Name: Desensibilización y recuperación de fotorreceptores de cangrejo de río tras la entrega de un estímulo ligero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-11-09T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Aprende a estudiar la desensibilización y recuperación de fotorreceptores de cangrejo de río en función del tiempo circadiano mediante registros eléctricos intracelulares. Este método permite medir la actividad eléctrica celular sin alterar el medio intracelular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por la subvención DGAPA-UNAM IN224616-RN224616. Los autores quieren agradecer a la Sra. Josefina Bolado, Jefa del Departamento de Traducción de Documentos Científicos, de la División de Investigación de la Facultad de Medicina de la UNAM, unaM, por editar la versión en inglés de este manuscrito.

NOTA: Los experimentos cumplen con las Leyes de Protección Animal de México.
1. Configuración experimental
<ol><li>Conexiones generales<ol>
<li>Conecte el amplificador a un ordenador adecuado a través de un convertidor analógico a digital y utilice un osciloscopio para supervisar el experimento(Figura 1).</li>
		<li>Conecte el fotoestimulador al A/D convertido.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cámara de grabación<ol>
<li>Coloque la cámara de grabación encima de una mesa antivibración y localícela dentro de una jaula de Faraday. NOTA: Esto evita las vibraciones mecánicas y el ruido eléctrico que pueden afectar a la grabación. Nuestra jaula Faraday estaba hecha de malla de alambre oscurecida. Se utiliza una cámara de grabación de acrílico casera de 2 ml (Figura 2).</li>
		<li>Preparar la solución de baño para mantener viva la preparación13: 205 mM NaCl; 5 mM KCl; 2 mM MgSO4; 13 mM CaCl2; 5 mM Hepes-NaOH, pH 7.3. NOTA: La solución no incluye dextrosa ni cualquier burbujeo en un 95% O2, una mezcla deCO2 al 5% porque el procedimiento experimental es lo suficientemente corto como para detectar daños por el registro eléctrico (ver paso 4.2.3 para ver la integridad).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Electrodos<ol>
<li>Utilice un electrodo de alambre de plata recubierto de cloruro como electrodo de referencia NOTA: El recubrimiento de cloruro de plata es necesario para permitir la reacción del electrodo: AgCl(s) + e-↔ Ag(s) + Cl-.</li>
		<li>Lijar un alambre de plata (espesor de 1 mm, longitud de 10 cm) con un papel de esmeruja de grado fino para limpiar su superficie.</li>
		<li>Enjuague el alambre de plata con agua destilada.</li>
		<li>Sumerja el alambre de plata limpio en una solución de hipoclorito de sodio (NaClO) de 4-6% hasta que parezca oscuro (aproximadamente 20 min).</li>
		<li>Utilice pipetas de vidrio fino llenas de una solución de electrolitos (2,7 M KCl) como electrodo intracelular.</li>
		<li>Tire de un tubo capilar de vidrio (diámetro interno de 1 mm) con un tirador de micropipeta para obtener una punta delgada con una pequeña abertura (0,01-0,1 m)14.</li>
		<li>Llene el vidrio capilar tirado con una solución de 2.7 M KCl. Primero llénalo por capilaridad (sumerja la punta de la pipeta en la solución kCl de 2,7 M) y luego llene la mitad de la pipeta con una aguja de inyección fina. Si es necesario, toque la pipeta del electrodo para eliminar las burbujas de aire.</li>
		<li>Conecte el electrodo a su soporte. Conecte el soporte al cabezal del amplificador con el amplificador. Coloque el cabezal del soporte del electrodo con un micromanipulador 3D estable. Baje el electrodo hasta que la solución de baño cubra su punta. NOTA: El electrodo debe tener una orientación vertical</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seleccione el modo puente del amplificador (en la sección Modo del amplificador, pulse el botón Puente) y mida la resistencia del electrodo. Asegúrese de que la resistencia es de aproximadamente 50 Ma 11. NOTA: Este tamaño del electrodo permite una grabación eléctrica de buena calidad con daños limitados a la célula.</li>
	<li>Anule la corriente de desplazamiento y compense los transitorios capacitivos utilizando el botón Posición de sujeción en la sección Abrazadera de voltaje del amplificador y el botón neutralización de la capacitancia en la sección Microelectrodo 1 del amplificador.</li>
	<li>Sistema de superfusión<ol>
<li>Vierta la solución de baño (paso 1.2.2) en un recipiente adecuado (una botella de suero de 250 ml) y conéctela a un juego de tubos de riego (3,2 mm de diámetro interno), conectando así la cámara de grabación. Utilice un sistema de superfusión impulsado por gravedad. Regula el caudal a 0,5 ml/s.</li>
		<li>Conecte la cámara a un dispositivo de aspiración. Regular el sistema de aspiración de la solución de tal manera que el volumen total de la cámara de grabación no varíe. Utilice una bomba de vacío para la succión. NOTA: Un volumen constante en la cámara de grabación es importante para mantener constantes las capacitancias perdidas durante todo el experimento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Material biológico
