones.

<table><tbody><tr><td>Glicol quitosano</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>39280-86-9</td><td>90% de grado de desacetilación</td></tr><tr><td>4-Carboxibenzaldehído</td><td>Aladdin de Shanghái &nbsp; Bio-Chem Technology Co., LTD</td><td>619-66-9</td><td>99%</td></tr><tr><td>N, N'-diciclohexiilcarbodiimida</td><td>Shanghai Aladdin &nbsp; Bio-Chem Technology Co., LTD</td><td>538-75-0</td><td>99%</td></tr> <tr><td>Cloruro de calcio anhidro</td><td>Aladdin de Shanghái &nbsp; Bio-Chem Technology Co., LTD</td><td>10043-52-4</td><td>96%</td></tr><tr><td>4-dimetilamiopriidina</td><td>Aladdin de Shanghái &nbsp; Bio-Chem Technology Co.,LTD</td><td>1122-58</td><td>99%</td></tr><tr><td>Polietilenglicol</td><td>Reactivo químico Sino-pharm</td><td>5254-43-7</td><td>99%</td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano</td><td>Reactivo químico Sino-pharm</td><td>109-99-9</td><td>99%</td></tr><tr><td>Tolueno</td><td>Reactivo químico Sino-pharm</td><td>108-88-3</td><td>99%</td></tr><tr><td>Éter etílico</td><td>Reactivo químico Sino-pharm</td><td>60-29-7</td><td>99%</td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sino-pharm Reactivo químico</td><td>64-19-7</td><td>99%</td></tr><tr><td>CaCl2 anhidro</td><td>Reactivo químico Sino-pharm</td><td>10043-52-4</td><td>99%</td></tr><tr><td>Diacetato de fluoresceína</td><td>Sigma</td><td>596-09-8</td><td>99%</td></tr><tr><td>Yoduro de propidio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>25535-16-4</td><td>94%</td></tr><tr><td>RPMI-1640 medio de cultivo</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Gibco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td></td><td>0.25%</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Solarbio</td><td></td><td>0.01 M</td></tr><tr><td>Solución de estreptomicina penicilina</td><td>Hyclone</td><td></td><td>10,000 U/mL</td></tr><tr><td>Reómetro</td><td>TA Instrument</td><td></td><td>AR-G2</td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td>710-3 canales</td></tr><tr><td>L929 Células</td><td>ATCC</td><td></td><td>NCTC clon 929; Célula L, L929, derivado de la cepa L</td></tr><tr><td>Evaporador</td><td>EYELA</td><td></td><td>N-1100</td></tr><tr><td>aguja de calibre 48</td><td>ShanghaiZhiyu Medical Material Co., LTD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td> de calibre 48 <td>Leica</td><td></td><td>DM3000 B</td></tr><tr><td>Software de microscopio</td><td>Imaris</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pistola de calor</td><td>Confu</td><td></td><td>KF-5843&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>NEST</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

preparación de hidrogeles inyectables basados en quitosano y su aplicación en cultivos celulares 3d

Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

El protocolo presenta un método fácil, eficaz y versátil para preparar Hidrogeles basados en chitosán usando química dinámica imina. El hidrogel se prepara mezclando soluciones de glicol quitosano con un gelator de polímero sintetizado benzaldehído terminado y eficientemente se obtienen hidrogeles en varios minutos a temperatura ambiente. Por relaciones diferentes entre glicol quitosano, gelator de polímero y el contenido de agua, se obtienen hidrogeles versátiles con tiempos de congelación diferentes y rigidez. Cuando está dañada, el hidrogel puede recuperar sus apariciones y el módulo, debido a la reversibilidad de los bonos de imina dinámicos como crosslinkages. Esta propiedad la healable permite el hidrogel que inyectable puesto que puede ser auto curado de piezas exprimidas a un hidrogel a granel integral después del proceso de inyección. El hidrogel es también múltiple sensible a muchos estímulos bioactivos debido a Estados de equilibrio diferentes de los bonos de imina dinámico. Este hidrogel fue confirmado como bio-compatibles y células de fibroblasto de ratón de elución de L929 fueron integrados siguientes procedimientos estándar y fácilmente se evaluó la proliferación celular por un proceso de cultivo celular 3D. El hidrogel puede ofrecer una plataforma ajustable para diferentes investigaciones donde es beneficiado un imitador fisiológico de un entorno 3D para las células. Junto con sus propiedades múltiples de respuesta, uno mismo-healable e inyectables, los hidrogeles pueden aplicarse potencialmente como portadores de múltiples drogas y células en futuras aplicaciones de bio-médica.

