Name: Un protocolo Universal para la gRNA a gran escala de producción de la biblioteca de cualquier fuente de ADN (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Aprenda el método CORALINA para generar bibliotecas de gRNA mediante digestión enzimática de ADN purificado. Esta técnica rentable produce todas las guías posibles para pantallas CRISPR.

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Los autores quisieran gracias Prof. Dr. Stephan Beck y Prof. Dr. Magdalena Goetz por sus aportes, ayuda y apoyo en el desarrollo el método CORALINA, Maximiliano Wiessbeck y Valentin Baumann para comentarios. El trabajo ha sido apoyado por DFG (STR, 1385, 1-1).

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<li>Lane, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatically+Generated+CRISPR+Libraries+for+Genome+Labeling+and+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Enzymatically Generated CRISPR Libraries for Genome Labeling and Screening.</a> Dev Cell. 34 (3), 373-378 (2015).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+DNA+fragments+from+polyacrylamide+gels+by+the+crush+and+soak+method%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of DNA fragments from polyacrylamide gels by the crush and soak method.</a> CSH Protoc. (1), (2006).</li>
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<li>Elsaesser, R., Paysan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+gel+amplification+of+complex+plasmid+libraries%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Liquid gel amplification of complex plasmid libraries.</a> Biotechniques. 37 (2), 200-202 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

CORALINA permite generar bibliotecas de gRNA a gran escala mediante digestión controlada de la nucleasa del ADN diana y a granel clonación de fragmentos resultantes de trenzado doble. Inferencia estadística indica que muchas secuencias de gRNA individual7 más de 10 han ya sido con éxito reproducidas usando el protocolo a mano9. CORALINA se puede personalizar de múltiples maneras. La elección de la plantilla de ADN define la región de destino y la complejidad máxima de la biblioteca generada. Usando este protocolo, CORALINA bibliotecas previamente se han generado de humano y ADN genómico del ratón9. Resultados representativos presentados aquí representan la generación de una biblioteca CORALINA de ADN purificado de BAC. Personalización adicional puede lograrse mediante la opción de secuencias de vectores y vinculador de expresión gRNA. Previamente hemos probado tres diferentes pares de longitudes de vinculador para Asamblea de Gibson con pequeñas variaciones en eficiencia9.
Debido a su origen a granel digerido ADN, protospacer de CORALINA gRNAs no suelen ser exactamente 20 bp en longitud, pero mostrar una distribución de longitud con un promedio que depende tanto de los parámetros de la digestión MNase, así como el tamaño de la supresión hecha del gel de la página s. el ejemplo representativo se muestra en la figura 2B y C, muestra fragmentos con una longitud media entre 19 y 27 PB. En nuestra experiencia, la longitud de los fragmentos se conserva fielmente por la gRNA generado protospacer9. Mientras que los fragmentos más cortos de 20 bp debe evitarse debido a la tasa objetivo de gRNAs resultante, más fragmentos son probablemente mucho menos de un problema para aplicaciones posteriores, puesto que ha sido demostraron que gRNAs con protospacers tanto como 45 bp son todavía funcional9.
Los dos pasos más importantes en el protocolo CORALINA son la selección de tamaño de fragmentos digeridos MNase y medidas clonaje. Generación de fragmentos que son demasiado cortos (por ejemplo media menores de 18 años bp) o incorporación de muchos vectores de expresión de gRNA vacía será inutilizar la biblioteca. Por lo tanto, es importante optimizar el paso de la digestión de MNase (figura 2A), para supervisar la supresión (figura 2B, C), Compruebe la digestión completa de la columna vertebral de vector de gRNA y como no hay controles de fragmento en el protocolo. Especial cuidado tiene también que deben tomarse para preservar la representación de la biblioteca de gRNA. Un cuello de botella común de generación de la biblioteca en general es la eficiente transferencia de plásmidos en bacterias para la amplificación. Así, grandes cantidades de bacterias con capacidad excelente y un gran número de eventos de electroporación individuales son necesarias para lograr un alto número de clones de gRNA.