Nota: Utilice cangrejos adultos P. clarkii (7-10 cm de largo) en la etapa intermot del sexo indistinto.
<ol><li>Tiempo circadiano<ol>
<li>Un mes antes de los experimentos, mantener 100 cangrejos bajo un ciclo oscuro de 12 h de luz/12-h15 (luz blanca, 2,4 kW/m2). NOTA: Un mes es tiempo suficiente para sincronizar la población de cangrejos de río.</li>
		<li>Determinar la hora circadiana de la población de cangrejos de río mediante la evaluación de la amplitud de los electroretinogramas de cinco animales elegidos al azar15. NOTA: 0 h hora circadiana (CT 0) indica el comienzo de un día subjetivo, es decir,el tiempo durante el cual un organismo está normalmente activo16,17,18,19 (Figura 3). El cangrejo de río es un animal nocturno, por lo que bajo un ciclo oscuro de 12 h de luz/12 h, está activo durante la fase oscura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Procedimiento de aislamiento de Eyestalk<ol>
<li>A la hora circadiana deseada, anestesia un cangrejo de río seleccionado por inmersión en agua del grifo a 0-4 oC, durante 15 min.</li>
		<li>Por medio de una tijera fina, separe el tallo de los ojos de la base.</li>
		<li>Acceda a la retina con una cuchilla de afeitar para hacer una abertura (1 mmy 2) en la córnea dorsal.</li>
		<li>Coloque el tallo en el centro de la cámara de registro (el orificio cubierto de silicona) con la abertura de acceso a la retina en la parte superior de la cámara.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mantenga los ojos en constante oscuridad durante 20 minutos. NOTA: 20 min es tiempo suficiente para que la célula del fotorreceptor esté completamente oscura adaptada.</li>
</ol>3. Empalandamiento del fotorreceptor
<ol><li>Ponga el microelectrodo y el eje longitudinal del talla ocular paralelos de tal manera que el microelectrodo esté centrado para el acceso a la retina. Utilice un microscopio estereoscópico (10X) para colocar los dispositivos en la configuración correcta.</li>
	<li>Supervise la diferencia de voltaje entre los electrodos de referencia y de grabación seleccionando el modo puente11 del amplificador.</li>
	<li>Baje el electrodo en el baño y colóquelo sobre la retina.</li>
	<li>Aleje el microscopio y coloque la lámpara fotoestimuladora paralela al eje longitudinal del tallo ocular. NOTA: La distancia entre la lámpara y la cámara de superfusión es de aproximadamente 15 cm.</li>
	<li>Reduzca lentamente el microelectrodo hasta que se detecte una caída repentina de tensión. NOTA: Una caída de tensión de alrededor de 50 mV indica el empalamiento de una célula fotorreceptora sana.</li>
	<li>Proporcione un flash de luz de prueba (luz blanca, 7,2 kW/m2,duración de 10 os) para registrar el potencial del receptor del fotorreceptor. NOTA: El potencial del receptor del fotorreceptor es un potencial de despolarizante de 10-15 mV de amplitud y 300 ms de duración(Figura 4).</li>
</ol>4. Grabación eléctrica
<ol><li>Asegúrese de que las células del fotorreceptor estén totalmente adaptadas a condiciones oscuras (ver paso 2.3).<ol>
<li>Proporcione un flash de luz de prueba cada 2 minutos. Automatice el tiempo entre flashes eligiendo un valor adecuado (120 s) de "tiempo entre episodios" en el software de adquisición de datos. NOTA: 2 min es el tiempo necesario para permitir la recuperación total de las corrientes subyacentes a la respuesta eléctrica del fotorreceptor.</li>
		<li>Monitorear el potencial de la membrana en reposo, así como la amplitud y duración del potencial del receptor. Supongamos que el fotorreceptor se adapta completamente una vez que el potencial de membrana, amplitud, y la duración del potencial del receptor permanecen sin cambios. Los ojos previamente mantenidos bajo oscuridad constante durante 20 min (paso 2.3) completan su adaptación en aproximadamente 5 min.</li>
		<li>Deje de estimular la celda 2 minutos antes de grabar la corriente iluminada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Grabación actual<ol>
<li>Sujete el voltaje en el valor potencial de membrana de reposo medido de la celda seleccionando "Amplitud de sujeción" en el software de adquisición de datos (en Forma de onda en la sección Canal de salida analógica).</li>
		<li>Seleccione el modo dSEVC del amplificador. En la sección Modo del amplificador, seleccione el botón SEVC y cambie la palanca a la posición Discont SEVC.</li>
		<li>Ajuste la velocidad de conmutación a 500-1.000 Hz (mediante el botón Ajuste de velocidad del amplificador), según lo determinado por la velocidad del electrodo11.</li>
		<li>Proporcione un destello de luz y observe la afluencia iónda. NOTA: Esta es la corriente de transducción o de la luz provocada(Figura 5).</li>
