Name: Dirigida a tioles de la cisteína para in Vitro específica glicosilación de proteínas recombinantes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 25 s
Description: Aprende a realizar glicosilación específica de proteínas recombinantes mediante mutagénesis dirigida a sitios de cisteína. Este método permite evaluar eficiencia y efectos estructurales de la glicosilación in vitro.

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Esta investigación fue apoyada por las ciencias naturales y Consejo de investigación de ingeniería de Canadá (05239 a P.B.S.), Fundación Canadiense para la investigación del fondo de innovación/Ontario (a P.B.S.), Fundación lucha contra el de próstata cáncer - Telus Ride para papá (P.B.S.) y Ontario Beca de postgrado (para Y.J.C. y N.S.).

Glycosylation de la proteína es una modificación post-translacional donde azúcares se unen covalentemente a polipéptidos principalmente a través de vínculos con las cadenas laterales del aminoácido. 50% de proteínas mamíferos son glicosiladas 54, donde las proteínas glicosiladas posteriormente pueden tener una amplia gama de efectos de alterar la afinidad biomolecular, que influyen en la proteína plegable, alterando la actividad del canal, dirigido a moléculas de degradación y tráfico, por nombrar...

Almacenar calcio operado (Ca2 +) (SOCE) es la vía principal por la que las células inmunes toman Ca2 + desde el espacio extracelular en el citosol. En los linfocitos T, receptores de células T localizados en la membrana plasmática (PM) unen los antígenos que activan proteínas quinasas de tirosina (revisadas en 1,2,3). Una cascada de fosforilación conduce a la activación de fosfolipasa-γ (PLCγ) que posteriormente interviene en la hidrólisis de la membrana fosfatidilinositol 4, 5-bifosfato (PIP2) en diacilglicerol e inositol 1,4,5-trifosfato (IP3 ). IP3 es un pequeño mensajero difusible que se une a la IP3 receptores (IP3R) en el retículo endoplásmico (ER) tal modo abriendo este canal del receptor y permitiendo Ca2 + fluyan abajo del gradiente de la concentración de la ER Lumen en el citosol (revisado en 4). Receptores acoplados a proteínas G y receptores de tirosina quinasa en una variedad de otros plomo de los tipos de células excitables y no excitables de señalización para la misma producción de IP3 y activación del IP3Rs.
Debido al finito Ca2 + capacidad de almacenamiento de la ER, la IP3-liberación mediada y el resultante aumento citosólico Ca2 + es sólo transitorio; sin embargo, este agotamiento del ER luminal Ca2 + efectos profundamente interacción stromal molecule-1 (STIM1), un tipo-yo transmembrana (TM) proteína que se encuentra sobre todo en el ER membrana 5,6,7. STIM1 contiene un lumen-orientado Ca2 + detección dominio formado por un par de EF-mano y estéril α-adorno (EFSAM). Tres dominios de en espiral-arrolle citosólica orientado se separan del EFSAM por el dominio TM (revisado en 8). Sobre ER luminal Ca2 + agotamiento, EFSAM sufre una Oligomerización de desestabilización junto 7,9 que causa los cambios estructurales de la TM y dominios coiled-coil 10. Estos cambios estructurales culminan en una captura de STIM1 en ER-PM las ensambladuras 11,12,13,14 a través de interacciones con PM fosfoinosítidos 15, 16 y Orai1 subunidades 17,18. Proteínas de Orai1 son las subunidades PM que montan en forma de Ca2 + canales21,de 19,20,22. Las interacciones STIM1 Orai1 en ER-PM ensambladuras facilitan una abierto Ca2 + desbloqueo activado Ca2 + (CRAC) canal conformación que permite el movimiento de Ca2 + en el citosol de las altas concentraciones de la espacio extracelular. En las células inmunes, el sostenido citosólica Ca2 + elevaciones vía CRAC inducen el Ca2 +- calmodulina/calcineurina dependiente desfosforilación del factor nuclear de células T activadas que posteriormente entra en el núcleo y comienza la regulación transcripcional de genes promoviendo la activación de células T 1,3. El proceso de activación de canal CRAC por STIM1 23,24 vía inducida por el agonista ER luminal Ca2 + agotamiento y la Ca2 + elevación citosólica sostenida resultante se denomina colectivamente SOCE 25. El papel vital de la SOCE en células de T es evidente por estudios que demuestran que las mutaciones heredables en STIM1 y Orai1 pueden causar inmunodeficiencia combinada severa síndromes 3,19,26, 27. EFSAM inicia SOCE después de detección luminal ER Ca2 + agotamiento de la vía la pérdida de Ca2 + coordinación de la mano de EF canónica, en última instancia conduciendo a la desestabilización junto autoasociación 7, 28,29.
