Name: Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, Ictalurus punctatus, embriones de Gene Editing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 8 s
Description: Aprende a realizar microinyección de CRISPR/Cas9 en embriones de bagre de canal Ictalurus punctatus para edición génica. Este protocolo validado permite estudiar genómica funcional en acuicultura.

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Esta investigación fue financiada por premio de USDA-NIFA 2015-67015-23488 a Roger Cone. Los autores agradecen a Dr. Ronald Phelps para la descripción de los criterios de selección común cría en el video. Ahmed Elaswad y Karim Khalil gustaría agradecer egipcio Cultural y educativa oficina en Washington para la financiación de su investigación de doctorado.

Este experimento se llevó a cabo en la unidad de investigación de genética de peces, centro de investigación de pesquerías de E. W. Shell, Universidad de Auburn, Alabama. Todos los protocolos experimentales utilizados en este experimento fueron aprobados por la Universidad de Auburn institucional Animal Care y Comité uso (IACUC-AU) antes de inicia el experimento. Una lista de la maquinaria y equipo utilizado en este experimento puede encontrarse en la tabla de materiales. Los siguientes son los pasos y procedimientos para la preparación y microinyección de embriones de una célula de bagre de canal como se ilustra en la figura 1.
1. selección de acciones y desove de reproductores
<ol><li>Elegir sano bagre cría de la cepa o línea genética de interés. Hembras y machos de bagre de canal deben exhibir buenas características secundarias del sexo.</li>
	<li>Seleccionar los machos que tienen una amplia cabeza muscular que es más ancha que el resto de sus cuerpos con la papila genital bien desarrollada. Color oscuro, cicatrices y heridas de lucha territorial son también signos de preparación sexual. Seleccionar las hembras que tienen jefes que son más estrechos que el resto de sus cuerpos y tienen abdomen suave, palpable, bien redondeado. Para la precisión y evitar destacando los peces durante el manejo inicial, pare el alimentar a las hembras 2-3 días antes de examinar su preparación para el desove.</li>
	<li>Realizar manejo rápidamente pero con cuidado de peces. Para reducir el estrés de manejo, realizar todos los procedimientos que requieren manejo de hembras manteniendo peces en bolsas (32 m m tamaño de malla) de desove.</li>
	<li>Justo antes de la inyección de hormonas para inducir la ovulación, medir el peso corporal de las hembras.</li>
	<li>Colgar las bolsas de desove con las mujeres dentro de un flujo a través del tanque con el flujo de agua continuo y suficiente aireación.</li>
	<li>Asépticamente, carga al implantador que tiene una aguja 14 G con 85 μg/kg de implante de (LHRHa) análogo de la hormona de liberación de la hormona luteinizante. Enjuagar el sitio de inyección (musculatura dorsal) con solución salina estéril 0,9% antes de la inyección. Inserte al implantador en un ángulo de 45° y liberar el implante. Retirar la aguja y pasar el sitio de inyección con una bola de algodón previamente empapada en etanol al 70%.</li>
	<li>Lugar la bolsa de desove en el depósito para que el pescado esté totalmente sumergido en agua 15-20 cm por debajo de la superficie del agua. Adecuada aireación (sobre 5 ppm disuelto oxígeno) y buena calidad del agua son importantes para la ovulación de los huevos de alta calidad.</li>
	<li>Predecir el momento de la ovulación basado en la temperatura del agua mediante la relación de grados-hora (h)35. Tiempo de respuesta de grado h = tiempo entre la inyección de hormonas y la ovulación (h) * temperatura (° C) del agua. Por ejemplo, para un tiempo de respuesta de h grado de 900-1000, una mujer espera a desovar a las 36-40 h de tiempo de la inyección de la hormona a 25 ° C. Generalmente, el primer cheque de huevos se realiza en aproximadamente 36 h después de la inyección de hormona y luego en intervalos de 4 h.</li>
	<li>Para verificar la ovulación, levante suavemente la bolsa reproductora por encima de la superficie del agua mientras que usted está buscando los huevos que se fijan dentro de la bolsa de desove. Ver al menos 10 huevos indica que esta mujer está ovulando y lista para pelar de la mano.</li>
</ol>2. preparación del esperma
Nota: Espermatozoides se pueden preparar unos h antes de la ovulación esperada.
<ol><li>Eutanasia a los machos por un percusión golpe en la cabeza sin anestesia, ya que la anestesia tenga un efecto negativo sobre la motilidad del esperma.</li>
	<li>Recoger los testículos en un platillo pequeño, quitar cualquier tejido y lavar con 50 mL de solución salina 0.9% para eliminar sangre, si es necesario. Testículos bien desarrollados son de color blancos con muchas proyecciones viliformes ( figura 2).</li>
	<li>Determinar el peso de los testículos.</li>
	<li>Para preparar la solución de esperma para la fertilización del huevo, transferir los testículos al centro de una malla de 100 cm2 100 μm usando fórceps. Doblar la malla con los testículos dentro, aplastar los testículos y los espermatozoides del filtro en un tubo de recogida de 50 mL. Esto puede hacerse aplicando presión a los testículos dentro de la malla contra el borde del tubo de colección mediante el pulgar. Usar solución salina 0.9% lavar los espermatozoides de la malla en el tubo de la colección. Solución salina se puede Agregar hasta 10 mL/g de los testículos.</li>
