Name: Inyección hidrodinámica la Pelvis Renal para la no expresión de proteínas en el riñón (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Aprende a realizar inyección hidrodinámica en la pelvis renal de ratones adultos para lograr expresión específica de proteínas en el riñón. Esta técnica reproducible permite investigar funciones genéticas en nefrología.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Un premio de desarrollo de carrera del Departamento de Asuntos Veteranos [BX002797] apoyó L.E.W. y los institutos nacionales de salud [R01-DK095867] y Asociación Americana del corazón [15GRNT25700209] apoyado J.C. Los institutos nacionales de salud [DK093660], Departamento de asuntos de veteranos [BX002190] y el centro de Vanderbilt para enfermedad renal compatible M.H.W. Este material es el resultado del trabajo apoyado con recursos y uso de instalaciones en el sistema de Healthcare del Valle de Tennessee de VA.

<ol><li>Liu, F., Song, Y., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics-based+transfection+in+animals+by+systemic+administration+of+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA.</a> Gene Ther. 6 (7), 1258-1266 (1999).</li>
<li>Zhang, G., Budker, V., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+levels+of+foreign+gene+expression+in+hepatocytes+after+tail+vein+injections+of+naked+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">High levels of foreign gene expression in hepatocytes after tail vein injections of naked plasmid DNA.</a> Human Gene Therapy. 10, 1735-1737 (1999).</li>
<li>Fumoto, S., Nishimura, K., Nishida, K., Kawakami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-Dimensional+Imaging+of+the+Intracellular+Fate+of+Plasmid+DNA+and+Transgene+Expression%3A+ZsGreen1+and+Tissue+Clearing+Method+CUBIC+Are+an+Optimal+Combination+for+Multicolor+Deep+Imaging+in+Murine+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Three-Dimensional Imaging of the Intracellular Fate of Plasmid DNA and Transgene Expression: ZsGreen1 and Tissue Clearing Method CUBIC Are an Optimal Combination for Multicolor Deep Imaging in Murine Tissues.</a> PLoS One. 11 (1), e0148233(2016).</li>
<li>Yoshino, H., Hashizume, K., Kobayashi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naked+plasmid+DNA+transfer+to+the+porcine+liver+using+rapid+injection+with+large+volume%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Naked plasmid DNA transfer to the porcine liver using rapid injection with large volume.</a> Gene Ther. 13 (24), 1696-1702 (2006).</li>
<li>Kamimura, K., Suda, T., Xu, W., Zhang, G., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided%2C+lobe-specific+hydrodynamic+gene+delivery+to+swine+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Image-guided, lobe-specific hydrodynamic gene delivery to swine liver.</a> Mol Ther. 17 (3), 491-499 (2009).</li>
<li>Kamimura, K., Zhang, G., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image-guided%2Cintravascular+hydrodynamic+gene+delivery+to+skeletal+muscle+in+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Image-guided,intravascular hydrodynamic gene delivery to skeletal muscle in pigs.</a> Mol Ther. 18 (1), 93-100 (2010).</li>
<li>Suda, T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+gene+delivery%3A+its+principles+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications.</a> Mol.Ther. 15 (12), 2063-2069 (2007).</li>
<li>Alino, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naked+DNA+delivery+to+whole+pig+cardiac+tissue+by+coronary+sinus+retrograde+injection+employing+non-invasive+catheterization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gene+Med%22%5BJournal%5D)">Naked DNA delivery to whole pig cardiac tissue by coronary sinus retrograde injection employing non-invasive catheterization.</a> J Gene Med. 12 (11), 920-926 (2010).</li>
<li>Suda, T., Gao, X., Stolz, D. B., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+impact+of+hydrodynamic+injection+on+mouse+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Structural impact of hydrodynamic injection on mouse liver.</a> Gene Ther. 14 (2), 129-137 (2007).</li>
