Asignación de genoma cromatina accesible en linfocitos T humanos primarios por ATAC-Seq

Ensayo para cromatina transposasa accesible junto con secuenciación de alto rendimiento (ATAC-seq) es un método de genoma cromatina accesible de descubrir. Se trata de un protocolo de ATAC-seq paso a paso, desde el molecular al final análisis computacional, optimizado para los linfocitos humanos (Th1/Th2). Este protocolo puede ser adoptada por los investigadores sin experiencia previa en métodos de secuenciación de próxima generación.

El objetivo general de este método de alto rendimiento que utiliza la transposasa es identificar regiones de cromatina accesibles en el genoma humano. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la epigenómica, como la ubicación de los elementos reguladores en todo el genoma. Las principales ventajas de esta técnica son que es robusta, relativamente corta y requiere menos material de partida en comparación con otros métodos de medición de la accesibilidad de la cromatina, como DNase-seq o FAIRE-seq.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el panorama regulatorio de los linfocitos T humanos, también se puede aplicar a otros sistemas, como otras células primarias humanas, células cancerosas, muestras clínicas humanas, células de otros mamíferos y organismos. Descongele una alícuota de un mililitro de 10 millones de PBMC humanos y transfiérala a un tubo de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de medio RPMI suplementado. Ellos, centrifugan las células a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 15 mililitros de medio RPMI suplementado. Luego, transfiera las células a un matraz de cultivo T-75 e incube durante la noche con humidificación. Al día siguiente, transfiera las células flotantes con una pipeta estéril de 25 mililitros a un tubo de 50 mililitros.

A continuación, cuente las células vivas utilizando la exclusión de azul de tripano. A continuación, aísle las células CD4 positivas de 10 millones de PBMC vivas no adherentes utilizando una columna de separación de microperlas. Una vez que las células estén aisladas, placa y active las células T en condiciones de polarización Th1 y Th2 de acuerdo con el protocolo de texto y, a continuación, aísle sus núcleos.

Para ser, prepare un tampón de lisis fresco y manténgalo enfriado en hielo. Además, en preparación para la reacción de transposición, caliente un agitador térmico a 37 grados centígrados. A continuación, cargue medio millón de células T en microtubos de 1,5 mililitros y hágalos girar a 500 G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

A continuación, lave las células con un mililitro de PBS frío y repita el ciclo de centrifugado, pero ahora suspenda las células en un mililitro de tampón de lisis fría. Mezcle las células con un pipeteo suave para evitar que los núcleos se interrumpan demasiado. Luego, tome rápidamente alícuotas de 10 microlitros para observar la fracción de lisis de las células.

Asegúrese de mantener las celdas frías y trabajar rápidamente. En un plazo de cinco minutos, proceda con la reacción de transposición. Para empezar, transfiera 100.000 núcleos a un microtubo de 1,5 mililitros y centrifuga la muestra a 500 Gs durante 10 minutos en una centrífuga fría.

Luego, retire suavemente el sobrenadante. A continuación, agregue los componentes de la reacción de transposición a los núcleos. A continuación, vuelva a suspender los núcleos con un pipeteo suave e incube los núcleos en el agitador térmico a 500 RMP durante 30 minutos para completar la reacción de transposición.

A continuación, realice un paso de limpieza de ADN y eluya los fragmentos de ADN en 20 microlitros de clorhidrato de Tris. A continuación, utilice una PCR para realizar una amplificación inicial de las bibliotecas de secuenciación ATAC. A continuación, evalúe el número óptimo de ciclos adicionales necesarios para la amplificación final mediante PCR cuantitativa.

A partir de los resultados medidos, determine el número de ciclos necesarios para la amplificación final de PCR de las bibliotecas de secuenciación ATAC. A continuación, realiza la amplificación final. La configuración de un tamaño óptimo de los fragmentos de la biblioteca de ADN puede mejorar la secuenciación de próxima generación.

Primero, caliente las perlas magnéticas a temperatura ambiente y prepare etanol fresco al 70% en agua libre de nucleasas. A continuación, añada agua sin nucleasas a las bibliotecas de secuenciación ATAC hasta un volumen de 100 microlitros. A continuación, añade 50 microlitros de perlas magnéticas de unión al ADN resuspendidas.

Pipetea las perlas en el ADN al menos 10 veces y espera cinco minutos. Si alguna gota de perlas se queda atascada en la pared o la tapa del tubo, gire brevemente el tubo. Ahora, coloque la muestra junto al imán durante dos minutos y luego transfiera el sobrenadante a un nuevo microtubo.

Mida el volumen de la colección y agregue un 70% de volumen de suspensión de cuentas magnéticas. Mezcle las cuentas como antes y déjelas incubar durante cinco minutos antes de continuar. Luego, separe las cuentas con el imán durante dos minutos y ahora deseche el sobrenadante.

Mientras aún está contra el imán, agregue 200 microlitros de etanol al 70% a las perlas. Espere 30 segundos, luego deseche el etanol y repita el lavado con etanol una vez más. Termine los lavados eliminando completamente el etanol restante y dejando que las perlas se sequen al aire durante cinco minutos en el imán.

Si es necesario, centrifugue brevemente el tubo y aspire el etanol visible con una pipeta de 10 microlitros. Ahora, retire el tubo del imán y agregue 22 microlitros de clorhidrato de Tris. Después de dos minutos, regrese el tubo al soporte magnético y deje que la solución se aclare.

Luego, recoja 20 microlitros de eluido que contenga la biblioteca preparada y guárdela a menos 20 grados centígrados. Este protocolo produce bibliotecas de secuenciación ATAC que suelen ser de tres a 20 nanogramos por microlitro. Cuando se ejecutan en un sistema para el análisis de la integridad del ADN, tienen una apariencia similar a una escalera.

Entre otros, otro control de calidad importante es el enriquecimiento de los controles positivos. En relación con los controles negativos, el par de cebadores tres debe enriquecerse al menos 25 veces, y el par de cebadores cuatro debe enriquecerse al menos 75 veces. Después de 10 millones de lecturas iniciales, si la muestra pasa todos los parámetros cruciales en el archivo de informe de FastQC y se obtienen de 1.000 a 2.000 picos a partir de la llamada máxima, la biblioteca se puede secuenciar más profundamente para más de 30 millones de lecturas.

De las bibliotecas que cumplen con los estándares de calidad, solo entre el 6 y el 20% de las lecturas corresponden al genoma mitocondrial. El resto de las lecturas únicas corresponden al genoma humano de referencia y entre el 7 y el 12% se encuentran dentro de los picos de secuenciación ATAC. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo hacer bibliotecas ATAC-seq, enviar y proporcionar secuenciación de raciones y analizar los datos obtenidos.

Una vez dominado, la preparación de la biblioteca ATAC-seq se puede realizar en uno o dos días hábiles. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que es posible que primero deba optimizar algunos pasos, como el número de células y la composición del tampón de lisis en un paso de aislamiento de núcleos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la inmunoprecipitación de cromatina para responder preguntas adicionales como ¿qué factor de transcripción se une a las regiones abiertas de cromatina en las muestras examinadas?