Nuevas estrategias para la producción de la biblioteca de gRNA será necesarios cosechar el potencial de los enfoques basado en el CRISPR durante las próximas décadas. Hay una importante demanda de métodos rentables, simple y personalizables para generar librerías a gran escala, un requisito previo para hacer proyección favorable a un mayor número de sistemas modelo y diferentes enfoques de ingeniería CRISPR. CORALINA es proporcionar un primer paso hacia esto. Los usos potenciales son múltiples, sobre todo para producir bibliotecas completa de los genomas, cDNA derivada bibliotecas de modelo menos común de los sistemas, bibliotecas altamente enfocadas y montajes experimentales en que diversas proteínas CRISPR (con PAM diferentes requisitos) se utilizan en combinación.
A diferencia de otros métodos, CORALINA genera todos gRNAs posible de la entrada de ADN. Sin embargo, una desventaja del método es que gRNAs carecer de la necesaria secuencia de PAM se incluyen también en la biblioteca, una característica que comparte con un segundo método enzimático para la generación de la biblioteca del gRNA, CRISPR-comer (tabla 1). La elección del método ideal para generación de gRNA biblioteca depende de las especificaciones de la proyección prevista experimentar, especialmente la naturaleza (génica, regulación, intergénica) y el tamaño de la región de destino (solo locus, múltiples regiones, genoma). Vemos una boca especial en el uso de CORALINA cuando un gran número de no codificante o regiones reguladoras deben ser analizadas, si hay información incompleta o poco confiable secuencia (sistemas de modelos exóticos, mezclas de especies (por ejemplo, microbiomes) o obtenidos experimentalmente entrada), si se combinan diferentes endonucleasas CRISPR o saturar el análisis se realiza en un lugar corto y definido (por ejemplo, representado por BACs).

La adaptación del sistema CRISPR/Cas9 bacteriana como herramienta segmentación molecular causó la más reciente revolución en biología molecular. Nunca antes ha sido tan fácil manipular cromatina en lugares genómicos definidos. Usos comunes de CRISPR incluyen mutaciones de genes específicos1, genoma ingeniería2, epigenoma, edición3, activación transcripcional y4el silenciamiento del gen. Una ventaja particular del sistema CRISPR es que sus aplicaciones no se limitan a sitios candidato bien estudiados, como bibliotecas de gRNA pantallas menos sesgadas posible. Éstos facilitan el descubrimiento de lugares geométricos funcionales en el genoma sin ningún previo conocimiento experimental. Sin embargo, gRNA biblioteca construcción actualmente en su mayoría se basa en la síntesis de oligo-nucleótidos y existen limitadas opciones para comprar gRNA bibliotecas que no son de humanos o regiones de origen o destino de ratón fuera abren marcos de lectura. Así, aunque CRISPR pantallas ya han demostrado ser increíblemente potente5,6,7,8, su potencial ha no sido explotado.
Para superar la limitación de dos estrategias de gRNA clásica generación métodos han sido desarrollados recientemente. Ambas se basan en la digestión enzimática controlada de ADN diana en lugar de depender de la síntesis del oligonucleótido personalizado. Mientras que CORALINA9 emplea nucleasa micrococcal, el método alternativo actualmente disponible sólo, comer CRISPR10, hace uso de enzimas de restricción (HpaII, ScrFI, BfaI y MmeI). Lo importante, ambas técnicas pueden ser aplicadas a cualquier entrada del ADN, que sirve como fuente de gRNA protospacer secuencias. Mientras que el método comer CRISPR emplea una estrategia para disminuir el número de gRNAs clonados cuyos sitios apuntados no son seguidos por la necesaria PAM S.pyogenes (motivo adyacente protospacer), genera sólo una pequeña fracción de todos los gRNAs funcionales posible para un región determinada. CORALINA, por otra parte, es capaz de generar todos los gRNAs posibles para la secuencia de origen, pero también incorpora una mayor fracción de guías no funcional. gRNA generación de biblioteca a través de la actividad de nucleasa controlado permite la producción de bibliotecas de gRNA integral para cualquier especie, cualquier sistema Cas9 proteína o - efectoras de una manera simple y rentable. Por otra parte, CORALINA es adaptable a la personalización, como opciones de entrada y el vector apropiados definición el tipo de biblioteca, tamaño y contenido. Aquí, se presenta un protocolo detallado que puede ser utilizado para la generación de bibliotecas de gRNA integral de diversas fuentes de ADN (figura 1), incluyendo los cromosomas artificiales bacterianos (BACs) o genomic ADN9. Los resultados representativos que acompaña a este protocolo se obtuvieron aplicando el protocolo CORALINA al ADN BAC.

