Un protocolo Universal para la gRNA a gran escala de producción de la biblioteca de cualquier fuente de ADN

El objetivo general de este método es construir bibliotecas de ARN guía completas a partir de ADN purificado de cualquier fuente. Las bibliotecas de ARNg son colecciones de plásmidos utilizadas en cribados basados en CRISPR. El método CORALINA utiliza la digestión enzimática del ADN purificado para clonar los fragmentos resultantes en una columna vertebral de la biblioteca de ARN guía.

La principal ventaja de esta técnica es que produce todos los ARN guía posibles a partir de la secuencia de entrada y es muy rentable. Aunque este vídeo demuestra la protección de una biblioteca CORALINA frente a un cromosoma artificial bacteriano, este método puede aplicarse en principio a cualquier tipo de ADN de entrada de cualquier organismo. Se debe realizar una optimización de la digestión de la nucleasa microcócica para cada nuevo lote de nucleasa microcócica.

Configure lo siguiente para cada reacción. Un microlitro de 10x tampón de nucleasa microcócica, 1x albúmina sérica bovina, un microgramo de ADN objetivo, un microlitro de nucleasa microcócica y agua por 10 microlitros. Incubar a 37 grados centígrados durante 15 minutos.

Inactivar inmediatamente la enzima añadiendo un microlitro de 500 milimolares de EGTA. Agregue tampón de muestra con colorante de carga de gel a las muestras de ADN y cargue un microgramo de ADN por pocillo en un gel de poliacrilamida al 20%. Cargue una escalera de ADN adecuada para el dimensionamiento.

Ejecute el gel en 1x tampón de funcionamiento TBE a 150 voltios durante aproximadamente 1,5 horas o hasta que el frente de tinte inferior alcance el extremo inferior del gel. Tiñe el gel con una tinción de ácido nucleico ultrasensible y visualízalo bajo luz ultravioleta. En este ejemplo, la concentración óptima de nucleasa microcócica para digerir el ADN de hasta 20 a 30 pares de bases de tamaño fue de 10 unidades.

Utilice esta concentración óptima de nucleasa microcócica para digerir de 10 a 12 microgramos de ADN objetivo de la misma manera que se demostró para las reacciones de optimización. Después de separar los fragmentos de ADN con PAGE, utilice un bisturí estéril para cortar el gel junto a la línea de marcador y teñir solo la parte del gel que contiene la escalera con un tampón de ejecución 1x TBE fresco que contenga una tinción de ácido nucleico ultrasensible. Visualice la escalera de ADN y use una hoja de afeitar para extirpar fragmentos de ADN digeridos con nucleasa microcócica en el rango de tamaño entre aproximadamente 18 a 30 pares de bases.

Transfiera la rodaja de gel a un tubo de microcentrífuga. Tiñe el resto del gel con una tinción de ácido nucleico como se muestra anteriormente. Exponga el gel a la luz ultravioleta y obtenga una imagen como registro del paso de escisión del gel.

Comience este procedimiento utilizando una punta de pipeta estéril para triturar la rebanada de gel extirpada contra la pared del tubo de microcentrífuga. Añadir dos volúmenes de gel de tampón de solubilización PAGE e incubar a 37 grados centígrados en una plataforma giratoria durante 16 horas. Al día siguiente, centrifugar la muestra en una microcentrífuga a máxima velocidad durante un minuto.

Transfiera los sobrenadantes a un nuevo tubo de microcentrífuga teniendo cuidado de no transferir ningún trozo de gel triturado. Añada 0,5 volúmenes de tampón de solubilización PAGE al gel de gel, vórtice y repita la centrifugación. Combine los sobrenadantes y extraiga los fragmentos de ADN utilizando un método estándar de extracción de fenol-cloroformo como se describe en el protocolo de texto.

Paralelamente al aislamiento de fragmentos de ADN, amplifique los enlazadores del vector de expresión de ARN guía mediante PCR estándar. Para garantizar la clonación direccional, los enlazadores se digieren con las enzimas de restricción apropiadas como se describe en el protocolo de texto. Ejecute la digestión de la enzima de restricción de los enlazadores en un gel de agarosa al uno por ciento.

Extraiga las bandas correctas y purifique el ADN de las piezas de gel extirpadas utilizando un kit de extracción de gel. Se utiliza un kit de embotamiento de ADN para la reacción de reparación final. Agregue lo siguiente en un tubo de microfuga.

10 microlitros de ADN purificado, 1,5 microlitros de tampón de romo 10x, 1,5 microlitros de una mezcla de dNTP milimolar, 1,4 microlitros de agua y 0,6 microlitros de enzima roma. Incubar a 22 grados centígrados durante 30 minutos y luego calentar y activar la enzima mediante incubación a 70 grados centígrados durante 10 minutos. Agregue 85 microlitros de agua y realice una limpieza de reacción como se describe en el protocolo de texto.