Glicosilación es el accesorio covalente y procesamiento de estructuras de oligosacáridos, también conocido como glycans, a través de varios pasos biosintéticos en el ER y Golgi (revisado en 30,32,33). Hay dos tipos predominantes de glicosilación en eucariotas: N-ligados y O-ligado, según el aminoácido específico y el átomo tiende un puente sobre el acoplamiento. En la N- glicosilación, glicanos se unen a la amida de la cadena de lado de Asn, y en la mayoría de los casos, el paso de iniciación ocurre en el retículo endoplasmático como el polipéptido cadena se mueve en la luz 34. El primer paso de la N- glicosilación es la transferencia de una estructura de base 14-azúcar compuesta por glucosa (Glc), manosa (hombre) y N- acetilglucosamina (GlcNAc) (es decir, Glc3hombre9GlcNAc2) de una ER lípidos de membrana por un oligosaccharyltransferase 35,36. Otras medidas, como el escote o la transferencia de residuos de glucosa, son catalizadas en ER por glicosiltransferasas y glicosidasas específicas. Algunas proteínas que las ER y en el Golgi pueden ser otros procesados 37. O- glicosilación se refiere a la adición de glycans, generalmente para el grupo de hidroxilo de cadena lateral de residuos de Ser o Thr, y esta modificación ocurre enteramente en el complejo de Golgi 33,34. Hay varios O- glicanos las estructuras que pueden hacerse de N- acetilglucosamina fucosa, galactosa y ácido siálico con cada monosacárido añadido secuencialmente 33.
Mientras que ninguna secuencia específica se ha identificado como prerrequisito para muchos tipos de O- glicosilación, una secuencia consenso común se ha asociado con la N-ligado modificación: Asn-X-Ser/Thr/Cys, donde X puede ser cualquier aminoácido excepto Pro 33. EFSAM STIM1 contiene dos de estos sitios de consenso de N- glicosilación: Asn131-Trp132-Thr133 y Asn171-Thr172-Thr173. De hecho, estudios previos han demostrado que la EFSAM puede ser N- glicosilada en células de mamífero en Asn131 y Asn171 38,39,40,41. Sin embargo, estudios previos de las consecuencias de la N- glicosilación en SOCE han sido incongruentes, sugiriendo suprimido, potenciada o no efecto por esta modificación poste-de translación en SOCE activación 38,= "xref" > 39,40,41. Así, la investigación sobre las consecuencias biofísicas, bioquímicas y estructurales subyacentes de EFSAM N- glicosilación es vital para comprender los efectos regulatorios de esta modificación. Debido a la exigencia de altos niveles de proteínas homogéneas en estos experimentos en vitro , se aplicó un enfoque selectivo de sitio para unir covalentemente moléculas de glucosa a EFSAM. Curiosamente, glicosilación Asn131 y Asn171 había causado cambios estructurales que convergen dentro de la base EFSAM y mejoran las propiedades biofísicas que promueven la SOCE STIM1 mediada por 42.
La fijación química de glycosyl grupos al Cys tioles ha sido bien establecida por un trabajo que demostró por primera vez la utilidad de este enfoque de enzima libre para entender los efectos específicos del sitio de glicosilación en función de la proteína 43 , 44. más recientemente y con respecto a STIM1, los residuos Asn131 y Asn171 fueron transformados a Cys y glucose-5-(methanethiosulfonate) [glucose-5-(MTS)] fue utilizado a covalente enlace glucosa a los tioles libres 42. Aquí, describimos este enfoque que no sólo utiliza la mutagénesis para incorporar residuos de Cys específicos del sitio para la modificación, pero también se aplica la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) de solución para rápidamente evaluar eficacia de modificación y estructural perturbaciones como consecuencia de la glicosilación. En particular, esta metodología general es fácilmente adaptable para estudiar los efectos de cualquiera de los dos O- o N- glicosilación de cualquiera producido por vía recombinante proteína.