<table><tbody><tr><td>500 mM EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03777-10G</td><td>1.4., Inactivación de Mnase</td></tr><tr><td>Novex Tampón de muestra TBE de alta densidad</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6678</td><td>2.1.</td></tr><tr><td>Novex&reg; Geles TBE, 20%, 10 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EC6315BOX</td><td>2.1., prefabricado 20 % Gel PAGE</td></tr><tr><td>O'RangeRuler 5 bp DNA Ladder,Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>SM1303</td><td>2.1.</td></tr><tr><td>Novex&reg; Tampón de carrera TBE</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>LC6675</td><td>2.1., tampón de circulación de gel PAGE</td></tr><tr><td>Bisturí desechable, estéril</td><td>VWR&nbsp;</td><td>233-5363&nbsp;</td><td>2.3., podrán utilizarse otros reactivos equivalentes</td></tr><tr><td>Tinción de ácido nucleico SYBR Green I (concentrado 1000x en DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td> S9430</td><td>2.3. +2.5., también disponible en Thermo Fisher Scientific (S7563)</td></tr><tr><td>Fenol ultrapuro:Cloroformo:Alcohol isoamílico (25:24:1)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15593-031</td><td>3.6.1. + 4.3., se pueden utilizar otros reactivos equivalentes</td></tr><tr><td>Glycogen</td><td>Sigma</td><td>10901393001</td><td>3.6.4., pueden utilizarse otros reactivos equivalentes</td></tr><tr><td>3M Acetato de sodio, pH5.2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>&nbsp; R1181</td><td>3.6.4., se pueden utilizar otros reactivos equivalentes</td></tr><tr><td>Etanol&nbsp;</td><td></td><td></td><td>3.6.4. + 9.1.8., grado de biología molecular</td></tr><tr><td>Kit de despuntado rápido&nbsp;</td><td>Nueva Inglaterra Biolabs</td><td>E1201</td><td>4.1.</td></tr><tr><td>acetato de amonio</td><td>Sigma</td><td> A1542</td><td>3.1., se pueden utilizar otros reactivos</td></tr><tr><td>equivalentes acetato de magnesio</td><td>Sigma</td><td> M5661</td><td>3.1., se pueden utilizar otros reactivos equivalentes</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA (pH 8,0)</td><td>VWR</td><td>&nbsp; MOLEM37465520 (o Promega V4231)</td><td>2.2. + 3.1., se pueden utilizar otros reactivos equivalentes</td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>perlas Beckman coulter</td><td>A63881</td><td>5.3. + 6.5.</td></tr><tr><td>Kit de extracción de gel</td><td>QIAGEN</td><td>28704</td><td>5.7.+ 7.1. +8.4., se pueden utilizar otros reactivos</td></tr><tr><td>equivalentes ligasa de ADN T4 concentrada</td><td>New England Biolabs</td><td>&nbsp; M0202T</td><td>6.1.+ 8.1.2.</td></tr><tr><td>Amplificador largo Taq 2X Master Mix&nbsp;</td><td>Biolabs de Nueva Inglaterra</td><td>M0287S</td><td>6.3.</td></tr><tr><td>Mezcla maestra de PCR de alta fidelidad Phusion con tampón HF</td><td>New England Biolabs</td><td>M0531S</td><td>5.1. + 6.6., se pueden utilizar otros reactivos equivalentes</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104S</td><td>5.4.1.&nbsp;</td></tr><tr><td>SacII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0157S</td><td>5.4.2.</td></tr><tr><td>AgeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0552S</td><td>8.2.1.