Detección del potencial de membrana de las mitocondrias CLIC4 HN4 inducida por la caída de la célula Apoptosis In Vitro

Este método puede ayudar a responder las preguntas clave en el campo citobiológico, incluida la comprensión de la apoptosis y la disfunción mitocondrial. La principal ventaja de esta técnica es que los investigadores pueden realizar de manera fácil y adecuada el monitoreo en tiempo real del potencial de membrana de las mitocondrias a través de la rodamina-123 dentro de una sola célula. Cultivo de una línea celular HN4 a partir de carcinoma escamoso de células de cabeza y cuello, tal como se describe en el protocolo de texto.

Un día antes de la transfección, coloque 0,5 millones de células en dos mililitros por pocillo de medio de cultivo sin antibióticos en placas de seis pocillos. Diluya suavemente 100 picomoles de ARN interferente pequeño CLIC4 o ARN interferente pequeño revuelto en 250 microlitros de medio sérico reducido. A continuación, diluir cinco microlitros de reactivo liposomático en 250 microlitros de suero reducido e incubar durante cinco minutos.

Combine el ARN interferente pequeño diluido con el reactivo de liposoma diluido y mezcle suavemente. Agregue la mezcla a cada pocillo que contenga células en medio. Mezcle suavemente balanceando el plato hacia adelante y hacia atrás.

Incubar las células a 37 grados centígrados en una incubadora de CO2. Reemplace el medio con medio de crecimiento normal cuatro horas después de la transfección. Continúe incubando las células durante 20 horas adicionales antes de continuar con el procedimiento de etiquetado de rodamina-123.

Después del tratamiento con ARN interferente pequeño CLIC4 de células HN4 en placas de seis pocillos, use pinzas para colocar cubreobjetos circulares en la parte inferior de las nuevas placas de 12 pocillos. Pipetear 150 microlitros de polilisina de 100 microgramos por mililitro en el centro de cada cubreobjetos dentro de las placas de 12 pocillos. Después de dos minutos, retire completamente la polilisina con una pipeta.

A continuación, retire el medio de cultivo de las células HN4 dentro de la placa y agregue un mililitro de tripsina al 0,25% para separar las células. Pasados los seis minutos, añadir dos mililitros de medio de cultivo para neutralizar la tripsina. Mezcle suavemente las células HN4 con una pipeta cinco veces y siembre las células en cubreobjetos circulares.

Coloque las células en una incubadora a 37 grados centígrados con 5% de CO2. Después de ocho horas de incubación, agregue dos micromoles por litro de rodamina-123 y mezcle suavemente el medio hacia arriba y hacia abajo varias veces para asegurar una distribución uniforme en el medio. Incubar las células HN4 durante 40 minutos a 37 grados centígrados.

Use pinzas para quitar los cubreobjetos y transfiéralos brevemente al tampón NPSS precalentado para lavar el líquido restante. Coloque los cubreobjetos en la parte inferior de la cámara de acero inoxidable de 500 microlitros con un fondo de cubreobjetos de vidrio reemplazable de 25 milímetros sellado en su lugar por una junta tórica. Fije los cubreobjetos en su lugar apretando la tapa de la cámara.

Agregue 450 microlitros de tampón NPSS precalentado a la cámara ensamblada. A continuación, coloque el baño bajo el campo visual del microscopio de fluorescencia o del microscopio de fluorescencia de barrido láser confocal. Encienda el microscopio de fluorescencia siguiendo las instrucciones del fabricante.

Abra el software del sistema de imágenes y seleccione el botón nuevo de la barra de comandos para comenzar un nuevo experimento. Ajuste el campo visual y el enfoque para encontrar la ubicación de las celdas en la luz blanca. Luego apague la luz y presione el botón para cerrar la luz blanca.

Haga clic en el botón de enfoque de la barra de comandos y seleccione comenzar a enfocar para activar la fluorescencia. Encuentre la ubicación de las células nuevamente a través del microscopio con una excitación de 507 nanómetros y una longitud de onda de emisión de paso largo de 529 nanómetros. Ajusta el campo visual y vuelve a enfocar si es necesario.

Seleccione un campo visual que contenga solo de 20 a 30 celdas HN4 separadas. Una vez que se logre un campo visual claro, haga clic en cerrar el enfoque desde la barra de enfoque. A continuación, haga clic en adquirir una en la barra de comandos para adquirir un conjunto de imágenes.

A continuación, haga clic en regiones de la barra de comandos y haga clic en el botón Aceptar para editar las regiones de medición. Para adaptarse a diferentes formas de celdas individuales, seleccione la herramienta Región de trazado. Encierre un círculo en la región de una sola celda y haga doble clic cuando termine.

Repita el procedimiento hasta que todas las celdas estén rodeadas por un círculo. Haga clic en Listo y seleccione Guardar imágenes para encontrar la ubicación guardada. Haga clic en el reloj cero y presione rápidamente F4 para comenzar a monitorear el cambio de intensidad de fluorescencia.

