Immunostaining para modificaciones de ADN: análisis computacional de imágenes confocales
7 de septiembre de 2017
Recién descubierto formas oxidadas de la 5-METILCITOSINA (oxi-mCs), 5-hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (fC 5) y 5-carboxylcytosine (5caC) puede representar distintas modificaciones de ADN con papeles funcionales únicas. Aquí se describe un flujo de trabajo semi cuantitativa para la visualización de la distribución espacial de la oxi-mCs, perfiles de intensidad de señal y colocalización.
El objetivo general de esta técnica es proporcionar una herramienta computacional para evaluar la distribución espacial y la intensidad de la señal de las modificaciones del ADN, visualizadas mediante inmunotinción dentro de los núcleos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la epigenética, permitiendo el examen de la localización nuclear y los niveles relativos de las modificaciones del ADN en diferentes sistemas modelo. La principal ventaja de esta técnica es que las modificaciones del ADN se miden por la magnitud de la señal y luego la distribución.
Una de las implicaciones de esta técnica es que facilita nuestra comprensión de las posibles filas funcionales de modificaciones del ADN en varios sistemas biológicos. Esta técnica también tiene la aplicación añadida del análisis computacional de otros epítopos detectables por inmunohistoquímica. Para comenzar, abra los archivos con formato LSM de la imagen de microscopía confocal.
Seleccione el procesamiento de imágenes y, a continuación, elija la imagen deseada para el análisis. Tenga en cuenta que al comparar perfiles de intensidad entre muestras, la potencia y la ganancia del láser deben ser consistentes para realizar comparaciones directas. A continuación, haga clic en mostrar todo, para que todos los controles gráficos sean visibles, luego seleccione la pestaña de gráficos y elija la herramienta rectángulo para seleccionar una región que contenga los núcleos de interés.
A continuación, utilice el comando cortar región para aislar la región de interés. Ahora guarde la imagen con un nuevo nombre y un formato LSM o CZI y vuelva a abrir el archivo en el software Zen Blue. Abra el escritorio ZEN en Zen Blue y, a continuación, utilice el comando enviar a ZEN en Zen Black para abrir el archivo en Zen Blue.
A continuación, active la pestaña etiquetada como 2.5d para habilitar la visualización de la imagen en 2.5d. Haga clic en Mostrar todo para que todos los controles gráficos sean visibles y modifique la configuración con las cuatro barras grises. Las barras controlan el zoom, la rotación, la inclinación del eje y la expansión y contracción de las barras de escala.
Seleccione el modo de renderizado para visualizar mejor los picos individuales y, a continuación, modifique la gran distancia cambiando el porcentaje. Cuanto menor sea el porcentaje, más definido estará cada pico individual. Ahora, antes de guardar la imagen 2.5d, oculte la lista de archivos y las herramientas gráficas haciendo clic en la flecha gris debajo del gráfico 2.5d.
A continuación, guarde el gráfico como una captura de pantalla utilizando la tecla de impresión de pantalla del teclado. Abra la opción de procesamiento de imágenes en el software y abra el archivo de interés. A continuación, seleccione la pestaña de perfil y seleccione la pestaña mostrar todo para acceder a todas las opciones de formato.
En la pestaña de perfil, elija la opción de tabla y el botón de flecha. Ahora use el mouse para seleccionar un punto de inicio y dibujar una línea sobre un número continuo de celdas, luego se genera un gráfico de intensidad para las celdas a lo largo de esta línea junto con la tabla de mediciones de intensidad. Tenga en cuenta que la tabla también proporciona la distancia a la que la intensidad de los píxeles es roja para la fluorescencia roja, verde y azul.
La unidad es de micras. Para exportar estos datos, haga clic con el botón derecho en la tabla, seleccione guardar tabla y guárdela como un archivo de texto. Para guardar el perfil de intensidad, elija la opción de exportación, en la ventana emergente, alterne dos opciones, archivo de imagen etiquetado, formato y contenido de la ventana de imagen, panel único, datos.
A continuación, siga las instrucciones para guardar el archivo. Ahora repita este proceso para cada perfil de intensidad necesario. En el software, seleccione procesamiento de imágenes y elija el archivo de imagen que le interese.
A continuación, seleccione la pestaña etiquetada coloc para el análisis de colocalización y seleccione mostrar todo para acceder a todas las opciones de formato. En las cuatro pestañas de la mitad inferior de la pantalla, elija la colocalización y elija las opciones de tabla e imagen. A continuación, elija el tercer icono en la parte superior de la pestaña, identificado por el texto emergente, cerrado besier.
