Diferenciación rápida y dirigida de las células epiteliales del pigmento retiniano de humanos embrionarios o inducidas pluripotenciales células

El objetivo general de este método es dirigir eficazmente la diferenciación de las células madre pluripotentes en células epiteliales pigmentarias de la retina en una capa homogénea. Este método ayuda a responder preguntas en el campo de la investigación de la retina y los ojos, como cómo se desarrolla la retina y cómo establecer un modelo de enfermedad con células madre. La principal ventaja de esta técnica es que es más rápida y eficiente que los métodos espontáneos.

Este método utiliza una combinación de factores de crecimiento y moléculas pequeñas para dirigir la diferenciación de las células madre para que se conviertan en EPR inmaduros en 14 días y EPR funcional maduro después de tres meses. Cassidy Arnold, directora asociada del laboratorio de biología e ingeniería de células madre de la Universidad de California en Santa Bárbara, demostrará partes del procedimiento. Para comenzar este procedimiento, cultive colonias de células madre en condiciones libres de alimentador y suero hasta aproximadamente el 80% de confluencia antes de la aprobación.

A continuación, cubra una placa de 12 pocillos con hidrogel a base de matriz extracelular según las recomendaciones del fabricante y déjela reposar durante una hora a temperatura ambiente o toda la noche a cuatro grados centígrados. Después de eso, alícuota el volumen de medios de diferenciación de la retina y PBS sin calcio o magnesio necesarios para el día cero y calentarlos en un baño de agua a 37 grados centígrados. A continuación, agregue los factores de crecimiento al RDM calentado y lleve el EDTA a temperatura ambiente.

Si es necesario, retire todas las colonias diferenciadas con una punta de pipeta P10 basada en la morfología de las células madre que se pasarán para la diferenciación. Las células fibroblásticas entre colonias, así como las células opacas dentro de las colonias, indican las células diferenciadas que se deben eliminar. La extracción manual de células es uno de los pasos más críticos del protocolo, ya que comenzar con una población de células madre completamente indiferenciada permitirá un enriquecimiento más eficiente.

A continuación, se pasa de un solo pocillo de una placa de seis pocillos a cuatro pocillos de una placa de 12 pocillos aspirando el medio de las células madre y lavando los pocillos una vez con dos mililitros de PBS precalentado. A continuación, aspire el PBS y enjuague cada pocillo tres veces con un mililitro de EDTA por pocillo. A continuación, incline suavemente la placa y aspire el EDTA.

No agite la placa de ninguna manera para evitar levantar prematuramente las células. Después del tercer lavado, agregue un mililitro de EDTA nuevamente e incube la placa a temperatura ambiente en la campana durante tres a cinco minutos. No moleste la placa durante esta incubación.

A continuación, aspire el EDTA y añada un mililitro de RDM por pocillo que se asentará más 0,5 mililitros de medio extra. Por ejemplo, lave un pocillo de una placa de seis pocillos con 4,5 mililitros de MDR para colocar en cuatro pocillos de una placa de 12 pocillos. Luego, use un raspador de células para separar suavemente las células.

Triture las celdas en RDM pipeteando hacia arriba y hacia abajo cinco veces en el pocillo y complete este paso rápidamente para evitar que se vuelvan a unir a la placa. Colocar en un tubo cónico. Disocie grandes grupos de células, pero no triture hasta obtener una suspensión de una sola célula.

Distribuya las células de manera uniforme en la pipeta y complete este paso rápidamente para evitar que se vuelvan a unir a la placa. Si lo desea, use un microscopio óptico para observar el tamaño de los grupos de células. Posteriormente, siembre las células en placas de 12 pocillos recubiertas de ECM.

Incline la placa hacia adelante y hacia atrás para distribuir las celdas de manera uniforme por los pocillos y colóquela en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados y 5% de CO2 hasta el próximo cambio de medio. En este procedimiento, cubra una placa de seis pocillos con ECM reducido por factor de crecimiento según las recomendaciones del fabricante. Deje que se asiente durante una hora a temperatura ambiente durante toda la noche a cuatro grados centígrados.

