Generación de un gen interrumpido Streptococcus mutans cepa sin gen clonación

El objetivo general de este procedimiento es generar cepas de Streptococcus mutans con genes alterados específicos mediante una PCR de fusión en dos pasos y electroporación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la microbiología, como cómo funciona un gen de interés. La principal ventaja de esta técnica es que no se requiere ninguna reacción enzimática aparte de la PCR y la preparación competente de la célula para la electroporación es bastante sencilla. Aunque este método puede proporcionar información sobre la técnica de alteración génica de Streptococcus mutans, también se puede aplicar a otras especies microbianas como Staphylococcus aureus. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque no están familiarizadas con la eficacia de los cebadores anidados para la segunda PCR. La Dra. Ayako Okada, instructora de investigación de nuestro laboratorio, demostrará el procedimiento. Para comenzar este procedimiento, coloque S.mutans UA159 en una placa de infusión cerebro-corazón o agar BHI e incube la placa durante la noche a 37 grados centígrados en condiciones anaeróbicas. Al día siguiente, use un palillo de dientes esterilizado para recoger una sola colonia e inocularla en cinco mililitros de caldo BHI. Incubar el cultivo de S. mutans durante la noche a 37 grados centígrados en condiciones anaeróbicas. A continuación, centrifugar el cultivo a 2000 veces G durante 15 minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en cinco mililitros de PBS. Vuelva a centrifugar a 2000 veces G durante 15 minutos. Resuspender el pellet celular resultante en 200 microlitros de PBS. Extraiga el ADN genómico de la suspensión utilizando un kit de extracción de ADN genómico basado en perlas. Primero, transfiera la suspensión celular a un tubo de muestra de dos mililitros que contenga perlas de vidrio. Luego agregue 750 microlitros de solución de lisis a la suspensión celular. Tape bien los tubos y colóquelos simétricamente en el soporte de tubos del aparato de disrupción de golpeteo de cuentas. Procese a la velocidad máxima durante cinco minutos. Centrifugar las muestras batidas con perlas a 10.000 veces G durante un minuto. Transfiera el sobrenadante a una columna de centrifugación en un tubo de recolección de dos mililitros y centrifugue a 7000 veces G durante un minuto. Agregue 1200 microlitros de tampón de unión al ADN al filtrado y transfiera 800 microlitros de la mezcla a la columna de centrifugación en un tubo de recolección de dos mililitros. Centrifugar a 10.000 veces G durante un minuto. Deseche el flujo continuo. Añadir 200 microlitros de tampón de prelavado a la columna de centrifugado para lavar la matriz de la columna y centrifugar 10.000 veces G durante un minuto. Deseche el flujo, agregue 500 microlitros de tampón de lavado a la columna de centrifugado para lavar la matriz de la columna y vuelva a centrifugar. Coloque cada columna de centrifugación en un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y agregue 100 microlitros de tampón de elución a la matriz de la columna. Centrifugar a 10.000 veces G durante 30 segundos para eluir el ADN genómico. Estime la concentración y pureza del ADN midiendo la absorbancia a 260 nanómetros y 280 nanómetros utilizando un espectrofotómetro. La primera PCR se realiza utilizando el genoma de tipo salvaje de S. mutans y el gen de resistencia a la estreptomicina sintética como plantillas de PCR. Se utilizan tres conjuntos de cebadores para amplificar, respectivamente, la región flanqueante ascendente del gen de la glicosiltransferasa C o gtfC, la región flanqueante descendente del gen gtfC y el gen de resistencia a la espectinomicina. Fraccionar cada producto de PCR en un gel de agarosa al 1%. El tamaño de cada producto desde la primera PCR debe ser de aproximadamente un KB. Utilice un cortador de bandas de gel para extirpar las bandas correspondientes y purificar cada producto de ADN amplificado como se describe en el protocolo de texto. El siguiente paso es utilizar los tres fragmentos molares aproximadamente iguales como plantillas de PCR para realizar la segunda PCR. Estos fragmentos se amplifican y empalman utilizando cebadores apropiados para producir la construcción de interrupción. Dado que el éxito de este procedimiento depende de la amplificación del constructo de interrupción mediante una segunda PCR, es importante confirmar el producto de la segunda PCR mediante electroforesis. Cargue 1/10 de la mezcla de reacción de PCR en un gel de agarosa al 0,8% para confirmar que el amplicón generado tiene el tamaño de banda previsto. En este ejemplo, los cebadores anidados proporcionaron una amplificación mucho mejor. Transfiera la mezcla de PCR restante a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y agregue 55 microlitros de agua ultrapura para ajustar el volumen total a 100 microlitros. Agregue 1/10 de volumen de acetato de sodio de tres molares pH 5.2, seguido de 2.5 volúmenes de etanol al 100% y mezcle. Congele a menos 80 grados Celsius durante 30 minutos. Centrifugar a 15.000 veces G a cuatro grados centígrados durante 20 minutos. Cuando termine la centrifugación, verifique si hay el pellet en la parte inferior del tubo. Deseche el sobrenadante. Lavar el pellet con un mililitro de etanol al 70% y centrifugar a 15.000 veces G a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y seque al aire el pellet durante aproximadamente 30 minutos. Por último, disuelva el pellet con 10 microlitros de agua ultrapura. Las células competentes de S. mutans UA159 se prepararon previamente y se almacenaron como alícuotas de 50 microlitros a menos 80 grados Celsius. Mezcle cada alícuota de 50 microlitros de células competentes heladas con cinco microlitros de la construcción de disrupción. Agregue la mezcla a las cubetas de electroporación con una distancia de 0,2 centímetros entre electrodos. Realizar la electroporación utilizando el modo Staphylococcus aureus del aparato de electroporación. Inmediatamente después de la electroporación, suspenda las células en 500 microlitros de caldo BHI y agregue 50 microlitros de la suspensión a las placas de agar BHI que contengan espectinomicina. Incubar las placas durante dos a seis días a los 37