</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>93362</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>2M MgCl</td><td>Sigma</td><td>93362</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>dGTP, dATP, dCTP, dTTP</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>TDT</td><td>Sigam</td><td> TDT-RO</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>PEG-8000&nbsp;</td><td>Sigma</td><td> P5413</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma</td><td> N6522</td><td>8.1.1.</td></tr><tr><td>Exonucleasa T5</td><td>New England Biolabs</td><td>M0363S</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>Phusion ADN polimerasa&nbsp;</td><td>Biolabs de Nueva Inglaterra</td><td>M0530S</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>Taq ADN ligasa</td><td>Nueva Inglaterra Biolabs</td><td>M0208L</td><td>8.1.2.</td></tr><tr><td>rSAP</td><td>New England Biolabs</td><td>M0371S</td><td>8.3.1.</td></tr><tr><td>Células competentes TG1</td><td>Lucigen</td><td>60502-1</td><td>9.1.</td></tr><tr><td>Cubetas de electroporación con espacio de 1 mm&nbsp;</td><td>VWR</td><td>732-2267&nbsp;</td><td>10.2.Placa</td></tr> <tr><td>de bioensayo (poliestireno, 245 mm x 245 mm x 25 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DIS-988-010M&nbsp;</td><td>9.4.NaCl</td></tr> <tr><td></td><td>Sigma</td><td>S7653&nbsp;</td><td></td></tr><tr>9.3.Bacto-triptona<td></td> <td>BD</td><td>211705</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>BD</td><td>212750</td><td>9.3.</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td> A1296</td><td>9.4.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td> G5516</td><td>9.17.</td></tr><tr><td>MNAse</td><td>New England Biolabs</td><td>M0247S</td><td>1.1.</td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td>a través</td></tr><tr><td>de Micropulsor</td><td>Biorad</td><td>165-2100</td><td>10.2.</td></tr><tr><td>Cubetas de electroporación</td><td>Biorad</td><td>732-2267&nbsp;</td><td>Tubos</td></tr> <tr><td>de centrífuga de 10.2.250 ml</td><td>Corning</td><td>430776</td><td>9.1-9.9.</td></tr></tbody></table>

un protocolo universal para la grna a gran escala de producción de la biblioteca de cualquier fuente de adn

A Universal Protocol for Large-scale gRNA Library Production from any DNA Source

La popularidad del sistema CRISPR/Cas9 de genoma y epigenoma ingeniería proviene de su simplicidad y adaptabilidad. Una unidad de efectos (la nucleasa Cas9 o una proteína de fusión de nucleasa-dead dCas9) está dirigido a un sitio específico en el genoma por un pequeño arn sintético conocido como RNA de la guía, o gRNA. La naturaleza bipartita del sistema CRISPR permite su utilización en los enfoques de detección desde bibliotecas de plásmidos que contienen cassettes de expresión de miles de gRNAs individual se pueden utilizar para interrogar a muchos sitios diferentes en un solo experimento.
Hasta la fecha, gRNA secuencias para la construcción de las bibliotecas se han generado casi exclusivamente por síntesis de oligonucleótidos, que limita la posible complejidad de secuencias en la biblioteca y es relativamente costosa. Aquí, un detallado protocolo de CORALINA (generación de biblioteca de gRNA integral a través de la actividad de nucleasa controlados), un sencillo y un método rentable para la generación de bibliotecas de gRNA altamente complejo basado en la digestión enzimática de la entrada de ADN, se describe. Puesto que de cualquier fuente de ADN, se pueden generar bibliotecas CORALINA, un montón de opciones para personalización existen, lo que permite una gran variedad de pantallas de CRISPR.