	<li>Determinar la concentración de los espermatozoides, comprobar la motilidad y viabilidad. Nota: La concentración se puede determinar contando los espermatozoides en un volumen conocido de diluido de semen usando un hemocitómetro. Por otra parte, la densidad de esperma puede estimarse mediante la evaluación de la densidad óptica de semen usando un espectrofotómetro. En este método, la absorción en la longitud de onda de 505 nm es comparada con un gráfico de control que ha sido previamente preparado para la absorción de diferentes concentraciones de espermatozoides36. La motilidad del esperma se puede comprobar al microscopio como el tiempo de activación de los espermatozoides hasta el cese de esperma movimiento (llamado duración de motilidad)37. La viabilidad de los espermatozoides puede determinarse por la coloración de la esperma con tintes selectivos como el trypan azul, que se mancha espermatozoides no viables solamente, mientras que esperma viable seguirá siendo sin mancha. Sin embargo, para estos procedimientos de microinyección, esto no es necesario si los testículos están bien desarrollados.</li>
	<li>Almacenar esperma en solución salina al 0.9% de paso 2.5 a 4 ° C y usar dentro de 24 h después de la preparación.</li>
</ol>3. recolección y fertilización del huevo
<ol><li>Aplicar una capa muy fina de manteca a un diámetro de 20 cm limpio y seco desove pan vegetal.</li>
	<li>Lugar de la mujer en la solución anestésica que contiene 100 ppm de sulfonato de metano tricaine tamponada con bicarbonato de sodio (pH de la solución final debe ser 7.0) hasta que el pescado esté totalmente anestesiado38. PRECAUCIÓN: Metanosulfonato sulfonato de metano puede ser irritante si se inhala, ingiere o absorbe a través de la piel.</li>
	<li>Con cuidado, quitar los peces de la bolsa de desove y sumergirla en solución salina 0.9% lavar fuera de la solución anestésica. Seque el pescado completamente con una toalla limpia, evitando la remoción de la capa de moco en la superficie del cuerpo del pescado.</li>
	<li>Aplique grasa vegetal en el área alrededor de la rejilla de ventilación, incluyendo las aletas pélvicas, para evitar la fijación de los huevos durante el desmontaje de la mano.</li>
	<li>Mano tira de los huevos en el desove engrasado aplicando presión suave en los ovarios. Buenos huevos deben fluir libremente, color amarillo dorado y tiene mínimo o ningún grumos o coágulos de sangre (figura 2). Evite el contacto entre huevos y el agua antes de la fertilización, como el agua puede estimular el cierre del micrópilo.</li>
	<li>Para fertilizar los huevos para microinyección, transferencia de 200-300 huevos a un desove enmantecado. Etiquetas de plástico engrasado de la planta pueden utilizarse como una cuchara para transferir huevos en el desove enmantecado. Añadir 1-2 mL de la solución de esperma (del paso 2.5) a los huevos y mezclar suavemente. La proporción de los espermatozoides hacia el huevo debe ser aproximadamente 11.000 de la esperma/del huevo.</li>
	<li>Añadir agua a los huevos para activar el esperma y los huevos. Añada suficiente agua para cubrir un poco los huevos. Agitar suavemente los huevos para 30 s. fertilización debe ocurrir en 1 a 2 min. Es importante fertilizar los huevos que están dispuestos en una sola capa. Huevos de bagre se adhieren entre sí dificultando la microinject varias capas de embriones.</li>
	<li>Añadir más agua dulce a los huevos fecundados y los huevos a endurecer durante 10 – 15 minutos.</li>
	<li>Cubrir la bandeja de desove que contiene los huevos no fertilizados por una toalla mojada para evitar que se sequen y fertilizar durante unas horas. La fertilización puede hacerse de manera escalonada, por ejemplo, un lote de 200-300 huevos pueden ser fecundados cada 30 – 60 min para asegurar un suministro continuo de embriones en la etapa de una célula para microinyección y control no embriones. Evitar el contacto entre la toalla mojada y los huevos, los huevos pueden adherirse a la toalla mojada lo que hace difícil quitarlos. En este protocolo, óvulos fecundados dentro de 2-3 h después de decapar eficientemente fueron microinyectados y tenía éxito similar como huevos fertilizados inmediatamente después de la extracción.</li>
</ol>4. aguja de tracción y de carga
<ol><li>Tirar un vidrio de borosilicato de 1,0 mm OD capilar en 2 agujas (figura 3). Almacenar las agujas en una caja de papel con un trozo de esponja en el cual se hicieron varias incisiones. Para evitar romper la aguja, el diámetro de la esponja debe ser menor que la longitud del vástago de la aguja.</li>
	<li>Rompiendo un pedazo pequeño de la región más fina de la aguja utilizando un objeto punzante para abrir la punta de la aguja. Alternativamente, abra la aguja pellizcando fuera de la región más delgada de la punta con pinzas bajo el microscopio.</li>
	<li>Preparar la solución de la inyección mediante la mezcla de gRNA(s) con la proteína Cas9. Otros tipos de ARN o proteína también pueden ser inyectados con el mismo procedimiento. En este protocolo, gRNAs fueron diseñados para actuar dos del bagre el inmunes genes relacionados, toll/interleukin-1 dominio-que contienen adaptador (TICAM1) de la molécula del gene del receptor y ramnosa Unión lectina (RBL) gene y preparados según Shah et al. con el uso de una alta fidelidad Taq polimerasa32,39. Los objetivos de la genómicos para gRNAs eran 5' GGA GGT GAA GCA GGA de CGA CGT 3' gen TICAM 1 (figura 4) y GGA CTT TGA GTC GGA GAA GTG G 3' 5' para el exón 1 del gen RBL con protospacer motivo adyacente (PAM) de la secuencia subrayada (figura 6).<ol>
<li>Objetivos guía RNA de ráfaga contra el genoma de bagre de canal en secuencia y seleccionar aquellos con no potenciales sitios de fuera de objetivo.</li>
		<li>Agregar rojo de fenol al color de la proteína de gRNA/Cas9 mezclar un tercio del volumen total.</li>
		<li>Ajustar la concentración final de proteína de gRNA/Cas9 mezcla con agua libre de nucleasa para que cada embrión se inyecta con 50 nL con gRNA ng aproximadamente 2,5 y 7,5 ng Cas9 proteína. Incubar la mezcla por 10 min en hielo antes de usarlo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Con un microloader, carga 5-10 μl de la mezcla de gRNA/Cas9 en la aguja de inyección insertando la microloader en el vástago de la aguja y expulsar la mezcla lentamente mientras retrae la punta de microloader (figura 3). Evite atrapar burbujas de aire dentro.</li>