<li>Skrypnyk, N. I., Harris, R. C., de Caestecker, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemia-reperfusion+model+of+acute+kidney+injury+and+post+injury+fibrosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Ischemia-reperfusion model of acute kidney injury and post injury fibrosis in mice.</a> J Vis Exp. (78), (2013).</li>
<li>Woodard, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kidney-specific+transposon-mediated+gene+transfer+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Kidney-specific transposon-mediated gene transfer in vivo.</a> Sci Rep. 7, 44904(2017).</li>
<li>Liang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+glutathione+S-transferase+A4+accelerates+obstruction-induced+tubule+damage+and+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Loss of glutathione S-transferase A4 accelerates obstruction-induced tubule damage and renal fibrosis.</a> Journal of Pathology. 228 (4), 448-458 (2012).</li>
<li>Liang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protective+role+of+insulin-like+growth+factor-1+receptor+in+endothelial+cells+against+unilateral+ureteral+obstruction-induced+renal+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Protective role of insulin-like growth factor-1 receptor in endothelial cells against unilateral ureteral obstruction-induced renal fibrosis.</a> Am J Pathol. 185 (5), 1234-1250 (2015).</li>
<li>Corridon, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+facilitate+and+monitor+expression+of+exogenous+genes+in+the+rat+kidney+using+plasmid+and+viral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">A method to facilitate and monitor expression of exogenous genes in the rat kidney using plasmid and viral vectors.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 304 (9), F1217-F1229 (2013).</li>
<li>Wallace, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+kidney+volume+in+mice+with+polycystic+kidney+disease+by+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Tracking kidney volume in mice with polycystic kidney disease by magnetic resonance imaging.</a> Kidney Int. 73 (6), 778-781 (2008).</li>
<li>Woodard, L. E., Wilson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-ing+models+and+new+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">piggyBac-ing models and new therapeutic strategies.</a> Trends Biotechnol. 33 (9), 525-533 (2015).</li>
<li>Yeikilis, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamics+based+transfection+in+normal+and+fibrotic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamics based transfection in normal and fibrotic rats.</a> World J Gastroenterol. 12 (38), 6149-6155 (2006).</li>
<li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. (41), (2010).</li>
<li>Wooddell, C. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+damage+after+delivery+of+naked+plasmid+DNA+into+skeletal+muscles+is+batch+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Muscle damage after delivery of naked plasmid DNA into skeletal muscles is batch dependent.</a> Hum Gene Ther. 22 (2), 225-235 (2011).</li>
<li>Crespo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydrodynamic+liver+gene+transfer+mechanism+involves+transient+sinusoidal+blood+stasis+and+massive+hepatocyte+endocytic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Hydrodynamic liver gene transfer mechanism involves transient sinusoidal blood stasis and massive hepatocyte endocytic vesicles.</a> Gene Ther. 12 (11), 927-935 (2005).</li>
<li>Rocca, C. J., Ur, S. N., Harrison, F., Cherqui, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((rAAV9+combined+with+renal+vein+injection+is+optimal+for+kidney-targeted+gene+delivery%3A+conclusion+of+a+comparative+study%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">rAAV9 combined with renal vein injection is optimal for kidney-targeted gene delivery: conclusion of a comparative study.</a> Gene Ther. 21 (6), 618-628 (2014).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar y no declarar ningún conflicto de interés.