Utilice esta herramienta para rodear un solo núcleo. A continuación, los valores aparecerán en la tabla y se producirá un diagrama de dispersión para la fluorescencia roja frente a la verde. El eje de esta parcela es móvil y controla la compuerta de detección.
Todas las intensidades de píxeles dentro del núcleo deben considerarse señales positivas. Como los niveles de modificaciones del ADN varían a través del núcleo, para tener en cuenta las señales débiles, no bloqueamos los datos. Debemos enfatizar aquí que es discutible si los valores de fondo deben incluirse en el análisis.
Es importante destacar que el coeficiente de superposición es independiente de las diferencias en las intensidades de la señal entre los dos canales. Mientras que el coeficiente de correlación de personas supone una relación lineal entre las señales. Ahora repita este proceso de rodear núcleos para completar el conjunto de datos.
Luego, para exportar los datos, haga clic derecho en la tabla y siga las opciones para guardar los datos. Para guardar una imagen de colocalización, utilice el comando de exportación con las dos opciones, archivo de imagen etiquetado, formato y contenido de la ventana de imagen panel único, datos, y luego siga las opciones para guardar el archivo. Se examinó la distribución espacial de dos derivados oxidados de cinco metil citosina en la diferenciación de progenitores haphádicos, utilizando el protocolo descrito.
Las señales rojas y verdes representan las dos modificaciones distintas del ADN. Las señales están bien definidas con una superposición limitada. De acuerdo con las expectativas, los perfiles de las dos intensidades de señal y la celda correspondiente no coinciden fuertemente entre sí.
El patrón distintivo sugiere que la oxidación dependiente de grifo de cinco metil citosina puede generar diferentes derivados oxidados en regiones específicas de la cromatina. Se realizó una comparación similar de las dos modificaciones del ADN en las células de meduloblastoma Daoy y en las células de ependimoma BXD. Ambos linajes celulares provienen de tumores cerebrales pediátricos.
La cuantificación revela que las células BXD exhiben niveles significativamente más bajos de ambas señales en comparación con las células Daoy. A continuación, se examinó la colocalización de los derivados oxidados de 5MC en hiPSCs indiferenciadas. En 24 horas post inducción de diferenciación del endodermo hepático y hiPSCs.
En este análisis, la colocalización de la señal cambió significativamente con la inducción de la diferenciación, lo que puede atribuirse a una magnitud reducida de cinco CAC en las células indiferenciadas. Después de ver este vídeo, debería tener una buena comprensión de cómo generar gráficos y perfiles de intensidad 2.5d y cómo producir datos de colocalización. Las herramientas de análisis y visualización de imágenes descritas aquí, contribuyen a la investigación epigenética, proporcionando una forma relativamente rápida de comparar señales de las diferentes modificaciones del ADN en diferentes grupos experimentales.
Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente una hora si se realiza correctamente. Es importante evitar la sobreexposición y utilizar los mismos ajustes para diferentes grupos experimentales durante la microscopía. Las burbujas de aire en la montura y una inmersión insuficiente pueden causar una pérdida local de fluorescencia, por lo tanto, es fundamental una inspección visual del área de escaneo.
El procedimiento puede automatizarse aún más segmentando los núcleos y creando regiones de interés utilizando Zen Blue. Estas regiones se pueden importar a Zen Black, para realizar análisis de colocalización en múltiples núcleos.
Visión general
Este artículo presenta un flujo de trabajo semi-cuantitativo para visualizar formas oxidadas recién descubiertas de 5-metilcitosina (oxi-mCs) y su distribución espacial dentro de los núcleos. El método permite la evaluación de la intensidad de la señal y la colocalización de las modificaciones del ADN, contribuyendo a la comprensión de sus roles funcionales en la epigenética.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Epigenética
- Modificaciones del ADN
- Técnicas de inmunotinción
Fundamentos
- La 5-metilcitosina y sus derivados oxidados juegan roles cruciales en la regulación génica.
- Entender su distribución espacial puede proporcionar información sobre sus implicaciones funcionales.
- Los métodos existentes pueden no visualizar adecuadamente estas modificaciones.
- Este estudio introduce una herramienta computacional para mejorar la visualización y el análisis.
Propósito del estudio
- Desarrollar un método para evaluar la distribución espacial de las modificaciones del ADN.