		<li>Vuelva al modo Puente en el amplificador y registre un potencial de receptor enviando un flash de luz (ver sección 3). Asegúrese de que la célula del fotorreceptor esté totalmente adaptada a condiciones oscuras. Mida las características potenciales del receptor (amplitud y duración) y compárela con las primeras mediciones. Supongamos que la célula fotorreceptora empalada es una célula sana si tienen las mismas características. NOTA: Después de la ablación de los ojos, la preparación biológica es viable durante las siguientes 2 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Protocolo de dos pulsos: Mida la recuperación de la desensibilización con un protocolo de dos flashes de luz. NOTA: El protocolo de dos flash de luz es similar al protocolo de voltaje estándar de dos pulsos utilizado para medir la recuperación de la inactivación de los canales cerrados por voltaje20. El primer flash de luz causa un cambio temporal en la sensibilidad de la célula del fotorreceptor y el segundo flash evalúa el estado de la conductividad activada por la luz.<ol>
<li>Proporcione un par de pulsos de luz. Aplique el segundo flash después de un intervalo de tiempo deseado (de 300 ms a 2 min).</li>
		<li>Digitalice las corrientes a muestreo de 10 KHz con el software de adquisición de datos y guarde los datos para el análisis fuera de línea11. NOTA: Una tabla con los valores de configuración del software se incluye como material complementario.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Análisis de datos
<ol><li>Cinética de la corriente iluminada<ol>
<li>Mida tres parámetros de corriente: latencia de activación L, el tiempo transcurrido desde la entrega de flash de luz hasta que la corriente alcanza el 10% de su amplitud máxima(Figura 5); amplitud de corriente máxima o pico Ip; y la constante de tiempo de desensibilización T. Mida la constante de tiempo de desensibilización (o) ajustando la fase de decaimiento actual a: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56258/56258eq1.jpg"> donde, A -I(t-0) es una constante positiva(Figura 5).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Desensibilización y recuperación Nota: La recuperación de la desensibilización se evaluó como la relación p2/p1, donde p1 es el parámetro relevante (L, Ipo T) de la corriente de control, y p2 es el parámetro correspondiente de la segunda corriente de prueba.<ol>
<li>Trazar p2/p1 (ya sea L, Ip,o T) en función del tiempo entre pulsos.</li>
		<li>Dependiendo del parámetro, ajuste los puntos de cada trazado a: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56258/56258eq2.jpg"> o para: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56258/56258eq3.jpg">
</li>
		<li>Utilice una prueba estadística adecuada para determinar el número de términos exponenciales necesarios para ajustarse a los datos experimentales.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Barriga-Montoya, C., Gómez-Lagunas, F., Fuentes-Pardo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pigment+dispersing+hormone+on+the+electrical+activity+of+crayfish+visual+photoreceptors+during+the+24-h+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Physiol.+A+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Effect of pigment dispersing hormone on the electrical activity of crayfish visual photoreceptors during the 24-h cycle.</a> Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 157 (4), 338-345 (2010).</li>
<li>Barriga-Montoya, C., de la O-Martínez, A., Fuentes-Pardo, B., Gómez-Lagunas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desensitization+and+recovery+of+crayfish+photoreceptors.+Dependency+on+circadian+time%2C+and+pigment-dispersing+hormone%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Biochem.+Physiol.+A+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Desensitization and recovery of crayfish photoreceptors. Dependency on circadian time, and pigment-dispersing hormone.</a> Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 203, 297-303 (2017).</li>
<li>Wickenden, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+electrophysiological+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+protoc.+pharmacol%22%5BJournal%5D)">Overview of electrophysiological techniques.</a> Curr. protoc. pharmacol. 11, 1-17 (2014).</li>
<li>Brette, R., Destexhe, A. Intracellular recording. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBrette%2C+R+%22Handbook+of+Neural+Activity+Measurement%22">Handbook of Neural Activity Measurement</a>. , 44-91 (2012).</li>
<li>Cummins, D., Goldsmith, T. H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00605738">Cellular identification of the violet receptor in the crayfish eye.</a> J. Comp. Physiol. 142 (2), 199-202 (1981).</li>
<li>Eguchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhabdom+structure+and+receptor+potentials+in+single+crayfish+retinular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+and+Comp.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rhabdom structure and receptor potentials in single crayfish retinular cells.</a> J. Cell and Comp. Physiol. 66, 411-430 (1965).</li>