En este protocolo se describe un método robusto para alcanzar expresión génica reproducible específicamente en el riñón. En manos de un cirujano experimentado moderado encontramos el porcentaje de ratones transfectadas por esta técnica en el rango de 50-100%, dependiendo de la edad del ratón y la sensibilidad de la lectura del transgén. El nivel de expresión del gen de luciferasa fue sobre el fondo durante varios meses en ratones recibiendo transposones piggyBac y totalmente mantenida durante varias semanas en r...

La técnica de inyección hidrodinámica cola vena se ha convertido en una forma comúnmente usada para alcanzar altos niveles de expresión génica en mouse de hígado1,2. Los riñones también son transfectados por esta técnica en un nivel mucho más bajo, aproximadamente 100-fold menos3. La inyección hidrodinámica renal pelvis descrita aquí proporciona una manera simple para controlar la especificidad de la expresión del órgano a través de medios físicos, utilizando los mismos principios hidrodinámicos que se han establecido previamente en el hígado4,5 , músculo6y otros órganos7,8. Este método transfects las células de animales vivos en vivo mediante el uso de presión y velocidad para forzar fluido que contienen ADN en las células, induciendo simultáneamente daño al órgano que es rápidamente resueltos9. Usando técnicas quirúrgicas bien establecidas para visualizar el riñón a través de una incisión de flanco10 junto con una sola inyección de la jeringuilla de la insulina, hemos encontrado exitosa transfección de varios tipos de células del riñón, principalmente fibroblastos intersticiales, túbulos y conductos que recoge11. La disección de estos ratones ha demostrado que otros órganos no son transfectados en niveles suficientemente altos como para visualizar por luciferase imágenes técnicas11. Ya que la técnica es no-viral, uso de ADN plásmido para transfección permite fácil y rápida preparación de los reactivos necesarios para la inyección.
Hemos utilizado las inyecciones localizadas de hidrodinámicas para expresar el antioxidante glutatión S-transferasa A4, el receptor de factor de crecimiento 1 similar a la insulina y la hormona eritropoyetina en el riñón, con los esperados efectos biológicos11, 12 , 13. evaluación detallada de la ruta de administración, volumen de inyección, dosis de ADN y elección del promotor ha sido realizado11. Además, tanto en el piggyBac transposon sistema o ciclofosfamida tratamiento para suprimir la reacción inmune a la transgénica han demostrado para mejorar a largo plazo de los resultados de expresión génica11. Otros investigadores han utilizado un enfoque de la vena renal en rata con éxito, logrando eficiencia de transfección alta durante períodos de tiempo de más de un mes14. Sin embargo, la corrección genética de fenotipos mímico enfermedad humana se realizan generalmente en ratones primero como una prueba de concepto ya que los modelos genéticos más mamíferos son modelos de ratón. En comparación con la inyección en la vena renal a la inyección de la pelvis renal y encontraron que la inyección en la pelvis renal es superior a la vena renal para la expresión de genes (aproximadamente diez veces mayor) y supervivencia11. La pelvis renal es la vía ideal de entrada en el riñón porque es lo suficientemente flexible para tolerar fluctuaciones en la producción de orina y a menudo es capaz de mantener su integridad estructural, incluso cuando se dilatan durante la hidronefrosis. Adicionalmente, la inyección en la pelvis renal permite acceso al riñón sin perforación de la cápsula del riñón, permitiendo que el líquido inyectado para conservarse visiblemente por el riñón mejor que la inyección de la intraparenchymal. Otros órganos de ratón no tiene una ruta de entrada distinta a la vasculatura y el espacio urinario del riñón es un sitio ideal de la inyección. Además, la inyección en la vena renal dio lugar a la salida de sangre en la cavidad abdominal. El volumen total renal de riñones de tipo salvaje ratón ha estimado la proyección de imagen de resonancia magnética a ser aproximadamente de 0,2 cm3, por lo que el volumen de un solo riñón es aproximadamente igual a la cantidad de líquido inyectado por la hidrodinámica de la pelvis renal inyección (100 μL)15. En este documento, nos hemos puesto a disposición todos los matices detallados del Protocolo de inyección hidrodinámica la pelvis renal para lograr reproducible de la transfección del riñón.