Utilizando el protocolo a mano, bibliotecas de gRNA CORALINA han sido generadas de humano y ratón genomic DNA9 y BAC ADN (figura 1). Para producir fragmentos de ADN de entrada adecuado para la clonación en vectores de expresión de gRNA, condiciones óptimas para la digestión de la nucleasa controlados tienen que determinarse. Un resultado típico para la optimización de la digestión de la nucleasa micrococcal es representado en la figura 2A. Cantidad insuficiente de nucleasa (0,1, 2, 3, 4, 4.5 o 5 unidades) produce unidades de 5.5-7.5 y no productos sensibles en el rango de tamaño (10-100 PB) todavía se producción fragmentos que son en promedio demasiado largo. Grandes cantidades de enzima (50 unidades) conducen a la degradación excesiva de la entrada de ADN después de 10 min. En consecuencia, una cantidad intermedia fue elegida (10 unidades). La recopilación fue aumentada producir suficientemente digeridos fragmentos para la posterior purificación y clonación (figura 2B). Aunque se recomienda ciegamente seleccionar fragmentos de ADN por tamaño y dependen sólo de la escalera de ADN para la orientación minimizar la exposición de fragmentos de ADN a la luz UV, geles se pueden mancharse luego para control de calidad de digestión y corte. Figura 2B muestra un ejemplo representativo de un gel de página de que ADN fragmentos de entre 20 y 30 bp han sido suprimidos. Gel purificado MNase fragmentos se cargan en un 20% gel página para comprobar tamaño acertada selección y purificación de fragmentos digeridos MNase (figura 2). El protocolo a mano es compatible con el uso de secuencias de vinculador modificado para requisitos particulares, lo que permite para clonar los fragmentos digeridos MNase en gRNA vectores de expresión de la opción. Aquí, gRNA PLKO9 fue utilizado como columna vertebral. Los conectores son amplificadas desde el vector de expresión de gRNA usando PCR estándar. Figura 2D representa un ejemplo representativo de vinculador amplificado secuencias desprovisto de adicional, incorrecta o no amplicons de la plantilla. A continuación, vinculador amplicons son digeridos con enzimas de restricción para conectores se unen a los fragmentos digeridos MNase en la orientación correcta. Figura 2D muestra geles de agarosa de enlazadores 5' y 3' antes y después de la digestión con HindIII y SacII respectivamente, indicando una digestión completa de los enlazadores 637 predicha y 295 bp. La parte derecha de la imagen de gel documenta la supresión de los fragmentos digeridos vinculador. Siguiente extracción de enlazadores digeridos del gel, el siguiente paso en el protocolo es la ligadura de enlazadores a los fragmentos de MNase-digerido fin reparado. Porque se generan secuencias de vinculador por PCR usando las cartillas de unphosphorylated, uno mismo-ligadura de los enlazadores no debería ocurrir. Sólo los fragmentos de ADN digeridos MNase reparado extremo proporcionan los grupos fosfato necesarios para la ligadura. Tras la traducción de nick, el producto de la ligadura es amplificado por PCR. Para evitar el excesivo sesgo de amplificación de PCR que podría sesgar la representación de secuencias de gRNA en la biblioteca, la amplificación se limita a menos de 20 ciclos en total. Tras la PCR, los productos de amplificación son difíciles de visualizar en geles de agarosa. Control independiente de PCRs con 32 ciclos por lo tanto se realizaron para detectar los productos (pero no se utilizan para la preparación de la biblioteca). Resultados de este control PCR se muestran en la Figura 2E. Esto permite optimizar las reacciones de ligadura y asegurar las reacciones están desprovistos de artefactos de la polimerización en cadena, que a veces ocurren en "no controles de fragmentos" (NFC). Figura 2E muestra el amplicón deseado (5' linker + fragmento de ADN 3' linker, longitud: 869 bp) después de la amplificación de las reacciones de ligadura usando equimolares (1:1) relación entre fragmentos y secuencias de vinculador.