Registre el cambio en tiempo real de la intensidad de la fluorescencia una vez cada cinco segundos durante cinco minutos. Cuando la línea de base se estabilice, agregue 50 microlitros de NPSS mezclados con 0,5 microlitros de 100 milimoles por litro de ATP a la cámara mediante pipeta. Encienda el microscopio de fluorescencia de barrido láser confocal siguiendo las instrucciones del fabricante y abra el software incluido.

Haga clic en el objetivo en el menú de adquisición para seleccionar la lente del objetivo de aceite de apertura numérica 63X 1.4. Observe el espécimen y encuentre un campo visual claro bajo el campo de luz. Presione el botón de selección de luz para cambiar al modo de fluorescencia y seleccione los filtros de fluorescencia correctos para encontrar la ubicación de la célula en la oscuridad a través del microscopio.

Empuje el obturador para proteger el espécimen cuando finalice la observación. En el menú de adquisición, ajuste el canal PMT adecuado y haga clic en lograr para activar la ruta óptica establecida. Haga clic en el menú de configuración y elija láser para determinar el tipo de láser requerido.

Haga clic en vivo para obtener imágenes en tiempo real y asegúrese de que el campo visual contenga solo de 20 a 30 celdas HN4 separadas. A continuación, seleccione XYT en el modo de adquisición en el submenú de adquisición en el menú de adquisición. Establezca cinco segundos para el intervalo de tiempo y 20 minutos para la duración.

Haga clic en Aplicar cuando se hayan liquidado todos los parámetros. En el menú cuantificar, utilice la herramienta dibujar polilínea para rodear el área de grabación de cada celda. Seleccione el perfil de línea y elija comenzar a realizar la observación.

Registre el cambio en tiempo real de la intensidad de la fluorescencia durante cinco minutos. Cuando la línea de base se estabilice, agregue 50 microlitros de NPSS mezclados con 0,5 microlitros de 100 milimoles por litro de ATP a la cámara a través de una pipeta. Para realizar análisis estadísticos con un microscopio de fluorescencia común, abra el software del sistema de imágenes y seleccione el botón Abrir en la barra de comandos para abrir un experimento guardado.

Haga clic en regiones de la barra de comandos y haga clic en el botón Aceptar para editar las regiones de medición. Seleccione la herramienta de región de trazado. Encierre en un círculo la región de una sola celda y haga doble clic cuando haya terminado.

Repita el procedimiento hasta que todas las celdas hayan sido rodeadas por un círculo. Haga clic en Listo y seleccione el botón de avance F4 para obtener una traza que muestre la intensidad de fluorescencia. Una vez que haya terminado, haga clic en el botón de flecha hacia abajo ubicado en la esquina inferior derecha del gráfico y haga clic en mostrar datos del gráfico.

Haga clic en Aceptar dos veces y elija el botón de registro de datos para abrir la interfaz del software de procesamiento de datos. A continuación, vuelva a hacer clic en registrar datos para encontrar los registros de fluctuación en tiempo real de la intensidad de fluorescencia que aparecen en la hoja de cálculo. Aquí se muestran resultados representativos que muestran cambios en la despolarización mitocondrial inducidos por ATP en la célula HN4 bajo diferentes intervenciones, resueltos por microscopía de fluorescencia común.

La despolarización de la membrana mitocondrial aumentó rápidamente después del tratamiento con ATP y se recuperó gradualmente al nivel normal en ambos grupos. Trazas representativas de intensidad fluorescente de rodamina-123 demuestran que el tratamiento con MMP del ARN interferente pequeño CLIC4 mejoró la despolarización mitocondrial en comparación con el grupo de control. Un histograma representativo reveló además que la desactivación de CLIC4 mejoró la despolarización mitocondrial en comparación con el grupo de control.

Aquí, los resultados representativos de la microscopía de escaneo láser confocal también muestran cambios inducidos por ATP en la despolarización mitocondrial en la célula HN4 bajo diferentes intervenciones. La despolarización de la membrana mitocondrial aumenta rápidamente después del tratamiento con ATP y se recupera gradualmente a un nivel normal en ambos grupos. Trazas representativas de la intensidad fluorescente de rodamina-123 demuestran que el tratamiento con MMP del ARN interferente pequeño CLIC4 mejoró la despolarización mitocondrial en comparación con el grupo de control.

De manera similar, el histograma representativo reveló además que la eliminación de CLIC4 mejoró la despolarización mitocondrial en comparación con el grupo de control. Después de ver este video, tendrá una mejor comprensión de cómo usar la rodamina-123 para realizar un monitoreo en tiempo real del potencial de la membrana mitocondrial tanto mediante microscopía de fluorescencia normal como microscopía de barrido láser confocal. Una vez dominada, esta técnica de microscopía con rodamina-123 se puede realizar en menos de 20 minutos para una muestra si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no debe entrar en contacto con la cámara mientras se inyecta a la espera del proceso de exploración. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la Western Blot y la citometría de flujo para responder a otras preguntas, como si se produjo apoptosis o necrosis. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ciencia en vivo exploraran la disfunción mitocondrial y encontraran evidencia sólida de la apoptosis celular en varias células vivas.

No olvide que trabajar con rodamina-123 puede ser extremadamente peligroso y siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes y mascarillas mientras se realiza este procedimiento.