Configure una reacción de ligadura de 14 microlitros utilizando cantidades molares iguales de fragmentos de nucleasa microcócica digerida y reparada y secuencias enlazadoras como se describe en el protocolo de texto. Después de la traducción del nick, el producto de ligadura se amplifica mediante PCR. Para separar los fragmentos de nucleasa microcócica con el enlazador de cinco primos y tres primos correctamente unido de los fragmentos con dos enlazadores de cinco primos o dos de tres primos, combine todas las reacciones de PCR de 15 ciclos, agregue un tinte de carga de ADN y ejecute en un gel de agarosa al 0,8%.

Extirpe la banda prominente en 869 pares de bases y purifique el ADN con un kit de extracción en gel. Cuantificar la cantidad de ADN utilizando un espectrofotómetro. Posteriormente, clonar los fragmentos amplificados por PCR en el vector de expresión de ARN guía mediante el ensamblaje de Gibson como se detalla en el protocolo de texto.

Para comenzar este procedimiento, el inserto de vector purificado alícuota se construye en tubos de PCR estériles y preenfriados y se mantiene en hielo. Enfríe las cubetas de electroporación con un espacio de un milímetro en hielo. Agregue 25 microlitros de células TG1 recién preparadas directamente a una alícuota de ADN y transfiera inmediatamente la mezcla a una cubeta de electroporación.

Golpee o golpee la cubeta para asegurarse de que las células y la mezcla de ADN se distribuyan a lo largo de la cámara de la cubeta sin aire ni burbujas atrapadas. Coloque la cubeta en la cámara de portaobjetos e inicie el programa de electroporación adecuado. Agregue inmediatamente 475 microlitros de 2TY a temperatura ambiente a la cubeta.

Transfiera las bacterias electroporadas a un tubo de 50 mililitros. Repita las electroporaciones individuales, recoja todas las celdas transformadas con una biblioteca en un tubo de 50 mililitros y documente el volumen total. Para estimar el número total de colonias para toda la biblioteca, coloque una pequeña cantidad definida de bacterias transformadas con la biblioteca en una placa de agar de 10 centímetros con la selección de antibióticos adecuada.

Para reducir el volumen del resto de bacterias, centrifugar a aproximadamente 4.000 g durante 10 minutos o hasta que se haya formado una paleta visible y el sobrenadante parezca transparente. Retire todos los mililitros del sobrenadante excepto unos pocos y vuelva a suspender las células. Coloque las bacterias en placas de bioensayo recubiertas de agar 2TY que contengan la selección adecuada de antibióticos.

Extienda un volumen adecuado de la reacción de electroporación de control pUC19 en una placa de agar adicional de 10 centímetros con la selección adecuada de antibióticos. Incubar las placas de agar a 37 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, cuente el número de colonias en las placas controladas para estimar la unidad formadora de colonias por microgramo de ADN para las bacterias, así como la complejidad de la biblioteca.

Por último, raspe las bacterias de la placa para la extracción de ADN plasmídico. Después de la purificación del gel, 1/6 de los fragmentos de nucleasa microcócica purificados se cargaron en un gel 20%PAGE para confirmar el éxito de la selección del tamaño y la purificación. Los amplicones enlazadores se digirieron con enzimas de restricción para asegurar que los enlazadores se ligen a los fragmentos digeridos por la nucleasa microcócica en la orientación correcta.

El lado izquierdo de esta imagen de gel representativa muestra cinco enlazadores primarios y tres primos antes y después de la digestión con HindIII y SacII respectivamente, lo que indica una digestión completa de los enlazadores a los 637 pares de bases predictivos y 295 pares de bases. El lado derecho de la imagen en gel documenta la escisión de los fragmentos de enlazador digeridos. La ligadura exitosa de los enlazadores a los fragmentos de ADN se analizó mediante PCR con un mayor número de ciclos de PCR.

Los controles incluidos fueron un control sin plantilla que utilizaba el control sin plantilla del paso anterior de traslación de nick como entrada y un control sin fragmentos de nucleasa microcócica. Solo las muestras en las que se han combinado fragmentos de nucleasa microcócica con ADN enlazador produjeron el amplicón esperado de 869 pares de bases. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco días si se hace correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante mantener la complejidad de la biblioteca y realizar otras reacciones de control. Después de ver este video, ahora debería tener una buena comprensión de cómo generar una biblioteca de ARN guía para pantallas basadas en CRISPR cortando el ADN en trozos pequeños y clonándolos en la columna vertebral del vector de la biblioteca.