	<li>Conecte la aguja en el soporte de Micropipetas y asegurar una conexión firme y luego fije el soporte a las amalgamas dentales. Garantizar la libre circulación estable. Aplique presión para microinyección abriendo el cilindro de nitrógeno y ajustar el regulador de presión. Nota: El volumen de inyección puede verse afectado por la presión, el diámetro de la abertura de la aguja y la duración de la inyección. Para determinar el volumen a inyectar, inyectar una gota de aceite mineral a un hemocitómetro. Si es necesario, puede ajustarse la presión, la duración de la inyección y el diámetro de la aguja para aumentar o disminuir el volumen de la inyección. Inyectar varias veces el aceite mineral para volumen constante.</li>
</ol>5. microinyección de embriones de bagre
<ol><li>Aplicar una capa muy fina de manteca a un plato de Petri limpia 100 mm vegetal.</li>
	<li>Usando una etiqueta de plástico engrasado de la planta, transferencia de 50-100 huevos de la sartén de la fertilización a la caja Petri y cúbralos con la solución de Holtfreter (tabla de materiales). Alinee los huevos uno contra otro en una sola capa. Esta alineación debe mantener los huevos en su lugar durante el proceso de microinyección.</li>
	<li>Coloque la placa de Petri con los huevos sobre la platina del microscopio y sosténgala con una mano. Baje la aguja con la otra mano (figura 3) hasta que perfora el corión y la yema en un único movimiento suave. La punta de la aguja debe ser lo más cerca posible al blastodisc antes de entregar el material de inyección.<ol>
<li>Presione el pedal para entregar el material de inyección en la yema de huevo. Si el blastodisc no es claramente visible, el material de inyección puede transmitirse en diferentes lugares de la yema. Para ello, se inserta la aguja hasta el final de la yema, y luego presionando el pedal y retirar la aguja se realizan simultáneamente para difundir el material de inyección a través de diferentes áreas de la yema. Hasta 50 nanolitros se puede inyectar en la yema de bagre de canal embriones, sin embargo, la cantidad de proteína de gRNA/Cas9 debe optimizarse para que cada gen lograr los mejores resultados para mutación tasa y embrión de supervivencia32.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Retraer la aguja suavemente para no dañar el huevo. Mueva la caja Petri para inyectar otro huevo con el mismo procedimiento. Evitar el movimiento de la caja Petri durante el proceso de inyección ya que puede dañar el huevo o romper la aguja. Retirar los huevos que están roto o dañados debido a la microinyección. La inyección puede iniciarse a los 15-20 min después de la fertilización y continuar siempre y cuando los embriones están todavía en la etapa de una célula (hasta unos 60-90 min después de la fertilización).</li>
	<li>Coloque los embriones inyectados en solución de Holtfreter con 10 ppm de doxiciclina y continua aireación suave para 6 – 7 días hasta la eclosión de40. Cambiar la solución diariamente y eliminar embriones muertos.</li>
</ol>6. mutación detección
<ol><li>Al azar, recoger varios embriones inyectados en la fertilización post de 72 h, quitar la yema de huevo y extracto de ADN genómico. Son embriones de 3 – 5 no como control. Nota: El ADN genómico puede extraerse de embriones después del retiro de cáscaras de huevo y yema de huevo el material con digestión proteinasa K y etanol precipitación32.</li>
	<li>Amplifican un segmento de ADN que flanquean los objetivos genómicos para el gRNA de cada gen, donde se espera que las mutaciones ocurren con una alta fidelidad de la polimerasa de Taq32. Para TICAM 1, los cebadores 5' GCTGCTGAATGTCTGATTATG 3' (adelante) y 5' GTCCTCCACACTCCTGAAG 3' (atrás) fueron utilizados para amplificar un 750 bp mientras que para RBL, los cebadores 5' TCATTATTTCCTGGTACTCAGTA 3' (adelante) y 5' AGAGATTAGTCACACATCATTATT 3' (atrás) se utiliza para amplificar un segmento 375 de bp del gen RBL.<ol>
<li>Utilice la siguiente reacción de PCR: hasta 20 μl de agua de grado de polimerización en cadena; 1 x alta fidelidad tampón de reacción de enzima Taq con MgCl2, 0,2 mM dNTP mix, 0,4 μm de cada uno de la cartilla de adelante y atrás del mismo grupo, 100-300 ng de ADN genómico y 1,25 unidades de mezcla de enzimas Taq de alta fidelidad. Realizar ciclismo condiciones PCR: desnaturalización inicial a 94 ° C por 3 min; 35 ciclos de desnaturalización a 94 ° C por 30 s, recocido a 60 ° C por 55 s para TICAM y 40 s de RBL, extensión a 72 ° C por 1 min/kb; y extensión final a 72 ° C durante 10 minutos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Detectar los embriones mutantes utilizando un método de detección de mutación como secuenciación de productos PCR purificados, ensayo de detección de mutación de topógrafo, análisis de movilidad del heterodúplex, pérdida del sitio de reconocimiento de enzimas de restricción, o cualquier otro método de detección de mutación que es apropiado para el objetivo. En este protocolo, detectar embriones mutantes mediante el ensayo de detección de mutación de topógrafo para TICAM 1 y pérdida de enzima de restricción que SAPI cortar sitio así como la secuenciación de productos PCR purificados para el gen RBL.</li>
	<li>Para identificar alelos del mutante, clonar los productos PCR y secuencia vectores de colonias individuales. Los alelos del mutante presentados en la figura 4 y figura 6 vinieron de embriones inyectados. Productos PCR de seis microinyectados y embriones control 3 para cada gen se agruparon en dos tubos separados, uno de los embriones microinyectados y el otro para embriones control, rápidamente clonados y 86 vectores TICAM 1 y 48 vectores de gen RBL secuenciados, incluyendo 8 secuencia de reacciones de 3 embriones no de control para cada gen.</li>
	<li>Para identificar diferentes alelos del mutante, comparar las secuencias de los embriones mutantes para la secuencia de tipo salvaje usando cualquier herramienta de alineación de secuencia de DNA como ráfaga o T-café.</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen ningún conflicto de interés.

