En Vivo Seguimiento de humanos derivados del adiposo células madre mesenquimales en un modelo de artrosis de rodilla de ratas con tinte fluorescente membrana lipofílica

Este protocolo describe un medio eficaz para controlar la persistencia de la célula y la biodistribución de humanas derivados del adiposo células madre mesenquimales (haMSCs) por far-red de la fluorescencia de etiquetado en un modelo de ratas rodilla osteoartritis (KOA) mediante inyección intra-articular (IA).

El objetivo general de este procedimiento es evaluar la eficacia de la persistencia celular y la biodistribución de las células madre mesenquimales derivadas del tejido adiposo humano en una osteoartritis de rodilla de rata, o un modelo KOA, utilizando imágenes fluorescentes in vivo. El seguimiento de células madre in vivo puede ayudar a responder a preguntas clave en el campo de las matemáticas regenerativas sobre la irritación y la distribución del tejido adiposo humano derivado de las células madre mesenquimales en modelos animales KOA. La principal ventaja de usar DiD es que su espectro de emisión desplazado por rata permite obtener imágenes de tejido profundo en animales vivos sin efectos citóticos ni daño funcional a las células marcadas con colorante.

Comience colocando una rata Sprague Dawley macho anestesiada de 250 a 300 gramos, de ocho a 12 semanas de edad, en la posición lateral izquierda sobre una almohadilla térmica. Use una navaja de afeitar completamente la rodilla derecha y desinfecte el área quirúrgica con una solución de yodo al 10% de povidona y etanol al 70%. Cubra el área no quirúrgica con una almohadilla quirúrgica.

Y use un bisturí para hacer una incisión de dos centímetros lateralmente a lo largo del tendón rotuliano para exponer las cápsulas articulares. A continuación, utilice un bisturí quirúrgico para seccionar el ligamento colateral medial, reflejando el menisco hacia el fémur, y agarre el menisco medial con fórceps. Use un bisturí para cortar el menisco en su punto más estrecho desde la inserción tibial.

Para obtener un inicio fiable y factible de KOA, el lado del fémur del menisco debe cortarse completamente en cada animal de experimentación. A continuación, cierre la cápsula articular con una sutura observable de cuatro O y controle a la rata hasta que se recupere por completo. Ocho semanas después de la cirugía, se separan las células mesenquimales derivadas del tejido adiposo humano de un cultivo confluente al 80% con dos mililitros de tripsina más EDTA durante tres minutos a 37 grados centígrados.

Pasados unos minutos, neutralizar la tripsina con cuatro mililitros de medio de cultivo completo y recoger las células por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet a una concentración de 10 a la sexta celdas por mililitro en cinco mililitros de medio de cultivo libre de suero. Y etiquete las celdas con 50 microlitros de solución de etiquetado de celdas DiD durante 50 minutos a 37 grados centígrados.

Al final de la incubación, recoja las células por centrifugación y lávelas dos veces en cinco mililitros de PBS por lavado. Después de la última centrifugación, diluya las células a una concentración de 2,5 veces 10 a la sexta célula viable por cada 100 microlitros de PBS y cargue las células en una jeringa de un mililitro equipada con una aguja de calibre 26. A continuación, vuelva a afeitar la rodilla artrítica del primer animal de experimentación para exponer el área de la articulación y desinfecte la piel expuesta con etanol al 70%.

Inyecte las células marcadas en el centro del triángulo formado por el lado medial del ligamento rotuliano, el cóndilo femoral medial y el cóndilo tibial medial, y abra el software de imágenes. Inicialice el sistema de imágenes de bioluminiscencia in vivo y coloque a los animales en posición supina dentro de la etapa central del sistema de imágenes. Con la puerta de la cámara cerrada, marque la caja de fluorescentes y seleccione los conjuntos de filtros fluorescentes de excitación y emisión adecuados.

Establece el campo de visión en D, la flexión de píxeles en ocho, el número F en dos y el tiempo de exposición en automático. Después de obtener las imágenes, permita que los animales se recuperen en una almohadilla térmica con monitoreo hasta la recuperación completa. A continuación, en el software de análisis de imágenes adecuado, seleccione las unidades de eficiencia radiante para la medición de la fluorescencia y las regiones de interés para el análisis y cuantifique las señales fluorescentes de cada imagen.

En este experimento representativo, se evaluaron secciones seriadas de la articulación de la rodilla de una rata inducida por osteoartritis de rodilla mediante tinción de H&E y safranina O/Fast Green ocho semanas después de la cirugía. El grosor del cartílago articular es más delgado en las rodillas artríticas que en las articulaciones contralaterales sin cirugía, como se observa en las secciones teñidas con H&E. Además, el proteoglicano disminuye y el colágeno fibrilado aumenta en la articulación de la artritis, como se visualiza mediante la tinción con safranina O/Fast Green, lo que indica la progresión del fenotipo degenerativo de la osteoartritis de rodilla inducida por la cirugía.

Una hora después de la tinción, las células mesenquimales derivadas del tejido adiposo humano marcadas con DiD presentan una forma redonda in vitro. Después de 24 horas, las células mesenquimales cultivadas marcadas con DiD muestran una forma de huso largo, lo que confirma que DiD no cambia la capacidad de adherencia de las células. La obtención de imágenes de las rodillas de los animales osteoartríticos ocho semanas después de la cirugía revela la presencia de las células marcadas con DiD desde el día cero hasta el día 70 después de la inyección.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la terapia con células madre determinaran la rutina y la dosis óptimas para la inyección segura y factible de células madre mesenquimales para el tratamiento de la osteoartritis de rodilla en animales. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar células madre mesenquimales humanas con DiD para la inyección y el seguimiento in vivo en el modelo KOA de rata inducido quirúrgicamente.