A continuación, alícuota la cantidad de DPBS necesaria y un mililitro de MDR por pocillo de enriquecimiento y calentarlos a 37 grados centígrados en un baño de agua. Lleve la enzima similar a la tripsina a temperatura ambiente y caliente la cantidad requerida de medio de soporte de RPE a 37 grados Celsius. Después de eso, agregue un reactivo antimicrobiano y un inhibidor de ROCK al RSM para lograr una concentración final de 0,5 veces el antimicrobiano y el inhibidor de ROCK de 10 micromolares.

Use este medio durante los primeros cuatro a siete días para mejorar la fijación. A continuación, aspire el medio gastado de todos los pocillos y agregue un mililitro por pocillo de RDM precalentado sin factores de crecimiento. Si es necesario, diseccione y raspe todas las células que no sean EPR con una punta de pipeta P10 bajo un microscopio de disección.

Después de la disección, aspire el RDM y todos los restos celulares y lávelos dos veces con un mililitro de DPBS precalentado por pocillo. Posteriormente, se añaden 0,5 mililitros de TDE por pocillo de una placa de 12 pocillos y se incuba a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Luego, use un raspador de células para eliminar suavemente las células de la placa.

Triture suavemente la suspensión de enzimas celulares pipeteando hacia arriba y hacia abajo tres o cuatro veces para crear una suspensión uniforme. A continuación, diluya la suspensión de enzimas celulares en una proporción de uno a 10 en el RSM precalentado sin inhibidor de ROCK. Centrifugar la suspensión celular a 173 g durante cinco minutos a temperatura ambiente.

Después de cinco minutos, aspire el medio del pellet celular y vuelva a suspender las células en RSM con un inhibidor de ROCK de 10 micromolares. A continuación, cuele las células con un colador de celdas de malla de nailon con poros de 40 micrómetros. Cuente el número de células con un hemocitómetro y calcule la concentración de células en la solución filtrada.

A continuación, siembre las células en las placas recubiertas de ECM reducidas con factor de crecimiento a una vez 10 a las cinco células por centímetro cuadrado en cuatro mililitros de RSM con 10 micromolares inhibidor de ROCK. Reemplace el RSM con un inhibidor de ROCK de 10 micromolares 48 horas después de la siembra celular y continúe reemplazando el medio cada tres o cuatro días. Deje de agregar el inhibidor de ROCK al RSM después de cuatro a siete días.

Deje que las células maduren durante 28 a 35 días a 37 grados centígrados y 5% de CO2 y continúe reemplazando el RSM cada tres o cuatro días. Aquí se muestran las células madre pluripotentes inducidas inmediatamente antes de pasar para su diferenciación. Las células madre son pequeñas y están densamente empaquetadas dentro de las colonias, que no parecen contener células diferenciadas como fibroblastos entre ellas o pasajes opacos dentro de las colonias.

Aquí están las células RPE inmaduras en el segundo día. Las celdas en esta etapa aún deben ser subconfluentes y extender las proyecciones en los espacios vacíos entre las celdas. Estas células se seleccionan antes de eliminar el enriquecimiento en el día 14.

Las celdas que no son RPE aparecen como parches o cintas opacas. El parche redondo contiene células con una morfología fibroblástica, mientras que los parches opacos se cree que son retina neural. Estas imágenes muestran el RPE en el pasaje cero, uno y tres en el día 30.

En cada paso, las células deben ser confluentes y parecer tener las características distintivas de la morfología epitelial pigmentada de la retina, incluidos los bordes de fase brillante y una forma poligonal. Una vez dominadas, las técnicas de paso y enriquecimiento pueden completarse en una o dos horas, dependiendo de la escala del cultivo celular. Siguiendo este procedimiento, se pueden utilizar técnicas como la cuantificación de genes o proteínas y los ensayos funcionales para responder a preguntas sobre la capacidad del EPR para secretar factores de crecimiento o fagocitar segmentos externos.

Los artículos publicados por Dave Buchholz en 2013 y Lindsay Leach en 2015 detallan el desarrollo y la optimización de este método. Hemos proporcionado una demostración detallada y exhaustiva de cada paso del procedimiento para que esté disponible para los investigadores en el campo. Feliz experimentación.