Se presentó un protocolo detallado para microinyección de embriones de bagre de canal para lograr el golpe de gracia del gene. Inyección de proteína CRISPR/Cas9 en la yema de huevo es mucho más sencilla, ahorra tiempo y no requiere formación amplia en comparación con microinjecting el blastodisc del embrión de una célula, que es la técnica común para la mayoría de la transferencia de genes y gene edición con pescado 30 , 42. el protocolo actual demostró para ser ...

Microinyección es una técnica de laboratorio común utilizada para entregar una pequeña cantidad de una sustancia tales como DNA, RNA, proteínas y otras macromoléculas en células o embriones a través de un capilar de vidrio1. Microinyección se realiza mediante la instalación de equipos especiales incluyendo un microinyector, instrumental quirúrgico y un microscopio2. La técnica se ha utilizado por los investigadores para modificar genéticamente muchos organismos a través de la generación de transgénicos, knockouts de genes y terapia genética, con el objetivo de comprender la dinámica de componentes intracelulares3,4 , 5.
El bagre de canal (Ictalurus punctatus) es la especie más popular del bagre en la acuicultura y las actividades de pesca recreativa en los Estados Unidos. Hay una creciente necesidad de estudio de genómica funcional en bagre de canal, y la secuencia del genoma completo de bagre de canal aumenta la utilidad de los recientes avances en genoma edición herramientas6,7. Comprender la función del gen no sólo enriquecería la investigación que se lleva a cabo en el bagre, pero también podría conducir a programas de mejoramiento genético más efectivos para mejorar la industria del bagre. Una vez que se identifican genes críticos para un determinado rasgo de interés, pueden ser utilizados para mejorar genéticamente la producción de bagre a través de la edición del genoma para generar alelos beneficiosos, selección de estos alelos, suprimiendo los alelos perjudiciales, transferencia de los alelos beneficiosos a través de la transgénesis, o alguna combinación de estas opciones. Combinar los mejores genes para diferentes características comercialmente beneficiosos de diferentes especies de una peces mejoraría grandemente la productividad y rentabilidad de las operaciones de producción de pescado8.
Knockout de genes es un método directo para el estudio de las funciones del gene in vivo. Mutaciones a nivel de ADN serán heredadas por las generaciones futuras que facilitarán el estudio de sus efectos en diferentes generaciones. Herramientas de edición diferentes del genoma han sido desarrollados incluyendo zinc finger nucleasas (ZFNs), transcripción nucleasas activador como efectoras (TALENs) y agrupadas regularmente otro corto palindrómico repeticiones/CRISPR-proteína asociada 9 (CRISPR/Cas9 ) sistema9,10,11,12.
El sistema CRISPR/Cas9 es una herramienta potente y eficaz que se ha utilizado para editar secuencias genómicas de ADN incluyendo knockout de genes de peces a través de RNA-dirigida específica escote de DNA5,13. El sistema consta de un RNA de la guía (gRNA), que determina la secuencia específica en el genoma y una enzima endonucleasa de ADN, Cas9. El sistema CRISPR/Cas9 puede diseñarse para cualquier secuencia en el genoma con varias ventajas sobre ZFNs y TALENs de destino: (1) menor costo de ingeniería (2) más fácil Unión (3) más específica de RNA guía de la secuencia Diana y reducido objetivo mutaciones (4) secuencias múltiples pueden ser dirigidas con gRNA diferentes en la misma proporción de tiempo (5) alta mutagénesis en los genes que podrían no ser transformado por TALENs y (6) tasa de transmisión mejorada del germline de mutaciones para hasta doblez 6 comparado con ZFNs y TALENs14, 15,16,17,18.
El principal método alternativo para la microinyección es electroporación, en el cual se aplican impulsos eléctricos a embriones o células para aumentar la permeabilidad de la membrana y la absorción de moléculas biológicas19,20. Varios peces transgénicos se generaron usando electroporación como medaka (Oryzias latipes), pez cebra (Danio rerio), salmón chinook (Oncorhynchus tshawytscha), bagre, dorada (Sparus sarba), y común carpa (Cyprinus carpio)21,22,23,24,25,26.
La electroporación se ha utilizado para ofrecer proteína de DNA, RNA y Cas9 de plásmido por golpe de gracia del gene. En células de mamífero, Cas9/gRNA plásmido ADN Cas9 mRNA/gRNA y complejos de la proteína/gRNA Cas9 fueron entregados mediante electroporación y las tarifas de mutagénesis fueron mayores con complejos de proteínas/gRNA Cas9 para más electroporación condiciones probadas27. En el cordado de la coloración (Savignyi intestinalis), TALENs expresar construcciones fueron electroporated en los huevos fertilizados para inducir knockout de genes múltiples28. ZFNs expresando plásmido construcciones fueron electroporated para noquear a la hormona luteinizante en el bagre de canal29. Sin embargo, una vez introducidos en la célula, plásmido construcciones deberá ser transcrito a RNA y traducido a proteínas funcionales antes de que puede apuntar la secuencia de ADN deseada, que probablemente retrasaría el momento de la mutagénesis en comparación con microinyección del ARN / proteína. Como el desarrollo de un embrión, mutagénesis tardía aumenta el mosaicism de fundadores inyectados. Además, la expresión transgénica es poco probable alcanzar el nivel de expresión posible con microinyección, bajando la eficiencia de mutagénesis.
Como un medio para introducir herramientas de edición del genoma en las células, microinyección tiene varias ventajas sobre electroporación. Moléculas de edición genómica puede introducirse confiablemente en células o embriones mediante microinyección30. Se necesita menos material de inyección. Es fácil determinar las cantidades de material inyectado. Mayor mutación tarifas con mosaicism bajo en los peces del fundador pueden ser alcanzado que mejoraría del germline transmisión de mutaciones a F1. Menos peces fundador deben ser analizados para producir la primera generación, debido a la mayor tasa de mutación. En electroporación, peces fundador deben analizarse que aumentarán los costos. Sin embargo, la supervivencia de los embriones microinyectados de bagre de canal es menor que electroporated que, aunque esto se puede solucionar mediante la inyección de más embriones31,32. En bagre de canal, la supervivencia de los embriones microinyectados yema osciló entre 16 y 55%, dependiendo de los genes blanco y la dosis de proteína de gRNA/Cas932.
Regular microinyección de embriones de bagre es técnicamente exigente y mucho tiempo, sin embargo, un rápido y eficaz protocolo de microinyección CRISPR/Cas9 proteína se presenta para embriones de bagre de canal. Este protocolo requiere menos tiempo y experiencia ya que la solución de proteína CRISPR/Cas9 se inyecta en la yema de uno de embriones de células. Cientos de huevos fecundados se pueden inyectar en 1 h (aproximadamente el tiempo necesario para que la primera división celular que se produzca). Para validar el protocolo, dos genes relacionados con la susceptibilidad de la enfermedad fueron eliminados en bagre de canal, toll/interleukin 1 gene del receptor del dominio-que contienen adaptador molécula (TICAM1) y el gene de lectinas (RBL) obligatorio de ramnosa. TICAM 1 participa en la vía de señalización iniciada por el receptor de tipo toll (TLR) 3. En bagre de canal, TICAM 1 fue significativamente upregulated después del desafío bacteriano con Edwardsiella ictaluri, mientras que fue regulada en bagre azul, una especie resistente E. ictaluri33. RBL desempeña un papel importante en la infección temprana con Flavobacterium columnare, el agente causativo de la enfermedad columnaris, donde aguda y robusta upregulation se registró en una cepa susceptible columnaris bagre de canal en comparación con un cepa resistente columnaris34.