<li>Nosaki, H. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00340549">Electrophysiological study of color encoding in the compound eye of crayfish, Procambarus clarkii.</a> Z. vergl. Physiologie. 64 (3), 318-323 (1969).</li>
<li>Miller, C. S., Glantz, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visual+adaptation+modulates+a+potassium+conductance+in+retinular+cells+of+the+crayfish%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Visual adaptation modulates a potassium conductance in retinular cells of the crayfish.</a> Vis Neurosci. 17 (3), 353-368 (2000).</li>
<li>Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+patch-clamp+techniques+for+high-resolution+current+recording+from+cells+and+cell-free+membrane+patches%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches.</a> Pflugers Arch. 391 (2), 85-100 (1981).</li>
<li>Lishko, P., Clapham, D. E., Navarro, B., Kirichok, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+patch-clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Sperm patch-clamp.</a> Methods Enzymol. 525, 59-79 (2013).</li>
<li>Finkel, A. Axoclamp-2A microelectrode clamp theory and operation. Axon Instruments, Inc. , (1990).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Single-channel+recording%22">Single-channel recording</a>. Sakmann, B. , Springer Science & Business Media. (2013).</li>
<li>Van Harreveld, A. <a target="_blank" href="http://journals.sagepub.com/doi/abs/10.3181/00379727-34-8647c">A physiological solution for freshwater crustacea.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 34 (4), 428-432 (1936).</li>
<li>Oesterle, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOesterle%2C+A+%22pipette+cookbook%22">pipette cookbook</a>. , Sutter Instruments. Novato, CA. 97(2008).</li>
<li>Fuentes-Pardo, B., Ramos-Carvajal, J. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/030096298390573X">The phase response curve of electroretinographic circadian rhythm of crayfish.</a> Comp. Biochem. Physiol. A Comp. Physiol. 74 (3), 711-714 (1983).</li>
<li>Pace-Schott, E. F., Hobson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neurobiology+of+sleep%3A+genetics%2C+cellular+physiology+and+subcortical+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The neurobiology of sleep: genetics, cellular physiology and subcortical networks.</a> Nat. Rev. Neurosci. 3 (8), 591-605 (2002).</li>
<li>Pittendrigh, C. S. On the mechanism of the entrainment of a circadian rhythm by light cycles. <a target="_blank" href="NULL">Circadian Clocks</a>. Aschoff, J. , North Holland, Amsterdam. 277-297 (1965).</li>
<li>Pittendrigh, C. S. Circadian systems: entrainment. <a target="_blank" href="https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19820591945">Handbook Behavioral Neurobiology Biological Rhythms</a>. Aschoff, J. , Plenum, New York. 94-124 (1981).</li>
<li>Vitaterna, M. H., Takahashi, J. S., Turek, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+circadian+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Alcohol+Res.+Health%22%5BJournal%5D)">Overview of circadian rhythms.</a> Alcohol Res. Health. 25 (2), 85-93 (2001).</li>
<li>Hille, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHille%2C+B+%22Ion+channels+of+excitable+membranes%22">Ion channels of excitable membranes</a>. 507, Sinauer. Sunderland, MA. (2001).</li>
<li>Dircksen, H., Strauss, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+clocks+in+crustaceans%3A+identified+neuronal+and+cellular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Circadian clocks in crustaceans: identified neuronal and cellular systems.</a> Front Biosci. 15, 1040-1074 (2010).</li>
<li>Terakita, A., Hariyama, T., Tsukahara, Y., Katsukura, Y., Tashiro, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+GTP-binding+protein+Gq+with+photoactivated+rhodopsin+in+the+photoreceptor+membranes+of+crayfish%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Interaction of GTP-binding protein Gq with photoactivated rhodopsin in the photoreceptor membranes of crayfish.</a> FEBS Lett. 330, 197-200 (1993).</li>
<li>Terakita, A., Takahama, H., Hariyama, T., Suzuki, T., Tsukahara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+regulated+localization+of+the+beta-subunit+of+Gq-type+G-protein+in+the+crayfish+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Physiol+A%22%5BJournal%5D)">Light regulated localization of the beta-subunit of Gq-type G-protein in the crayfish photoreceptors.</a> J Comp Physiol A. 183 (4), 411-417 (1998).</li>
<li>Terakita, A., Takahama, H., Tamotsu, S., Suzuki, T., Hariyama, T., Tsukahara, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-modulated+subcellular+localization+of+the+alpha-subunit+of+GTP-binding+protein+Gq+in+crayfish+photoreceptors%5BTitle%5D)+AND+%22Vis+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Light-modulated subcellular localization of the alpha-subunit of GTP-binding protein Gq in crayfish photoreceptors.</a> Vis Neurosci. 13 (3), 539-547 (1996).</li>
</ol>