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig1.jpg"> Figura 1 : Sugiere la línea de tiempo para preparar una biblioteca de gRNA. CORALINA ofrece una estrategia simple y costo-eficiente para la generación de bibliotecas de gRNA integral de una plétora de diferentes fuentes de ADN de cualquier organismo. El protocolo a mano puede llevarse a término durante una semana de trabajo. Generación de enlazador puede realizarse en paralelo con el final de la reparación del ADN. Preparación de bacterias espectro toma dos días e incluye un paso de crecimiento durante la noche y por lo tanto se debe comenzar antes del montaje se establecen reacciones. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56264/56264fig2.jpg"> Figura 2 : Pasos críticos durante el protocolo de. Controladas (A) digestión del ADN BAC permite generación de fragmentos de diferentes tamaños. Se muestra aquí es la optimización de la digestión MNase. El ADN purificado de BAC fue tratado con diferentes cantidades de MNase para 10 min 10 U de MNase generar fragmentos de ADN de la longitud deseada (20-30 PB). (B) selección de fragmentos de entre 20 y 30 bp mediante supresión de geles de poliacrilamida del tamaño. El ADN purificado de BAC fue tratado con 10 U de MNase durante 10 minutos. La imagen fue grabada después de la supresión. (C) control de calidad de fragmentos purificados de gel. Después de la purificación del gel, 1/6 de la MNase purificada fragmentos se cargan en un 20% gel página para comprobar tamaño acertada selección y purificación. (D) la amplificación de secuencias del linker para la Asamblea y enzima de la restricción digestión de conectores para clonación direccional. 5' y 3' enlazadores fueron amplificados y cortar con HindIII y SacII, respectivamente. Plantilla de no controles (NTC) se incluyeron para controlar artefactos PCR y la contaminación del ADN. Izquierda: aplicación de la muestra analítica; derecha: aplicación de la preparación muestra. Imagen se registró después de la supresión de gel. (E) ligadura acertada de enlazadores para fragmentos de ADN puede ser analizada mediante PCR con un mayor número de ciclos PCR (32) y controlado por no realizar ningún control de plantilla con H2O (NTC) o usando el CNT del paso de traducción anterior de nick como entrada (NTC NT)). Es importante no incluir un ningún fragmento control (NFC), que es una amplificación de una ligadura y nick traducción reacción que fueron omitidos los fragmentos MNase. Sólo las muestras en que MNase los fragmentos se han combinado con linker DNA producen el amplicón esperado (869 bp). <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56264/56264fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Métodos para la generación de bibliotecas de gRNA a gran escala deben ser simple, eficiente y rentable. Se describe un protocolo para la producción de bibliotecas de gRNA basado en la digestión enzimática del ADN diana. Este método, CORALINA (gRNA integral generación de biblioteca a través de la actividad de nucleasa controlados) presenta una alternativa a la síntesis de oligonucleótidos de encargo costosos.

Un protocolo Universal para la gRNA a gran escala de producción de la biblioteca de cualquier fuente de ADN

The popularity of the CRISPR/Cas9 system for both genome and epigenome engineering stems from its simplicity and adaptability. An effector (the Cas9 ...

El objetivo general de este método es construir bibliotecas completas de ARN guía a partir de ADN purificado de cualquier origen. Las bibliotecas de ARN guía son colecciones de plásmidos utilizadas en ensayos basados en CRISPR. El método CORALINA utiliza la digestión enzimática de ADN purificado para clonar los fragmentos resultantes en un vector de biblioteca de ARN guía.La principal ventaja de esta técnica es que produce todas las ARN guía posibles a partir de la secuencia de entrada y es muy rentable. Aunque este video demuestra la protección de una biblioteca CORALINA a partir de un cromosoma artificial bacteriano, este método puede aplicarse en principio a cualquier tipo de ADN de entrada de cualquier organismo. Se debe realizar una optimización de la digestión con micrococcal nuclease para cada nuevo lote de micrococcal nuclease.Prepare lo siguiente para cada reacción: un microlitro de tampón 10x de nucleasa microcócica, albúmina sérica bovina al 1x, un microgramo de ADN diana, un microlitro de nucleasa microcócica y agua hasta un volumen final de 10 microlitros. Incube a 37 grados Celsius durante 15 minutos.Inactivar