<table><tbody><tr><td>Implante Reproboost</td><td>Centro de Biotecnología</td><td></td><td>Marina Análogo de la hormona liberadora de hormona luteinizante (LHRHa) para la inducción de la ovulación en hembras de bagre de canal</td></tr><tr><td>TRICAINE-S</td><td>Western Chemical. Inc.</td><td></td><td>Para la sedación de peces reproductores durante la inyección de hormonas y la extracción de huevos.</td></tr><tr><td>Rojo de fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290</td><td>0,5%, filtrado estéril</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Olympus 213709</td><td></td><td>Para la visualización de los óvulos durante la microinyección</td></tr><tr><td>Microinyector</td><td>ASI-Instrumentación científica aplicada&nbsp;</td><td>Modelo MPPI-3</td><td>Para la administración del material de inyección en los embriones</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>ASI-Instrumentación Científica Aplicada&nbsp;</td><td>Modelo MM33&nbsp;</td><td>Para sujetar y controlar el movimiento de la aguja de inyección.</td></tr><tr><td>Microcargador Eppendorf</td><td>Eppendorf</td><td>5242956.003</td><td>Para cargar solución inyectable en agujas de microinyección.</td></tr><tr><td>Extractor de agujas vertical</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modelo 720</td><td>Para tirar de agujas de microinyección Cas9</td></tr><tr><td>proteína PNA</td><td>Bio Inc.&nbsp;</td><td>CP01</td><td>Proteína Cas9 recombinante de Streptococcus pyrogenes.</td></tr><tr><td>Expandir el sistema de PCR PLUS de alta fidelidad</td><td>&nbsp; Roche Diagnostics, EE. UU.</td><td></td><td>Para PCR y amplificación de plantillas de ADN para su uso en la preparación de ARNg</td></tr><tr><td>Capilares de vidrio de borosilicato</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>1 mm de diámetro exterior (OD), para la fabricación de agujas de microinyección.</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>VWR</td><td>25384-302</td><td>Para sujetar los embriones durante la microinyección.</td></tr><tr><td>Crisco</td><td>The J.M. Smucker Company</td><td></td><td>Manteca vegetal para recubrir sartenes de desove y placas de Petri.</td></tr><tr><td>La solución de Holtfreter</td><td>hizo</td><td></td> en casa <td>59 mM de NaCl, 0,67 mM de KCl, 2,4 mM de NaHCO3, 0,76 mM de CaCl2, 1,67 mM de MgSO4 para incubar los embriones microinyectados hasta la eclosión.</td></tr><tr><td>Hiclato de doxiciclina USP (monohidrato)</td><td>Letco Medical</td><td>690904</td><td>Antibiótico añadido a la solución de Holtfreter a 10 ppm para prevenir infecciones bacterianas.</td></tr></tbody></table>

microinyección de la proteína crispr/cas9 en bagre de canal, ictalurus punctatus, embriones de gene editing

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

Se ha secuenciado el genoma completo del bagre de canal, Ictalurus punctatus, conduciendo a mayores oportunidades para estudiar la función genética de bagre de canal. Golpe de gracia del gene se ha utilizado para el estudio de estos genes funciones en vivo. El cluster regularmente otro proteínas cortas repeticiones palindrómico/CRISPR asociado 9 (CRISPR/Cas9) el sistema es una potente herramienta para editar secuencias genómicas de ADN para alterar la función génica. Mientras que el enfoque tradicional ha sido introducir CRISPR/Cas9 mRNA en los embriones de la célula a través de microinyección, esto puede ser un proceso lento e ineficiente en el bagre. Aquí, se describe un protocolo detallado para microinyección de embriones de bagre de canal con CRISPR/Cas9 proteína. Brevemente, óvulos y espermatozoides fueron recogida y luego artificial fertilización realizada. Los huevos fertilizados se transfirieron a una placa de Petri que contenga solución de Holtfreter. Volumen de inyección fue calibrado y luego guía RNAs/Cas9 dirigido a los toll/interleukin-1 dominio-que contienen adaptador (TICAM 1) de la molécula del gene del receptor y ramnosa Unión lectina (RBL) gene fueron microinyectados en la yema de los embriones de una célula. El golpe de gracia del gene era acertado como indels fueron confirmados por secuenciación del ADN. Las alteraciones de la secuencia de la proteína prevista debido a estas mutaciones incluyen mutágeno ' frameshift ' y truncarán de la proteína debido a codones de parada prematura.

Para demostrar la eficacia del Protocolo de microinyección, fueron microinyectados gRNAs diseñados para atacar el bagre de canal toll/interleukin-1 dominio-que contienen adaptador (TICAM1) de la molécula del gene del receptor y ramnosa Unión lectina (RBL) gene.
TICAM 1 Secuencia de la DNA de vectores de las colonias individuales de productos PCR combinados, clonados revelaron las mutaciones indel inducidas en...

Se presenta un protocolo de microinyección simple y eficiente para la edición de genes en embriones de bagre de canal usando el sistema CRISPR/Cas9. En este protocolo, guía RNAs y proteínas Cas9 fueron microinyectados en la yema de una célula de embriones. Este protocolo ha sido validada por la anulación de dos genes relacionados con la inmune de bagre de canal.

Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, Ictalurus punctatus, embriones de Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en embriones de bagre de canal, Ictalurus punctatos, para la edición génica. El desarrollo de un protocolo fiable y eficiente para la edición génica dirigida en el bagre de canal es crucial para el estudio de la genómica funcional. Especialmente después de que los recursos genómicos se hayan enriquecido con la secuenciación del genoma del bagre de canal.Aquí presentamos un protocolo detallado para la edición del genoma CRISPR/Cas9 en bagre de canal. Este protocolo se ha desarrollado y validado dirigiéndose a dos genes relacionados con el sistema inmunitario del bagre de canal. El dominio del receptor Toll/interleucina-1 que contiene la molécula adaptadora, o gen TICAM1, y el gen de la lectina de unión a la ramnosa o RBL.Todos los procedimientos se realizaron en la unidad de investigación de genética de peces del Centro de Investigación de Pesquerías de Conchas EW de la Universidad de Auburn en Alabama. Selección y desove de la población de cría. Elija un stock de cría de bagre de canal saludable de una cepa o línea genética que le gustaría editar.Los machos y hembras de bagre de canal deben exhibir buenas características sexuales secundarias. Seleccione hombres que tengan una cabeza ancha y musculosa que sea más ancha que el resto de su cuerpo con una papila genital bien desarrollada. El color oscuro y las heridas cicatrizantes de las luchas territoriales también son signos de preparación sexual.Seleccione hembras que tengan la cabeza más estrecha que el resto de su cuerpo y que tengan un abdomen suave, palpable y bien redondeado. Para mayor precisión y para evitar estresar a los peces durante el manejo inicial, deje de alimentar a las hembras dos o tres días antes de examinar su preparación para el desove. El manejo del pescado debe hacerse de manera rápida pero cuidadosa para reducir el estrés de manejo.Todos los procedimientos que requieran el manejo de las hembras deben realizarse mientras los peces se mantienen en bolsas de desove. Justo antes de la inyección de hormonas, obtenga el peso corporal de las hembras. Las bolsas de desove con hembras en su interior se pueden colgar en un tanque de flujo continuo con flujo de agua continuo y aireación adecuada.Cargue asépticamente el implantador que tiene una aguja de calibre 14 con 85 microgramos por kilogramo de análogo de la hormona liberadora de hormona luteinizante. LHRHA. Enjuague el lugar de la inyección y la musculatura dorsal con solución salina estéril al 0,9% antes de la inyección. Inserte el implante en un ángulo de 45 grados y suelte el implante.Retire la aguja y limpie el lugar de la inyección con un algodón previamente empapado en etanol al 70%. Coloque la bolsa de desove en el tanque de retención para que el pez esté completamente sumergido en el agua de 15 a 20 centímetros por debajo de la superficie del agua. Una aireación adecuada, que incluya cinco o más partes por millón de oxígeno disuelto, una buena calidad del agua son importantes para la ovulación de óvulos de alta calidad.Predice el tiempo de ovulación en función de la temperatura del agua utilizando la relación de grados hora. Por lo general, el primer control de los óvulos se realiza aproximadamente 36 horas después de la inyección de hormonas y luego a intervalos de cuatro horas. Para verificar la ovulación, levanta suavemente la bolsa de desove por encima de la superficie del agua mientras buscas los huevos que están unidos al interior de la bolsa.Cuando ves al menos 10 huevos, esta hembra está ovulando y lista para ser despojada a mano. Preparación de espermatozoides. Los espermatozoides se pueden preparar unas horas antes del tiempo esperado de ovulación.Los peces machos se sacrifican y los testículos se recogen en una pequeña bandeja de pesaje. Determina el peso de los testículos. Retire cualquier tejido y lave los testículos con una solución salina al 0,9% para eliminar la sangre si es necesario.Los testículos bien desarrollados son blancos con muchas proyecciones viliformes. Tritura los testículos y filtra los espermatozoides con una malla de 100 micras. Use una solución salina al 0,9% para lavar el esperma de la malla en un tubo de 50 mililitros.La solución salina se puede agregar hasta 10 mililitros por gramo de testículos. Determinar la concentración de los espermatozoides. Comprobar la motilidad y viabilidad.Sin embargo, para estos procedimientos esto no es necesario si los testículos están bien desarrollados. El esperma se puede almacenar a cuatro grados C y debe usarse dentro de las 24 horas posteriores a la preparación. Recolección de óvulos y fecundación.Aplique una capa muy delgada de manteca vegetal a una bandeja de desove seca limpia de 20 centímetros de diámetro. Coloque a la hembra en una solución anestésica que contenga 100 partes por millón de metanosulfonato de tricaína tamponado con bicarbonato de sodio hasta que el pez esté completamente anestesiado. Retire con cuidado el pez de la bolsa de desove y sumérjalo en solución salina al 0,9% para lavar el anestésico.Seque el pescado completamente con una toalla limpia evitando eliminar la capa de moco en la superficie del cuerpo del pez. Aplique manteca vegetal en el área alrededor de la cloaca, incluidas las aletas pélvicas, para presentar la fijación de los huevos durante el desmontaje manual. Pegue a mano los huevos en la bandeja de desove engrasada aplicando una presión suave sobre los ovarios.Los buenos huevos deben fluir libremente, ser de color amarillo dorado y tener grumos o coágulos de sangre mínimos o nulos. Evite el contacto entre los huevos y el agua antes de la fertilización, ya que el agua puede estimular el cierre del micrópilo. Para fertilizar los huevos para la microinyección, transfiéralos a 200-300 huevos a una bandeja de desove engrasada.Agregue uno o dos mililitros de la solución de esperma a los óvulos y mezcle suavemente. Agregue agua fresca a los óvulos para activar el esperma y los óvulos. Se debe agregar suficiente agua para cubrir ligeramente los huevos.Revuelve suavemente los huevos durante 30 segundos. La fertilización debe ocurrir en uno o dos minutos. Es importante fertilizar los huevos en una sola capa.Los huevos de bagre se adhieren entre sí, lo que dificulta la microinyección de múltiples capas de embriones. Agregue más agua fresca a los óvulos fertilizados y deje que los huevos se endurezcan durante 10 a 15 minutos. Los óvulos restantes sin fertilizar se pueden cubrir con una toalla húmeda para evitar que se sequen y se pueden fertilizar durante unas horas.La fecundación se puede realizar de forma escalonada. Un lote de dos a 300 óvulos puede ser fertilizado cada 30 a 60 minutos para asegurar el suministro continuo de embriones en la etapa de una célula para la microinyección y el control de embriones no inyectados. Extracción y carga de agujas.Tire de un capilar de vidrio de borosilicato de un milímetro de diámetro exterior en dos agujas. Guarde las agujas en una caja de papel con un trozo de esponja