No tenemos nada que revelar.

El cangrejo de río ha demostrado ser un excelente modelo debido a su capacidad para sobrevivir en condiciones no naturales. Hay fácil acceso a análisis electrofisiológicos in vivo e in vitro. Además, los crustáceos son un grupo favorable para la investigación neurobiológica en el campo de la cronobiología comparativa21.
En este artículo, el estudio de la desensibilización y recuperación de la corriente de transducción activada por la luz de las células...

Para ser percibido como un estímulo visual, la luz que llega a los ojos debe ser transducida en una señal eléctrica. Por lo tanto, en todos los organismos visuales, la luz desencadena una corriente iónnica de transducción, que a su vez produce un cambio en el potencial de membrana de las células fotorreceptoras, el llamado potencial receptor. Debido a esto, la sensibilidad a la luz del ojo depende principalmente del estado de la conductancia activada por la luz, que puede estar disponible para ser activada o insinotada.
En los fotorreceptores de cangrejo de río, la luz desencadena una corriente iónica lenta, transitoria1. Tras la iluminación, la corriente de transducción surge después de un retraso o latencia antes de alcanzar su máximo; a partir de entonces se descompone, ya que los canales de transducción caen en un estado desensensible en el que no responden a un estímulo de luz adicional2. Es decir, la luz, además de activar la corriente de transducción responsable de la visión, también induce un decremento transitorio de la sensibilidad de las células fotorreceptoras. La desensibilización puede representar un mecanismo de protección general contra la sobreexposición a un estímulo adecuado. La sensibilidad del ojo a la luz se recupera a medida que la conductancia de transducción se recupera de la desensibilización.
El registro intracelular es una técnica útil para medir la actividad eléctrica de las células excitables3,4,5,6,7,8. Aunque la grabación intracelular se ha vuelto menos frecuente con la llegada de la técnica de abrazadera de parche9, sigue siendo un enfoque conveniente cuando las células son difíciles de aislar, o presentar una geometría que hace difícil la formación de los sellos giga de sujeción de parches(es decir,sellos o contactos estrechos entre el electrodo de parche y las membranas con resistencia eléctrica del orden de 109ohmios). Ejemplos de estos últimos son las células espermáticas10 y las células fotorreceptoras aquí estudiadas. En nuestra experiencia, los fotorreceptores Procambarus clarkii son difíciles de aislar y mantener en la cultura primaria; además, son varillas delgadas que dificultan la formación de giga-sello. En las grabaciones intracelulares, un electrodo afilado se introduce en una célula que se mantiene en su lugar por el tejido circundante. El electrodo es cortado por el circuito de conmutación de alta velocidad del amplificador, por lo que la corriente se muestrea entre pulsos de voltaje. Este modo se conoce como abrazadera de voltaje de un solo electrodo discontinuo (modo dSEVC)11. La alta resistencia (pequeña apertura) del electrodo dificulta el intercambio de difusión entre la célula y las soluciones de pipetas, produciendo una mínima perturbación del entorno intracelular3. Un inconveniente potencial de esta técnica es que la inserción de electrodos puede producir una corriente de fuga no selectiva; por lo tanto, se debe tener cuidado de evitar el registro de las células donde el tamaño de la corriente de fuga puede interferir con las mediciones previstas4,12.
En este documento, utilizamos acechadores aislados de cangrejos para evaluar la desensibilización y recuperación de la conductancia iónica activada por la luz mediante la realización de registros eléctricos intracelulares de células fotorreceptoras en condiciones de abrazadera de tensión.