<table><tbody><tr><td>Phusion ADN polimerasa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td>Uso en el paso 1.3.</td></tr><tr><td>Generuler 1kb DNA Ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific FERSM1163</td><td></td><td>Uso en el paso 1.6.</td></tr><tr><td>Enzima de restricción DpnI</td><td>New England Biolabs, Inc.</td><td>R0176</td><td>Uso en el paso 1.8.</td></tr><tr><td>Kit de mini plásmido Presto</td><td>GeneAid, Inc.</td><td>PDH300</td><td>Uso en el paso 1.16.</td></tr><tr><td>BL21 DE3 codón (+) E. coli</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td>230280</td><td>Úselo en el paso 2.1.</td></tr><tr><td>DH5a E. coli</td><td>Invitrogen, Inc.</td><td>18265017</td><td>Úselo en el paso 1.9.</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa de 0,22 mm</td><td>Millipore, Inc.</td><td>SLGV033RS</td><td>Úselo en el paso 2.3.</td></tr><tr><td>HisPur Ni2+-NTA Resina de agarosa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>88221</td><td>Úselo en el paso 3.3.</td></tr><tr><td>Tubo de diálisis MWCO de 3.500 Da</td><td>BioDesign, Inc.</td><td>D306</td><td>Uso en los pasos 3.8, 3.16, 4.2, 4.5 y 4.6.</td></tr><tr><td>Trombina bovina</td><td>BioPharm Laboratories, Inc.</td><td>SKU91-055</td><td>Úselo en el paso 3.9.</td></tr><tr><td>5 mL HiTrap Q FF Columna de intercambio aniónico</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>17-5156-01</td><td>Úselo en el paso 3.11.</td></tr><tr><td>Glucosa-5-MTS</td><td>Toronto Research Chemicals, Inc.</td><td>G441000</td><td>Úselo en el paso 4.1.</td></tr><tr><td>Concentradores centrífugos de ultrafiltración Vivaspin 20</td><td>Sartorius, Inc.</td><td>VS2001</td><td>Uso en los pasos 3.11, 4.2, 4.5 y 4.6.</td></tr><tr><td>PageRuler Escalera de proteínas anchas sin teñir</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26630</td><td>Uso en los pasos 3.7, 3.10 y 3.15</td></tr><tr><td>HiTrap Q FF Columna de intercambio aniónico</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>17-5053-01</td><td>Úselo en el paso 3.12.</td></tr><tr><td>Sistema de cromatrografía líquida de proteína pura rápida AKTA</td><td>GE Healthcare, Inc.</td><td>29018224</td><td>Úselo en el paso 3.14.</td></tr><tr><td>Espectrómetro de RMN Varian Inova de 600 MHz</td><td>Agilent Technologies, Inc.</td><td></td><td>Úselo en los pasos 5.2 y 5.5.</td></tr></tbody></table>

dirigida a tioles de la cisteína para in vitro específica glicosilación de proteínas recombinantes

Targeting Cysteine Thiols for in Vitro Site-specific Glycosylation of Recombinant Proteins