en la que se hayan hecho varias incisiones. Para evitar romper la aguja, el diámetro de la esponja debe ser menor que la longitud del tallo de la aguja.La punta de la aguja se puede abrir rompiendo un pequeño trozo de la aguja en la región más fina con un objeto afilado. Alternativamente, la aguja se puede abrir pellizcando la región más delgada de la punta con un par de pinzas bajo el microscopio. Prepare la solución inyectable mezclando ARN guía con proteína Cas9.El rojo fenol se puede agregar para colorear la mezcla de proteínas Cas9 de ARN guía, y el rojo fenol constituye hasta un tercio del volumen total. A continuación, la mezcla se incuba durante 10 minutos en hielo antes de su uso. Con un microcargador, cargue 5-10 microlitros de la mezcla de ARN guía Cas9 en la aguja de inyección.Insertando el microcargador en el vástago de la aguja y expulsando la mezcla lentamente mientras se retrae la punta del microcargador. Evite atrapar burbujas de aire en el interior. Coloque la aguja en el soporte de la micropipeta y asegúrese de que la conexión esté firme.Y luego conecte el soporte al micro manipulador. Garantizar la circulación libre y estable. Aplique presión para la microinyección abriendo el cilindro de nitrógeno y ajustando el regulador de presión.El volumen de la inyección puede verse afectado por la presión, el diámetro de la abertura de la aguja y la duración de la inyección. Para determinar el volumen que desea inyectar, inyecte en una gota de aceite mineral colocada en un hemocitómetro. Si es necesario, la presión y el diámetro de la aguja se pueden ajustar para aumentar o disminuir el volumen de la inyección.Inyecte varias veces en el aceite mineral para garantizar un volumen constante. Micro inyección de embriones de bagre. Aplique una capa muy fina de manteca vegetal en una placa de Petri limpia de 100 milímetros.Transfiera de 50 a 100 huevos de la bandeja de fertilización a la placa de Petri y cúbralos con la solución de Holtfreter. Los huevos deben estar alineados entre sí en una sola capa. Esta alineación debe mantener los óvulos en su lugar durante el proceso de microinyección.Coloque la placa de Petri con los huevos en la platina del microscopio y sujétela con una mano. Baja la aguja con la otra mano hasta que perfore el corion y la yema con un solo movimiento suave. La punta de la aguja debe estar lo más cerca posible del blastodisco antes de administrar el material de inyección.Pise el pedal y entregue el material de inyección en la yema. Si el blastodisco no es claramente visible, el material de inyección puede extenderse a diferentes lugares de la yema. Para ello, se inserta la aguja en el extremo más alejado de la yema.A continuación, pise el pedal y retire la aguja simultáneamente. Esto distribuye el material de inyección en diferentes lugares de la yema. 50 nanolitros que contienen 2,5 nanogramos de ARN guía y 7,5 nanogramos de proteína Cas9 se pueden inyectar en la yema sin ningún problema.Retraiga la aguja suavemente para no dañar el huevo. Luego mueva la placa de Petri para inyectar otro óvulo con el mismo procedimiento. Evite el movimiento de la placa de Petri durante el proceso de inyección, ya que esto puede dañar el óvulo o romper la aguja.Retire los óvulos que estén rotos o dañados debido a la micro inyección. La inyección puede iniciarse de 15 a 20 minutos después de la fertilización y continuar mientras los embriones aún estén en la etapa de una célula. Los embriones inyectados se colocan de nuevo en la solución de Holtfreter con 10 PPM de doxiciclina y aireación continua durante seis a siete días hasta la eclosión.La solución se cambia diariamente y se extraen los embriones muertos. Resultados. Esta figura muestra las mutaciones inducidas por CRISPR/Cas9 en el gen TICAM1 del bagre de canal. La secuencia azul representa el motivo adyacente del protoespaciador o PAM, mientras que la secuencia verde representa el objetivo del ARN guiado.Se esperaba que se produjera una rotura de doble cadena inducida por la proteína Cas9 en el sitio de los dos triángulos rojos. Las mutaciones de deleción se representan mediante una línea discontinua, en la que cada guión corresponde a un nucleótido que se ha eliminado. Las secuencias rojas son inserciones, mientras que las moradas representan la mutación de sustitución.Las fracciones de 78 representan el número de alelos mutados en 78 reacciones de secuenciación. Por ejemplo, 3/78 significa que se detectó un alelo en tres reacciones de secuenciación de un total de 78 reacciones. La tasa de mutación fue del 79,2% en 24 individuos analizados.Las mutaciones dieron lugar a la eliminación de demasiados aminoácidos de la proteína, lo que cambió el marco de lectura posterior y la terminación prematura de la traducción. En la mayoría de las mutaciones, más del 80% de la secuencia de proteínas predicha por TICAM1 se truncó debido a un codón de parada prematuro. Esta figura muestra las mutaciones inducidas por CRISPR/Cas9 en el gen RBL del bagre de canal.Las secuencias exónicas están en mayúsculas, mientras que las secuencias intrónicas están en minúsculas. Las secuencias azules representan el motivo adyacente del protoespaciador, mientras que la secuencia verde representa el objetivo del ARN guiado. Se esperaba que se produjera una rotura de doble cadena inducida por la proteína Cas9 en el sitio de los dos triángulos rojos.Las mutaciones de deleción se representan mediante una línea discontinua en la que cada guión corresponde a un nucleótido que se ha eliminado. Las secuencias rojas son inserciones. Las fracciones de 40 representan el número de alelos mutados en 40 reacciones de secuenciación.Por ejemplo, 2/40 significa que se detectó un alelo en dos reacciones de secuenciación de un total de 40 reacciones. La tasa de mutación fue del 87,5% en 40 individuos analizados. Las deleciones van desde cinco pares de bases hasta 183 pares de bases, mientras que se insertaron hasta 20 pares de bases.Más del 70% de los indels dieron lugar a una proteína truncada que era un 10% o menos que la longitud de la proteína de tipo salvaje. En este vídeo, demostramos cómo microinyectar la proteína CRISPR/Cas9 en embriones de bagre de un canal celular. Los procedimientos descritos son sencillos, rápidos y eficientes.Y logró con éxito la eliminación de genes en dos genes de bagre de canal. TICAM1 y RBL. Dependiendo de lo que se inyecte, el protocolo puede modificarse para incluir otras sustancias biológicamente activas.También se puede modificar para microinyectar otras especies de bagre u otras especies de peces que tengan una estructura y composición de huevos similares.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Manipulaciones transgénicas y la edición del genoma son críticos para probar funcionalmente las funciones de los genes y elementos cis-regulador. Aquí se presenta un protocolo de microinyección detallado para la generación de modificaciones genómicas (incluyendo construcciones mediadas por Tol2 fluorescentes transgén reportero, Talens, y CRISPRs) para el modelo emergente de pescado, el espinoso de tres espinas.