<table><tbody><tr><td>Axoclamp2A&nbsp;</td><td>Axon Instruments Inc</td><td></td><td>Amplificador</td></tr><tr><td>Digidata 1200 Interfaz Axon</td><td>Instruments Inc</td><td></td><td>Osciloscopio Digitalizador</td></tr><tr><td>TDS430A</td><td>Tektronix</td><td></td><td>Osciloscopio Analógico</td></tr><tr><td>Fotoestimulador PS33 Plus</td> Tirador de <td>lámparas</td>de <td>césped</td><td></td></tr><tr><td>PC-100</td><td>Narishige</td><td></td><td>Extractor de micropipetas</td></tr><tr><td>P-97</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Extractor de micropipetas</td></tr><tr><td>Tubo capilar de vidrio Kimax-51</td><td>Kimble Products</td><td>34502</td><td>0.8, 1.10, 100 mm</td></tr><tr><td>HS-2 Headstage</td><td>Axon Instruments Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulador de Headstage MX-4</td><td>Narishige</td><td></td><td>Micromanipulador mecánico Microscopio</td></tr><tr><td>estereoscópico Microscopio</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pClamp</td><td>Axon Instruments Inc</td><td></td><td>Software de adquisición de datos para la interfaz digidata 1200</td></tr><tr><td>Clampfit</td><td>Axon Instruments, Inc</td><td></td><td>Software de análisis vinculado a pClamp</td></tr><tr><td>Origin</td><td>OriginLab Corp.</td><td></td><td>Software de análisis de datos y gráficos</td></tr><tr><td>Cloruro de Sodio</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td>>99.5%</td></tr><tr><td>Cloruro de Potasio</td><td>Sigma</td><td>P-9333</td><td>Mínimo 99%</td></tr><tr><td>Sulfato de Magnesio</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td>Mínimo 99.5%</td></tr><tr><td>Cloruro de Calcio</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td>Mínimo 99.0%</td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H7523</td><td>>99.5%</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma</td><td>S8045</td><td>98.00%</td></tr><tr><td>Solución de hipoclorito de sodio</td><td>Sigma</td><td>425044</td><td>Cloro disponible, 10-15%&nbsp;</td></tr></tbody></table>

desensibilización y recuperación de fotorreceptores de cangrejo de río tras la entrega de un estímulo ligero

Desensitization and Recovery of Crayfish Photoreceptors Upon Delivery of a Light Stimulus