Interacción stromal molecule-1 (STIM1) es un tipo-yo proteína transmembrana localizado en el retículo endoplásmico (ER) y membranas del plasma (PM). ER-residente STIM1 regula la actividad de PM Orai1 canales en un proceso conocido como tienda de entrada operado de calcio (Ca2 +) que es el principal Ca2 + proceso de señalización que conduce a la respuesta inmune. STIM1 se somete poste-de translación N- glicosilación en dos sitios de Asn luminales en el Ca2 + detección del dominio de la molécula. Sin embargo, los bioquímicos, biofísicos, y efectos biológicos de la estructura de N- glicosilada STIM1 fueron mal entendidos hasta recientemente debido a una incapacidad para obtener rápidamente altos niveles de homogénea N- glicosilada proteína. Aquí, describimos la implantación de un vitro química enfoque que une moléculas de glucosa a los sitios de proteína específica aplicables para entender los efectos subyacentes del N- glycosylation en mecanismo y estructura de la proteína. Usando la espectroscopia de resonancia magnética nuclear solución evaluamos tanto eficacia de la modificación, así como las consecuencias estructurales de la fijación de glucosa con una sola muestra. Este enfoque puede ser adaptado fácilmente para estudiar las proteínas glycosylated múltiples encontradas en la naturaleza.

El primer paso de este enfoque requiere la mutagénesis de los residuos de glicosilación de candidato a residuos de Cys, que pueden ser modificables mediante la EFSAM de glucosa-5-MTS. tiene ningunos residuos Cys endógenos, por lo que no hay consideraciones especiales deben hacerse antes del mutagénesis. Sin embargo, residuos Cys nativos deben ser transformados a residuos no modificables antes de realizar la química describe. Para mínimamente la estructura nativa, sugerimos realizar una al...

Análisis bioquímicos y estructurales de proteínas glicosiladas requieren cantidades relativamente grandes de muestras homogéneas. Aquí, presentamos un método químico eficiente para el glycosylation sitio-específico de proteínas recombinantes purificados de bacterias dirigiéndose a tioles reactivos de Cys.

Dirigida a tioles de la cisteína para in Vitro específica glicosilación de proteínas recombinantes

Stromal interaction molecule-1 (STIM1) is a type-I transmembrane protein located on the endoplasmic reticulum (ER) and plasma membranes (PM). ER-resident ...