La microinyección de transgénesis y Genoma edición en tres espinas espinosos

Edición del genoma específica en el sistema modelo Danio rerio (pez cebra) ha sido facilitada enormemente por la aparición de enfoques CRISPR. Adjunto, describimos un protocolo robusto optimizado para la generación y la identificación de alelos derivados CRISPR absurdo que incorpora el análisis de movilidad del heterodúplex y la identificación de mutaciones mediante secuenciación de próxima generación.

Producción eficiente y genera identificación de CRISPR/Cas9 Gene Knockouts en el sistema modelo Danio rerio

Se describen métodos para la manipulación de genes en el sistema del modelo evolutivo Astyanax mexicanus. Se describen tres técnicas diferentes: transgénesis mediada de Tol2, manipulación dirigida del genoma utilizando CRISPR/Cas9 y caída de expresión usando morfolinos. Estas herramientas deben facilitar la investigación directa de los genes subyacentes a la variación entre las formas de la superficie y cavernas.

Manipulación de la función del Gene en mexicano Cavefish

Aquí se presenta un protocolo para la edición eficiente de genes mediados por ribonucleoproteína CRISPR/Cas9 en células de mamíferos mediante electroporación de tubos.

CRISPR/Cas9 Edición génica precisa mediada por Ribonucleoproteína por electroporación de tubo

Aquí, se presenta un protocolo para producir y traseros pescado eléctrico knockout genoma CRISPR/Cas9. En detalle se describen los requisitos requeridos de biología molecular, reproducción y cría para un gimnoiforme y un mormyrid, y técnicas de inyección para producir larvas Indel F0 inducidas por Cas9.

Silenciar la chispa: Edición del genoma CRISPR/Cas9 en peces débilmente eléctricos

Este protocolo describe procedimientos de microinyección para embriones de Culex quinquefasciatus que están optimizados para trabajar con herramientas de edición de genes CRISPR/Cas9. Esta técnica puede generar de manera eficiente mutaciones de la línea germinal heredables y específicas del sitio que se pueden usar para construir tecnologías genéticas en este vector de enfermedad poco estudiado.

Técnicas de microinyección embrionaria para una mutagénesis eficiente site-specific en Culex quinquefasciatus

El desarrollo temprano depende de los productos heredados por la madre, y el papel de muchos de estos productos es actualmente desconocido. En este documento, describimos un protocolo que utiliza CRISPR-Cas9 para identificar fenotipos de efecto materno en una sola generación.

Determinación del papel de los genes expresados por la madre en el desarrollo temprano con crispants maternos

Este protocolo describe un enfoque para facilitar ediciones precisas en embriones de pez cebra utilizando la tecnología CRISPR-Cas9. Se presenta una tubería de fenotipado para demostrar la aplicabilidad de estas técnicas para modelar una variante genética asociada al síndrome de QT largo.

Ediciones precisas mediadas por CRISPR-Cas9 en corazones de pez cebra

Aquí, describimos una técnica simple destinada a la generación eficiente de ratones genéticamente modificados llamada CRISPR RNP Electroporación de Cigotos (CRISPR-EZ). Este método proporciona reactivos de edición por electroporación en embriones con una eficiencia cercana al 100%. Este protocolo es efectivo para mutaciones puntuales, pequeñas inserciones genómicas y deleciones en embriones de mamíferos.

Edición eficiente del genoma de ratones mediante electroporación CRISPR de cigotos

Las tecnologías CRISPR-Cas han revolucionado el campo de la edición del genoma. Sin embargo, encontrar y aislar la edición de la línea germinal deseada sigue siendo un cuello de botella importante. Por lo tanto, este protocolo describe un método robusto para examinar rápidamente el esperma de pez cebra inyectado con CRISPR F0 para ediciones de la línea germinal utilizando técnicas estándar de PCR, digestión de restricción y electroforesis en gel.

Detección de espermatozoides para el aislamiento rápido de ediciones de la línea germinal en el pez cebra

Este protocolo presenta un enfoque optimizado para la producción de modelos de ratas modificadas genéticamente. El virus adenoasociado (AAV) se utiliza para administrar una plantilla de reparación de ADN, y la electroporación se utiliza para administrar reactivos CRISPR-Cas9 para completar el proceso de edición del genoma en un embrión de 2 células.

Edición del genoma CRISPR-Cas9 de embriones de rata mediante virus adenoasociados (AAV) y electroporación de embriones de 2 células

Aprende a realizar microinyección de CRISPR/Cas9 en embriones de bagre de canal Ictalurus punctatus para edición génica. Este protocolo validado permite estudiar genómica funcional en acuicultura.

Microinyección de la proteína CRISPR/Cas9 en bagre de canal, Ictalurus punctatus, embriones de Gene Editing

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