Se presenta un método para estudiar la desensibilización y recuperación de fotorreceptores de cangrejos. Realizamos grabaciones eléctricas intracelulares de células fotorreceptoras en miradas aisladas utilizando la configuración discontinua de abrazadera de voltaje conmutada por electrodo único. Primero, con una cuchilla de afeitar hicimos una abertura en la córnea dorsal para tener acceso a la retina. A partir de entonces, insertamos un electrodo de vidrio a través de la abertura, y penetramos en una célula según lo reportado por la grabación de un potencial negativo. El potencial de membrana se afianzó al potencial de reposo del fotorreceptor y se aplicó un pulso de luz para activar las corrientes. Por último, se empleó el protocolo de dos flashes de luz para medir la desensibilización y recuperación actuales. El primer destello de luz desencadena, después de un período de retraso, la corriente iónica de transducción, que después de alcanzar una amplitud máxima se descompone hacia un estado desensifiado; el segundo flash, aplicado en intervalos de tiempo variables, evalúa el estado de la conductividad activada por luz. Para caracterizar la corriente iluminada, se midieron tres parámetros: 1) latencia (el tiempo transcurrido entre la entrega del flash de luz y el momento en el que la corriente alcanza el 10% de su valor máximo); 2) corriente pico; y 3) constante de tiempo de desensibilización (constante de tiempo exponencial de la fase de decaimiento actual). Todos los parámetros se ven afectados por el primer pulso.
Para cuantificar la recuperación de la desensibilización, se empleó la relación p2/p1 frente al tiempo entre pulsos. p1 es la corriente pico evocada por el primer pulso de luz, y p2 es la corriente pico evocada por el segundo pulso. Estos datos se instalaron en una suma de funciones exponenciales. Finalmente, estas mediciones se llevaron a cabo en función del tiempo circadiano.

En primer lugar, se obtiene un potencial receptor representativo de células fotorreceptoras de cangrejo de río(Figura 4). Posteriormente, se aplicó un flash de luz de prueba para activar la corriente de transducción de luz(Figura 5). La corriente de transducción catiónica1 se activa después de un desenlace, alcanzando un máximo y posteriormente cae lentamente en un estado absorbente desensifiado del que se...

Se presenta un protocolo para el estudio de la desensibilización y la recuperación de la sensibilidad de los fotorreceptores de cangrejo sin efecto en función del tiempo circadiano.

Desensibilización y recuperación de fotorreceptores de cangrejo de río tras la entrega de un estímulo ligero

A method to study desensitization and recovery of crayfish photoreceptors is presented. We performed intracellular electrical recordings of photoreceptor ...

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la desensibilización y la recuperación de sensibilidad de los fotorreceptores de cangrejo de río en función del tiempo circadiano, utilizando grabaciones eléctricas intercelulares de células fotorreceptores en poblaciones oculares aisladas, empleando la configuración discontinua de la abrazadera de voltaje conmutada de un solo electrodo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurobiología, como la dependencia del tiempo circadiano de tantas propiedades electrofisiológicas de fotorreceptores en la inactivación y la recuperación. La principal ventaja de esta técnica, es que permite la medición de la actividad eléctrica de los fotorreceptores.A pesar de la dificultad para aislar las células y sin perturbar el ambiente intracelular. Demostrando este procedimiento estarán las doctoras Carolina Barriga-Montoya y Araceli de la O-Maritnez, colaboradoras de nuestro laboratorio. Para preparar el electrodo intracelular, tire del tubo capilar de vidrio con un tirador de micropipeta para obtener una punta delgada con una pequeña abertura.A continuación, llene el vaso capilar tirado con una solución de cloruro

desensitization-recovery-crayfish-photoreceptors-upon-delivery-light

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

En este vídeo podemos realizar la grabación electrorretinograma, la grabación del nervio óptico, y la grabación intrarretinianas con el cangrejo de herradura de...

Utilizando el cangrejo de herradura, Limulus polyphemus, En la Investigación de la Visión

Hemos desarrollado dos métodos para estudiar los efectos de los estímulos visuales en el comportamiento en ausencia de señales táctiles y químicas. Un método implica grabar en vídeo las respuestas de los cangrejos a las paredes reflectantes en un acuario, y el otro examina los efectos de los insumos visual proporcionada por un cangrejo de río vive detrás de una mampara transparente.

Grabación de las respuestas de comportamiento a la reflexión en el cangrejo de río

Este video muestra la cría de Drosophila melanogaster bajo condiciones de luz específicas para estudiar el papel de las proteínas Bruchpilot en la liberación de neurotransmisores y la modulación resultante de la actividad sináptica.