Una presentación esquemática de este protocolo en la preparación del hidrogel y su uso como cultivo celular 3D se ofrece en la figura 1. Información de contenidos y relaciones con diversas fuerzas mecánicas el hidrogel se resume en la tabla 1. El hidrogel de uno mismo-healable y propiedad de reología presenta rigidez de hidrogel por módulo de almacenamiento versus frecuencia de prueba en la figura 2. Las imágenes confocales celular y número de c...

Aquí describimos una fácil preparación de hidrogeles inyectables basados en quitosano utilizando química dinámica imina. Se presentan métodos para ajustar la fuerza mecánica de hidrogel y su aplicación en cultivos celulares 3D.

Preparación de hidrogeles inyectables basados en quitosano y su aplicación en cultivos celulares 3D

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is ...

El objetivo general de este protocolo es preparar un hidrogel inyectable de quitosano para cultivo celular tridimensional que finalmente se utilizará en tratamientos terapéuticos. Este método puede responder preguntas en el campo de los hidrogeles autorreparables, como cómo elaborar un hidrogel autorreparable mediante un procedimiento completo por inmersión y cómo emplearlo en cultivo celular 3D. La principal ventaja de esta técnica radica en que un hidrogel autorreparable biocompatible puede prepararse de manera muy sencilla, además de su aplicación en cultivo celular tridimensional.Este hidrogel también es inyectable, por lo que puede utilizarse como vehículo para la terapia celular. Ahora el Sr. Yongsan Li les mostrará cómo elaborar el hidrogel y cómo realizar el cultivo celular tridimensional utilizando este hidrogel. Yongsan Li es nuestro estudiante de posgrado en nuestro laboratorio.Para elaborar los hidrogeles, primero sintetice PEG DF. En un extractor de gases, pese cuatro gramos de PEG de peso molecular 4.000 en un matraz redondo, y agregue 100 mililitros de tolueno. Luego, para disolver los polímeros, caliente la solución.Después de que todos los polímeros se disuelvan, u

preparation-chitosan-based-injectable-hydrogels-its-application-3d

Research

Investigación

JoVE Journal

Chemistry

Química

Un obstáculo importante en las actuales terapias con células madre es determinar el método más eficaz para proporcionar a estas células a los tejidos del huésped. A continuación, describimos un método de entrega basado en quitosano que sea eficiente y simple en el planteamiento, al tiempo que permite derivadas de tejido adiposo de células madre para mantener su multipotencia.

La construcción de un hidrogel de colágeno para la entrega de la madre microesferas cargadas con células quitosano

Un bioprinter se utilizó para crear hidrogeles modelado basado en un molde de sacrificio. El molde poloxámero se rellenó con un segundo hidrogel y luego se eluyó, dejando huecos que estaban llenos de una tercera hidrogel. Este método utiliza elución rápida y buena capacidad de impresión de poloxámero para generar arquitecturas complejas a partir de biopolímeros.

Impresión Moldes inversa termosensible para la Creación de modelado hidrogeles de dos componentes para el 3D de cultivo celular

La reparación del cartílago representa un desafío médico no resuelto y los enfoques basados en células para diseñar el cartílago articular humano son una solución prometedora. Aquí, describimos los hidrogeles biomiméticos tridimensionales (3D) como una herramienta ideal para la expansión y maduración de los condrocitos articulares humanos.