inmediatamente la enzima añadiendo un microlitro de EGTA 500 milimolar. Añadir tampón de muestra con colorante de carga para geles a las muestras de ADN y cargar un microgramo de ADN por pozo en un gel de poliacrilamida al 20 %. Cargar una escalera de ADN apropiada para determinar el tamaño.Corra el gel en tampón de electroforesis 1x TBE a 150 voltios durante aproximadamente 1,5 horas o hasta que el frente de colorante inferior alcance el extremo inferior del gel. Tiña el gel utilizando un colorante ultrasensible para ácidos nucleicos y visualícelo bajo luz ultravioleta. En este ejemplo, la concentración óptima de nucleasa microcócica para digerir el ADN hasta fragmentos de 20 a 30 pares de bases fue de 10 unidades.Utilice esta concentración óptima de nucleasa microcócica para digerir de 10 a 12 microgramos de ADN diana de la misma manera que se demostró para las reacciones de optimización. Después de separar los fragmentos de ADN mediante electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE), use un escalpelo estéril para cortar el gel junto a la banda del marcador y tiña solo la parte del gel que contiene la escalera con tampón de electroforesis TBE 1x fresco que contenga un colorante ultrasensible para ácidos nucleicos. Visualice la escalera de ADN y use una cuchilla para excavar los fragmentos de ADN digeridos con nucleasa microcócica en un rango de tamaño entre aproximadamente 18 y 30 pares de bases.Transfiera el trozo de gel a un tubo de microcentrifugado. Tiña el resto del gel con un colorante para ácidos nucleicos como se mostró anteriormente. Exponga el gel a luz ultravioleta y obtenga una imagen como registro del paso de escisión del gel.Comience este procedimiento utilizando una punta de pipeta estéril para triturar el trozo de gel resecado contra la pared del tubo de microcentrifugación. Añada dos volúmenes de gel de tampón de solubilización de PAGE e incube a 37 grados Celsius en una plataforma rotatoria durante 16 horas. Al día siguiente, centrifugue la muestra en una microcentrifugadora a velocidad máxima durante un minuto.Transfiera los sobrenadantes a un nuevo tubo de microcentrifuga teniendo cuidado de no transferir fragmentos de gel triturados. Añada 0,5 volúmenes de tampón de solubilización para PAGE al pellet de gel, vortexee y repita la centrifugación. Combine los sobrenadantes y extraiga los fragmentos de ADN utilizando un método estándar de extracción con fenol-cloroformo como se describe en el protocolo escrito.Paralelamente al aislamiento de fragmentos de ADN, amplifique los conectores a partir del vector de expresión de ARN guía mediante PCR estándar. Para asegurar la clonación direccional, los conectores se digieren luego con las enzimas de restricción apropiadas, como se describe en el protocolo de texto. Somete la digestión con enzima de restricción de los conectores a una electroforesis en gel de agarosa al uno por ciento.Excise las bandas correctas y purifique el ADN de los fragmentos cortados del gel utilizando un kit de extracción de gel. Se utiliza un kit de emparejamiento de extremos de ADN para la reacción de reparación de extremos. Añada lo siguiente a un tubo de microcentrífuga.10 microlitros de ADN purificado, 1,5 microlitros de tampón blunt 10x, 1,5 microlitros de una mezcla de dNTPs de un milimolar, 1,4 microlitros de agua y 0,6 microlitros de enzima blunt. Incubar a 22 grados Celsius durante 30 minutos y luego calentar y activar la enzima mediante incubación a 70 grados Celsius durante 10 minutos. Añadir 85 microlitros de agua y realizar una limpieza de la reacción según se describe en el protocolo del texto.Prepare una reacción de ligación de 14 microlitros utilizando cantidades molares iguales de fragmentos digeridos y reparados con nucleasa microcócica y secuencias de enlazador, tal como se describe en el protocolo escrito. Tras la traducción del niquel, el producto de ligación se amplifica mediante PCR. Para separar los fragmentos de nucleasa microcócica con el enlazador cinco prima y tres prima correctamente unidos de aquellos fragmentos con dos enlazadores cinco prima o dos enlazadores tres prima, combine todas las reacciones de PCR de 15 ciclos, agregue colorante de carga de ADN y corra en un gel de agarosa al 