Modulación sináptica en Drosophila después de la exposición prolongada a la luz

Presentamos un método para el análisis electrorretinográfico (ERG) de larvas de pez cebra utilizando técnicas de micromanipulación y electrorretinografía. Este es un método simple y directo para analizar la función visual de las larvas de pez cebra in vivo.

Análisis Electrorretinograma de la respuesta visual en pez cebra larvas

La técnica electrofisiológica de registro intracelular se demuestra y se utiliza para determinar las sensibilidades espectrales de las células fotorreceptoras individuales en el ojo compuesto de una mariposa.

Determinación de los fotorreceptores de la célula de sensibilidad espectral en un modelo de insectos<em&gt; En Vivo</em&gt; registros intracelulares

Los microelectrodos afilados permiten una caracterización electrofisiológica precisa de la salida de fotorreceptores e interneuronas visuales en Drosophila viva. Aquí mostramos cómo usar este método para registrar respuestas de voltaje de alta calidad de células individuales a la estimulación de luz controlada. Este método es ideal para estudiar el procesamiento de la información neuronal en ojos compuestos de insectos.

Método electrofisiológico para registrar las respuestas de voltaje intracelular<em&gt; Drosophila</em&gt; Los fotorreceptores y interneuronas a la luz Estímulos<em&gt; En Vivo</em

Aquí mostramos cómo cuantificar el número y la distribución espacial de las zonas activas sinápticas en los fotorreceptores de Drosophila melanogaster, resaltada con un marcador molecular codificada genéticamente, y su modulación después de la exposición prolongada a la luz.

Analizando Synaptic Modulación de<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Los fotorreceptores después de la exposición prolongada a la luz

Las grabaciones de células enteras de los fotorreceptores de Drosophila melanogaster permiten medir las colisiones oscuras espontáneas, los baches cuánticos, las respuestas macroscópicas a la luz y las relaciones tensión-corriente bajo diversas condiciones. En combinación con las herramientas de manipulación genética de D. melanogaster , este método permite el estudio de la vía omnipresente de señalización de los inositol-lípidos y su objetivo, el canal TRP.

Método electrofisiológico para grabaciones de abrazadera de voltaje de células enteras<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorreceptores

Este protocolo describe una estrategia optogenética para modular la actividad de la proteína quinasa activada por mitógeno (MAPK) durante la diferenciación celular y el desarrollo embrionario de Xenopus . Este método permite la activación reversible de la vía de señalización MAPK en el cultivo de células de mamíferos y en organismos vivos multicelulares, como los embriones Xenopus , con alta resolución espacial y temporal.

Modulación reversible mediada por luz de la vía de la proteína quinasa activada por mitógeno durante la diferenciación celular y<em&gt; Xenopus</em&gt; Desarrollo embrionario

El mapeo de circuitos asistidos por Cifrodonina (CRACM) es una técnica de precisión para el mapeo funcional de proyecciones neuronales de largo alcance entre grupos de neuronas identificadas anatómicamente y/o genéticamente. Aquí, describimos cómo utilizar craCM para mapear las conexiones del tronco cerebral auditivo, incluyendo el uso de una opsin de cambio rojo, ChrimsonR.

Asignación de circuito asistida por Channelrhodopsin de largo alcance de neuronas coliculus inferiores con Channelrhodopsins de cambio azul y rojo

Presentamos un protocolo para caracterizar electrofisiológicamente los fotopigmentos biestables: (i) explotar los desplazamientos de carga dentro de las moléculas de fotopigmento después de la absorción de fotones y su enorme cantidad en los fotorreceptores, y (ii) explotar las diferencias de espectros de absorción de los estados de fotopigmento de rodopsina y metarhodopsina. Estos protocolos son útiles para detectar mutaciones que afectan a los sistemas de fotopigmento biestables.

Métodos electrofisiológicos para medir los niveles de fotopigmento en fotorreceptores de Drosophila

Aprende a estudiar la desensibilización y recuperación de fotorreceptores de cangrejo de río en función del tiempo circadiano mediante registros eléctricos intracelulares. Este método permite medir la actividad eléctrica celular sin alterar el medio intracelular.

Desensibilización y recuperación de fotorreceptores de cangrejo de río tras la entrega de un estímulo ligero

Explorar más videos