Evaluación de los efectos del sistema endocrino interrumpir compuestos en el desarrollo de la función de red neuronal vertebrados utilizando electrodos múltiples

El objetivo general de este protocolo experimental es probar los efectos de los compuestos disruptores endocrinos, como los bisfenoles, en la actividad de aumento de la red de las redes neuronales de vertebrados establecidas en matrices de electrodos múltiples. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en neurobiología del desarrollo y toxicología ambiental, como el mecanismo de acción de las toxinas ambientales en el desarrollo de la actividad de red en el cerebro embrionario. La principal ventaja de esta técnica es que ahora se pueden estudiar los efectos sobre los parámetros de la red neuronal, como la tasa media de disparo, el número total de picos y la amplitud de los picos, así como la sincronía.

Nuestro estudio anterior mostró que los EDC afectan la palabra y el comportamiento, que es una salida directa de las redes neuronales, y nuestro protocolo ahora tiene como objetivo comprender el efecto de los EDC en estas redes. El día de la colocación de las neuronas, retire un vial de matriz extracelular del congelador a 20 grados centígrados negativos, rocíe con etanol al 70% y colóquelo en hielo. Asegúrese de descongelar la matriz extracelular en hielo.

No descongele a temperatura ambiente, ya que el ECM polimeriza por encima de cero grados centígrados. Trabajar en la campana BSL2 para diluir la matriz extracelular al 25% añadiendo 300 microlitros de medio neurobasal frío a la alícuota de 100 microlitros. A continuación, utilice una pipeta P200 para añadir 100 microlitros de solución de matriz extracelular al 25% en el centro de la matriz de electrodos múltiples, teniendo cuidado de no tocar los electrodos.

Retire inmediatamente el ECM dejando una película delgada en la superficie. Cubra la matriz de electrodos múltiples y colóquela en la incubadora de cultivo de tejidos hasta que esté lista para colocar las neuronas en placas. Comience el aislamiento de las neuronas de pollo esterilizando la cáscara exterior de un huevo E7 con etanol al 70%.

Es importante mantener las condiciones estériles a partir de este momento. Asegúrese de que todos los instrumentos estén esterilizados con etanol al 70% y que las soluciones sean estériles. Es útil usar una campana de disección, pero no es absolutamente necesaria para las disecciones si se realiza rápidamente.

Luego, después de recuperar y decapitar el embrión, corte alrededor de los ojos y retire los globos oculares. A continuación, utilice unas pinzas finas de Dumont número cinco y unas tijeras de resorte para hacer una incisión en el lado ventral y eliminar las capas externas de la piel para exponer el prosencéfalo y el tectum óptico. Pelar y retirar la membrana de la cáscara con cuidado.

Transfiera el prosencéfalo a otra placa de Petri que contenga HBSS y córtelo en trozos pequeños de unos dos milímetros con unas tijeras de resorte. Utilice una pipeta de transferencia estéril para transferir las piezas del prosencéfalo a un tubo de centrífuga de 15 mililitros. Después de que los pedazos de prosencéfalo se hundan hasta el fondo del tubo de centrífuga, elimine la mayor cantidad posible de HBSS.

A continuación, agregue un mililitro de EDTA precalentado al 0,5% de tripsina e incube a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Utilice una pipeta Pasteur para eliminar con cuidado la tripsina sin alterar los trozos de tejido. Añade un mililitro de medio neurobasal y deja que los trozos de tejido se hundan hasta el fondo.

Después de retirar el medio y repetir el lavado, agregue dos mililitros de medio neurobasal y triture suavemente hasta que no se vean más trozos de tejido. Diluir las células resuspendidas de una a 10 con medio neurobasal. Cuente las células viables con un tinte azul de tripán y un hemocitómetro.

Después del recuento, coloque las células disociadas en matrices de electrodos múltiples recubiertas de ECM a una densidad de 2.200 células por milímetro cuadrado. Al día siguiente, agregue 10 micromolares de BPA en medio neurobasal a las matrices de electrodos múltiples tratadas. El día de la adquisición, reemplace el medio de cultivo con medio neurobasal fresco y devuelva las matrices a la incubadora de CO2 durante un mínimo de dos horas antes del registro.

Inicie el software de grabación y ajuste la temperatura de la guía de electrodos múltiples a 37 grados centígrados haciendo clic en el icono de temperatura. Establezca los parámetros de adquisición seleccionando flujos en el panel de la ventana izquierda y haciendo clic con el botón derecho en el icono de Muse. A continuación, seleccione añadir procesamiento y detector de picos y haga clic en Aceptar en la ventana emergente.

Spike detector six by STD aparecerá debajo del nombre del archivo. A continuación, haga clic con el botón derecho en el detector de picos, seleccione agregar procesamiento y detector de ráfagas y haga clic en Aceptar en la ventana emergente. El detector de ráfagas ISI aparecerá debajo del icono de la musa.

Luego, haga clic con el botón derecho en el detector de ráfagas, seleccione agregar compilador de procesamiento y estadísticas neuronales. En la ventana emergente, asegúrese de que el encabezado del archivo, las estadísticas de pozos agregados y la sincronía estén seleccionados, haga clic en Aceptar. El compilador de estadísticas aparecerá a continuación. Haga clic en el icono del reloj en la parte inferior de la pantalla y cambie la información en la sección de configuración para grabar cada 5,1 minutos y grabar durante cinco minutos.

Esto se iniciará inmediatamente y se ejecutará una vez. Después de recuperar la guía de electrodos múltiples de la incubadora, colóquela en la unidad de registro y asegúrela en su lugar. Comience a registrar la actividad de la red haciendo clic en iniciar grabación en la sección de grabación programada.

Por lo general, un tiempo de grabación de cinco minutos es suficiente, aunque se pueden obtener grabaciones más largas de hasta 10 minutos. Después del registro, devuelva la guía de electrodos múltiples a la incubadora. El número promedio de espigas es significativamente menor en los cultivos de prosencéfalo de pollitos E7 tratados con BPA en comparación con los cultivos de control.

El índice de sincronía promedio es significativamente más bajo en los cultivos de prosencéfalo de pollitos E7 tratados con BPA en comparación con los cultivos de control. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de tres horas si se hace correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener condiciones estériles en todo momento, incluso mientras se registra la actividad de la espiga.

Siguiendo este procedimiento, se puede evaluar el efecto de los fármacos potenciales, como los antiepilépticos y los antidepresivos, sobre la actividad de la red como un paso hacia la comprensión de su mecanismo de acción. Muchos EDC tienen efectos sutiles en el cerebro durante el desarrollo que se manifiestan como cambios en el comportamiento. El comportamiento es una salida directa de la actividad de red subyacente.

Nuestro protocolo tiene como objetivo diseccionar los efectos de estos compuestos en la actividad de la red.