El objetivo general de este procedimiento es incorporar residuos de cisteína en proteínas mediante mutagénesis dirigida al sitio en sitios glicosilados nativos y emplear enfoques de evaluación y fijación de glucosa in vitro para evaluar la eficiencia y los efectos estructurales de la glicosilación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología estructural, como por ejemplo, ¿cuáles son las consecuencias estructurales de la glicosilación de proteínas y cómo afectan estas modificaciones a los mecanismos subyacentes de la función? Las principales ventajas de esta técnica son que es fácilmente adaptable para estudiar o manejar la glicosilación.Es altamente eficiente y tanto las perturbaciones de la estructura como la eficiencia se pueden evaluar rápidamente. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el tratamiento de enfermedades, ya que los patrones alterados de glicosilación se han asociado con varios cánceres y trastornos neurodegenerativos. Aunque este método puede proporcionar información sobre los efectos de las proteínas glicosiladas nativas, también podría proporcionar información muy necesaria sobre cómo alterar los patrones de glicosilación que pueden contribuir a esta gama de enfermedades.Para introducir una sola mutación de cisteína en el vector de expresión, prepare dos tubos de reacción de PCR individuales. En el primer tubo, agregue el cebador mutagénico directo y en el segundo tubo, agregue el cebador mutagénico inverso. Agregue una concentración final de tampón PCR 1X a ambos tubos.A continuación, configure un programa de cinco ciclos para los dos tubos de reacción de PCR separados. Agregue un tiempo de extensión de siete minutos y medio a 72 grados centígrados al final del quinto ciclo. Una vez completados los cinco ciclos, mezcle las dos reacciones de PCR separadas en un solo tubo, centrifugue el tubo durante unos tres segundos y repita 20 ciclos adicionales siguiendo las mismas condiciones de PCR.A continuación, ejecute 15 microlitros de la muestra en un gel de agarosa al 1% de ADN a 120 voltios durante 40 minutos. A continuación, sumerja el gel en agua que contenga 0,5 miligramos por mililitro de bromuro de etidio y agítelo a temperatura ambiente durante 30 minutos. Luego, confirme la amplificación de la plantilla bajo luz ultravioleta a una longitud de onda de 302 nanómetros.Después de eso, agregue 0,5 microlitros de enzima de restricción DPN1 a los 25 microlitros restantes de la mezcla de reacción PCR. Incubar la mezcla durante dos horas y media a 37 grados centígrados para digerir el ADN molde metilado. Luego, agregue aproximadamente de cinco a 10 microlitros de la mezcla digerida a 100 microlitros de células de E. coli competentes para el choque térmico e incube en hielo durante 60 minutos.Luego, haga un choque térmico de la mezcla de célula y ADN a 42 grados centígrados durante 45 segundos en un bloque de calor seco. Luego, incube inmediatamente la mezcla en hielo durante tres minutos. A continuación, agregue 900 microlitros de caldo LB a las celdas y transfiera la suspensión a un tubo estéril de fondo redondo de 14 mililitros.Incubar a 37 grados centígrados con agitación constante a 190 rpm durante 90 minutos. A continuación, extienda el pellet de células centrifugadas en placas de agar suplementadas con antibióticos. Incubar las placas a 37 grados centígrados durante 16 horas.Al día siguiente, inocular asépticamente una sola colonia de la placa en cinco mililitros de medio LB suplementado con antibiótico. Luego, cultive el cultivo durante la noche a 37 grados centígrados con agitación constante. Transformar el plásmido mutado del residuo de cisteína en células de E. coli mediante un tratamiento de choque térmico, seguido de un cultivo durante la noche en un medio LB suplementado con antibióticos.Al día siguiente, esparce directamente 150 microlitros de suspensión celular en placas de agar LB suplementadas con kanamicina y mantén las placas para la incubación nocturna a 37 grados centígrados. Al día siguiente, transfiera asépticamente una sola colonia en medio LB de 20 mililitros en un matraz Erlenmeyer y déjelo incubar durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, transfiera el cultivo durante la noche a un tubo cónico de 50 mililitros.A continuación, granule las células centrifugando el cultivo líquido durante la noche a 2.400 veces G durante 15 minutos. A continuación, agregue 10 mililitros de medio mínimo M9 al pellet de celda y luego suspenda la mezcla celular en un litro de medio M9 que contenga kanamicina. Siga creciendo el cultivo líquido M9 a 37 grados Celsius con agitación constante a aproximadamente 190 rpm hasta que la densidad óptica a 600 nanómetros alcance aproximadamente 0.6 a 0.8.A continuación, añada 200 micromolares de IPTG al cultivo M9 para inducir la expresión de proteínas y deje que el cultivo crezca durante la noche. Al día siguiente, granule las células bacterianas del cultivo nocturno centrifugando a aproximadamente 10.000 veces G a cuatro grados centígrados durante 30 minutos. Utilizando una pipeta de transferencia motorizada de 10 mililitros, homogeneice el pellet de células bacterianas congeladas en aproximadamente 40 mililitros de tampón de homogeneización.Luego, incubar el homogeneizado en un horno de hibridación durante 90 minutos con rotación constante. Centrifugar la mezcla a aproximadamente 15.000 veces G a ocho grados centígrados durante 40 