- Analizar la intensidad de la señal y la colocalización de diferentes derivados oxidados.
- Facilitar la comprensión de los roles funcionales de estas modificaciones en sistemas biológicos.
Métodos utilizados
- Inmunotinción de modificaciones del ADN en núcleos.
- Microscopía confocal para la adquisición de imágenes.
- Procesamiento de imágenes usando el software Zen Blue para la visualización.
- Análisis de colocalización de intensidades de señal.
Principales resultados
- Se observaron patrones espaciales distintos de derivados oxidados en varios tipos de células.
- El análisis de colocalización reveló cambios significativos durante la diferenciación.
- La cuantificación mostró diferencias en los niveles de señal entre líneas celulares.
- El método demostró potencial para aplicaciones más amplias en la investigación epigenética.
Conclusiones
- El flujo de trabajo desarrollado mejora la visualización de las modificaciones del ADN.
- Los hallazgos sugieren roles funcionales distintos para diferentes derivados oxidados.
- Esta técnica puede aplicarse a varios contextos biológicos para obtener información más profunda.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D teams to quantitatively assess the spatial distribution and signal intensity of DNA modifications in nuclear contexts, supporting mechanistic de-risking in epigenetic target validation. By providing computational analysis of immunostained confocal images, it enhances predictive confidence in early discovery stages where understanding the localization of novel epigenetic marks informs therapeutic hypothesis interrogation. The workflow supports cross-functional collaboration through standardized, reproducible quantitative outputs that can be applied across diverse model systems.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing tissue- and developmental stage-specific occurrence of DNA modifications in vertebrates.
- Operational Value: Supports biological de-risking through quantitative measurement of signal intensity and distribution patterns in nuclei.
- Predictive Value: Contributes to portfolio triage by providing data on the localization of oxidized derivatives of 5-methylcytosine that may play specific roles in cellular processes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows by generating 2.5D signal intensity plots and intensity profiles for multiple cells.
- Operational Value: Addresses assay standardization and reproducibility through consistent laser power and gain settings during microscopy, enabling direct comparisons between samples.
- Screening Readiness: Highlights scalability and platform reuse by demonstrating applicability to other epitopes detectable by immunohistochemistry.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Discusses disease relevance through examination of signal colocalization changes during differentiation in hiPSCs and pediatric brain tumor cell lines.
- Risk-Adjusted Advancement: Describes how quantification of signal levels in Daoy medulloblastoma and BXD ependymoma cells supports decision-making in preclinical validation.
- Mechanistic De-risking: Focuses on predictive value by showing how distinct spatial patterns of oxidized derivatives may reflect tap-dependent oxidation in specific chromatin regions.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from Early Discovery to Lead Identification by providing quantitative imaging data that supports hypothesis testing and pathway clarification in epigenetics research.
- Discovery Biology: Explains how the method supports hypothesis testing through spatial distribution analysis of DNA modifications visualized by immunostaining.
- Screening: Describes assay readiness via signal intensity profiles and table exports that enable quantitative comparison of staining intensity across cells.
- Analytics: Highlights colocalization coefficients and scatter plots that help teams compare conditions and assess relationships between different DNA modifications.
- Translational Research: Connects the method to preclinical continuity through analysis of signal changes during differentiation in stem cell and tumor models.
- Enterprise Reuse: Frames the method as a reusable capability by noting its added application to computational analysis of other epitopes detectable by immunohistochemistry.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through assessment of nuclear localization and relative levels of DNA modifications.
- Operational Value: Standardization and reproducibility via consistent imaging settings and exportable data tables for cross-group comparison.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions by enabling evaluation of DNA modification levels in different experimental groups, such as undifferentiated vs. differentiated hiPSCs.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization through quantification of signal differences between cell lines, such as lower signals in BXD vs. Daoy cells.
Implementation Considerations
- Required scientific expertise in confocal microscopy and immunostaining for DNA modifications.
- Instrumentation and analytical infrastructure needs include Zen Blue software for 2.5D visualization, profile analysis, and colocalization tools.
- Cross-team standardization requirements involve maintaining consistent laser power and gain when comparing intensity profiles between samples.
- Adaptation considerations across model systems are supported by the method’s application in differentiating haphadic progenitors, Daoy medulloblastoma, BXD ependymoma, and hiPSCs.
- Practical limitations include the need to avoid overexposure and inspect scanning areas for air bubbles or insufficient immersion that can cause local fluorescence loss.