3D hidrogel andamios para articular condrocitos cultura y cartílago Generación

Un andamio de la ingeniería de tejidos inyectable compuesto de poli (N-isopropilacrilamida) sulfato de condroitina-injertado (PNIPAAm-g-CS) que contienen micropartículas de alginato se preparó. La fuerza adhesiva, propiedades de hinchamiento y en la biocompatibilidad in vitro se analizaron en este estudio. Las técnicas de caracterización desarrolladas aquí pueden ser aplicables a otros sistemas de termogelificación.

Síntesis de termogelificante poli (N-isopropilacrilamida) compuestos de sulfato de condroitina-injertado con alginato micropartículas de Ingeniería de Tejidos

Este es un método para crear un andamio de cultivo celular de 3 dimensiones de la matriz extracelular pulmonar. pulmonar intacta se procesa en hidrogeles que pueden apoyar el crecimiento de células en tres dimensiones.

Los hidrogeles sintonizable de la matriz extracelular pulmonar por la 3D de Cultivos Celulares

Diferentes métodos para manipular arquitectura tridimensional en Hidrogeles basados en proteína se evalúan aquí con respecto a las propiedades del material. Las redes macroporoso son funcionalizadas con un péptido de la célula-adhesivo, y se evalúa su viabilidad en cultivo de células utilizando dos líneas celulares de diferentes modelos.

Fácil manipulación de arquitecturas en Hidrogeles basados en proteínas para aplicaciones de la cultura de célula

Este protocolo describe la fabricación de microcryogels elástico macroporoso 3D integrando microfabricación con tecnología cryogelation. A cargar con las células, se generan microtissues 3D, que puede ser fácilmente inyectados en vivo para facilitar la terapia regenerativa o montado en arreglos de discos para en vitro screening de drogas de alto rendimiento.

Microtissues 3D para la terapia regenerativa inyectable y drogas de alto rendimiento

Aquí, presentamos un protocolo para obtener sistemas 3D-cultura en uno mismo-montaje de andamios péptido para promover la diferenciación de condrocitos articulares humanos dedifferentiated en tejido similar al cartílago.

Cultivo de células de mamífero en andamios tridimensionales péptido

Hidrogeles de ingeniería de la proteína recombinantes son ventajosos para el cultivo celular 3D ya que permiten completa afinabilidad de la espina dorsal del polímero y por lo tanto, el microambiente de la célula. Aquí, describimos el proceso de purificación de proteína recombinante como elastina y su aplicación en la encapsulación de la célula de hidrogel 3D.

Producción de la proteína elastina como hidrogeles para encapsulación y el Immunostaining de células en 3D

Aquí, presentamos protocolos de cultivo de esferoides celulares del ligamento periodontal humano (PDL) por películas de quitosano. El cultivo de esferoides celulares tridimensionales (3D) proporciona una alternativa al sistema de cultivo de poliestireno (TCPS) de cultivo tisular convencional.

Formación de esferoides de células de ligamento periodontal humano en Chitosan Films

El presente protocolo describe un método no basado en emulsiones para la fabricación de microgeles de quitosano-genipina. El tamaño de estos microgeles se puede controlar con precisión, y pueden mostrar hinchazón dependiente del pH, degradarse in vivo y cargarse con moléculas terapéuticas que se liberan con el tiempo de manera sostenida, lo que las hace altamente relevantes para aplicaciones de ingeniería de tejidos.

Fabricación de microgeles de quitosano-genipina de tamaño controlado y sin emulsión para aplicaciones de ingeniería de tejidos

Aprende a preparar hidrogeles inyectables de quitosano mediante química de iminas dinámicas para cultivos celulares tridimensionales. Este método permite ajustar las propiedades mecánicas y aplicar la terapia celular de forma mínimamente invasiva.

Preparación de hidrogeles inyectables basados en quitosano y su aplicación en cultivos celulares 3D

Explorar más videos