minutos para separar la fracción de proteína soluble del pellet insoluble. A continuación, añadir un 50% volumen por volumen de perlas de ácido nitrilotricacético de níquel y agarosa al sobrenadante e incubar por inversión en el horno de hibridación durante 90 minutos a temperatura ambiente.A continuación, utilice una columna de purificación de proteínas de flujo por gravedad para recoger las perlas de agarosa con proteína marcada con hexahistidina unida al níquel. Finalmente, lave las perlas de agarosa recolectadas tres veces. Eluir las proteínas en una serie de fracciones de dos mililitros.A continuación, confirme la proteína marcada con hexahistidina purificada en las fracciones eluidas mediante la aplicación de un gel SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie. Agrupar las fracciones de proteínas eluidas en una membrana de diálisis con un límite de peso molecular de 3.500 daltons e incubar en un tampón plegable a cuatro grados centígrados durante la noche con agitación magnética. A continuación, se añade aproximadamente una unidad de trombina por miligramo de proteína a la proteína agrupada en la membrana de diálisis y se vuelve a incubar durante un día a cuatro grados centígrados.Al día siguiente, retire la proteína de la bolsa de diálisis y concéntrela aproximadamente diez veces utilizando un concentrador centrífugo de ultrafiltración con un límite de peso molecular de 10.000 daltons. Posteriormente, vuelva a diluir el concentrado de proteína aproximadamente 20 veces en tampón repliegue sin cloruro de sodio. Para purificar la proteína, cárguela en una columna de intercambio aniónico preempaquetada equilibrada con el mismo tampón libre de cloruro de sodio.Comience a eluir las proteínas en un gradiente de cero a 60% de un molar de cloruro de sodio que contiene tampón de repliegue. Transfiera las fracciones de proteína agrupadas a una bolsa de diálisis. Realice una etapa de diálisis a cuatro grados centígrados durante la noche para intercambiar la proteína en el tampón de repliegue experimental con la concentración molar óptima de cloruro de sodio.En primer lugar, dialice 1,5 mililitros de aproximadamente 60 micromolares de proteína en un litro de tampón de modificación para la glicosilación de la proteína. Después de 24 horas, a cuatro grados centígrados, transfiera la proteína modificada a un tubo de microcentrífuga y agregue glucosa-5-MTS solubilizada con DMSO hasta una concentración final de dos milimolares. Golpee suavemente el tubo de microcentrífuga cada 10 minutos mientras incuba la muestra en la oscuridad durante una hora a temperatura ambiente.Después de la incubación, realice la diálisis a cuatro grados centígrados para volver a intercambiar la proteína en el tampón experimental final. Mida la masa precisa de la proteína mediante espectrometría de masas de ionización por electrospray. Finalmente, use la RMN en solución para calcular la eficiencia de modificación e identificar los cambios estructurales de los residuos de cistis glicosilados en la proteína.En este gel representativo de agarosa al 1% de ADN se muestra un ADN molde amplificado por PCR mutacional exitoso. La escalera de ADN y una cantidad equivalente de ADN molde que no ha sido amplificado por PCR se utilizan como controles en el gel. La banda superior con tinción de bromuro de etidio de alta intensidad muestra la plantilla amplificada del tamaño deseado.A continuación, la proteína se purificó utilizando una columna de intercambio aniónico. El cromatograma muestra un perfil de elución observado a 280 nanómetros en azul, exhibiendo tres picos de elución contra un gradiente de cloruro de sodio indicado en rojo con concentración creciente hasta 0.6 molar. El panel inferior muestra un gel SDS-PAGE teñido de azul de Coomassie de las fracciones proteicas.La glicosilación de los residuos de cisteína se determinó mediante espectrometría de masas de ionización por electrospray. El cromatograma muestra las masas de la proteína modificada y no modificada antes y después de la glicosilación del residuo de cisteína. Para confirmación, se realizó una RMN en solución que muestra la superposición espectral HSQC de los cambios químicos de amida específicos del residuo, lo que indica tanto modificaciones como perturbaciones estructurales de la proteína glicosilada.Cuando se domina, todas las etapas, desde la mutagénesis hasta la evaluación de RMN, se pueden completar en aproximadamente 12 días, excluyendo el tiempo de espera para los servicios de síntesis de cebadores, secuenciación de ADN y espectroscopia de masas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar evaluar los efectos estructurales y biofísicos de las mutaciones de cisteína en ausencia de la modificación del tiol como medidas de control de referencia. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la estabilidad, la estructura secundaria, la unión iónica y las evaluaciones de la interacción proteína-proteína, para revelar cómo las propiedades biofísicas de las funciones proteicas subyacentes se ven afectadas por la glicosilación.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la señalización del calcio evaluaran individual y acumulativamente el papel de la asparagina 131 y la asparagina 171 y la glicosilación en la señalización del calcio de la molécula de interacción estromal asociada con la entrada de calcio operada por el almacén.

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