0,8 %.Excise la banda destacada de 869 pares de bases y purifique el ADN utilizando un kit de extracción de geles. Cuantifique la cantidad de ADN utilizando un espectrofotómetro. Posteriormente, clone los fragmentos amplificados por PCR en el vector de expresión de ARN guía mediante ensamblaje Gibson, como se detalla en el protocolo del texto.Para comenzar este procedimiento, alícuote el constructo del vector inserto purificado en tubos PCR estériles y previamente enfriados y manténgalos en hielo. Enfríe cubetas de electroforesis de 1 milímetro de separación en hielo. Añada 25 microlitros de células TG1 recién preparadas directamente a una alícuota de ADN y transfiera inmediatamente la mezcla a una cubeta de electroforesis.Toque ligeramente o pulse el cubeta para asegurarse de que la mezcla de células y ADN se distribuya a lo largo de la longitud de la cámara de la cubeta sin que queden burbujas o aire atrapado. Coloque la cubeta en la cámara del portaobjetos e inicie el programa de electroforesis adecuado. Añada inmediatamente 475 microlitros de 2TY a temperatura ambiente a la cubeta.Transfiera las bacterias electro poradas a un tubo de 50 mililitros. Repita las electro poraciones individuales, reúna todas las células transformadas con una biblioteca en un solo tubo de 50 mililitros y documente el volumen total. Para estimar el número total de colonias de toda la biblioteca, siembre una cantidad pequeña definida de bacterias transformadas con la biblioteca en una placa de agar de 10 centímetros con la selección apropiada de antibiótico.Para reducir el volumen del resto de las bacterias, centrifugar a aproximadamente 4.000 g durante 10 minutos o hasta que se forme una capa visible y el sobrenadante aparezca claro. Eliminar todo el sobrenadante excepto unos pocos mililitros y resuspender las células. Sembrar las bacterias en placas de bioensayo recubiertas con agar 2TY que contengan la selección con antibiótico adecuada.Extienda un volumen adecuado de la reacción de electrotransformación control con pUC19 en una placa adicional de agar de 10 centímetros con selección apropiada de antibiótico. Incube las placas de agar a 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, cuente el número de colonias en las placas control para estimar las unidades formadoras de colonias por microgramo de ADN para las bacterias, así como la complejidad de la biblioteca.Por último, raspe las bacterias de la placa para la extracción de ADN plasmídico. Después de la purificación en gel, se cargó 1/6 de los fragmentos de nucleasa micrococácea purificados en un gel de PAGE al 20 % para confirmar la selección de tamaño y la purificación exitosas. Los amplicones de los adaptadores se digirieron con enzimas de restricción para asegurar que los adaptadores se liguen a los fragmentos digeridos con nucleasa micrococácea en la orientación correcta.El lado izquierdo de esta imagen representativa del gel muestra los enlazadores 5' y 3' antes y después de la digestión con HindIII y SacII, respectivamente, lo que indica una digestión completa de los enlazadores hasta los 637 pares de bases y 295 pares de bases predichos. El lado derecho de la imagen del gel documenta la eliminación de los fragmentos de enlazadores digeridos. La ligación exitosa de los enlazadores a los fragmentos de ADN se analizó mediante PCR con un número aumentado de ciclos de PCR.Los controles incluidos fueron un control sin molde que utilizó el control sin molde del paso anterior de traducción de muescas como entrada, y un control sin fragmento de nucleasa microcócica. Solo las muestras en las que los fragmentos de nucleasa microcócica se combinaron con el ADN conector produjeron el amplicón esperado de 869 pares de bases. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cinco días si se lleva a cabo correctamente.Al intentar este procedimiento, es importante mantener la complejidad de la biblioteca y realizar otras reacciones de control. Después de ver este video, ahora debería tener una buena comprensión de cómo generar una biblioteca de ARN guía para análisis basados en CRISPR al fragmentar el ADN en fragmentos pequeños y clonarlos en el andamiaje del vector de biblioteca.

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