<table><tbody><tr><td>AnaSed Xylazine</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-808-1947</td><td>Anestésico - Sustancia no controlada</td></tr><tr><td>BD Insulina Jeringa 0.5 mL 29G 1/2 Pulgada</td><td>Cardinal Health</td><td>309306</td><td>Jeringas requeridas</td></tr><tr><td>Buprenex</td><td>Farmacéutico/Veterinario</td><td></td><td>Analgesia - Sustancia Controlada</td></tr><tr><td>Dynarex Cortina de toalla desechable</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>19-310-671</td><td>Colóquelo sobre la almohadilla</td></tr><tr><td>térmica EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Use solo ADN plasmídico libre de endotoxinas</td></tr><tr><td>Endosafe Gel-Clot LAL Control Positivo Rápido</td><td>Charles River</td><td>PC200</td><td>Control positivo para prueba de endotoxinas</td></tr><tr><td>Endosafe Gel-Clot LAL Vial de prueba única rápida</td><td>Charles River</td><td>R13500</td><td>Prueba de endotoxinas</td></tr><tr><td>Tijeras de microdisección extrafinas</td><td>Roboz Surgical Instrumento</td><td>RS-5882</td><td>Herramienta quirúrgica</td></tr><tr><td>Fisherbrand Bolsa de esterilización de sellado instantáneo - 9"</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>01-812-51</td><td>Para herramientas quirúrgicas de autoclave</td></tr><tr><td>Bomba de calor Gaymar</td><td>Paragon Medical</td><td>TP-700</td><td>Bomba de calor de circulación de agua</td></tr><tr><td>Germinator 500</td><td>Roboz Instrumento quirúrgico</td><td>DS-401</td><td>Para reutilizar herramientas quirúrgicas durante la cirugía</td></tr><tr><td>Graefe Pinzas</td><td>Roboz Instrumento quirúrgico</td><td>RS-5136</td><td>Herramienta quirúrgica</td></tr><tr><td>Graefe Pinza de tejido</td><td>Roboz Instrumento quirúrgico</td><td>RS-5153</td><td>Herramienta quirúrgica</td></tr><tr><td>Halsey Portaagujas, 5" de longitud</td><td>Instrumento quirúrgico Roboz</td><td>RS-7841</td><td>Herramienta quirúrgica</td></tr><tr><td>Almohadillas térmicas - 15" x 21" - necesitan al menos 3</td><td>Paragon Medical</td><td>TP22G</td><td>Para usar con la bomba de</td></tr> <tr><td>calor GaymarIsoFlo (Isoflurano, USP)</td><td>Abbott Animal Health</td><td>5260-04-05</td><td>Para la obtención de imágenes y la eutanasia</td></tr><tr><td>Sistema de administración de isoflurano Isotec Vaporizador</td><td>Smiths Medical</td><td>VCT3K2</td><td>Para la obtención de imágenes y la eutanasia</td></tr><tr><td>Ketamina</td><td>Farmacéutico/Veterinario</td><td></td><td>Anestésico - Sustancia controlada</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark Professional</td><td>34120</td><td>Pañuelos de laboratorio</td></tr><tr><td>Software Living Image</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>Para la obtención de imágenes de animales vivos</td>Luciferin Perkin Elmer 122796 Para la obtención de imágenes de animales vivos <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000-US-CAN</td><td>Espectrofotómetro para la medición de ADN</td></tr><tr><td>Hisopos Prevantics</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>23-100-110</td><td>Para la preparación para cirugías de piel</td></tr><tr><td>Suturas Prolene 5-0 Taper 30"</td> <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC0256891</td><td>Suturas no absorbibles para la piel</td></tr><tr><td>Ungüento oftálmico de la marca Puralube</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-888-2572</td><td>Para mantener los ojos húmedos durante la cirugía</td></tr><tr><td>Trans IT - QR Solución de administración hidrodinámica</td><td>Mirus Bio</td><td>MIR-5240</td><td>Tampón de administración hidrodinámica para diluir ADN</td></tr><tr><td>Vicryl 5-0 Suturas J303H</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9816710</td><td>Suturas reabsorbibles para la capa muscular</td></tr><tr><td>Wahl Mini Arco Clipper</td><td>Med-Vet International</td><td>8787-1550</td><td>Afeitadora para la preparación de la piel</td></tr><tr><td>Xenogen IVIS 200</td><td>Caliper Life Sciences</td><td>Para la obtención de imágenes de animales vivos</td><td></td></tr></tbody></table>

inyección hidrodinámica la pelvis renal para la no expresión de proteínas en el riñón

Hydrodynamic Renal Pelvis Injection for Non-viral Expression of Proteins in the Kidney

Inyección hidrodinámica crea un ambiente local, alta presión para transfectar varios tejidos con ADN plasmídico y otras sustancias. Inyección en la vena hidrodinámica cola, por ejemplo, es un método bien establecido de que el hígado puede ser transfectado. Este manuscrito describe una aplicación de los principios hidrodinámicos por inyección del riñón de ratón directamente con ADN de plásmido de expresión génica específicos de riñón. Ratones son anestesiados y se expone el riñón por una incisión flanco seguida de una inyección rápida de un plásmido que contiene el ADN de la solución directamente en la pelvis renal. La aguja se mantiene en el lugar durante diez segundos y el sitio de la incisión es suturado. Al día siguiente, en vivo la proyección de imagen animal, Western blot o inmunohistoquímica puede utilizarse para análisis de expresión génica, u otros ensayos para el transgén de la opción se utilizan para la detección de la proteína de interés. Métodos publicados para prolongar la expresión de genes incluyen el transgén mediada por transposones integración y ciclofosfamida tratamiento para inhibir la respuesta inmune a la transgénica.

La técnica de la cirugía y la inyección son sencillas para llevar a cabo una vez dominado, que no requiere equipos o materiales costosos. Si a la cirugía de incisión flanco renal, se debe un día de entrenamiento en varios ratones programados para eutanasia en que los ratones no son recuperados después de la cirugía porque el primer intento de esta cirugía puede tomar mucho más tiempo de lo normal. Alternativamente, los investigadores familiarizados con las técnicas similares pueden encont...

Este protocolo describe un método para inyectar ADN plásmido en el riñón de ratón a través de la pelvis renal para producir la expresión del transgen específicamente en el riñón.

Inyección hidrodinámica la Pelvis Renal para la no expresión de proteínas en el riñón

Hydrodynamic injection creates a local, high-pressure environment to transfect various tissues with plasmid DNA and other substances. Hydrodynamic tail ...

El objetivo general de este procedimiento quirúrgico es producir la expresión de proteínas a partir del ADN plasmídico en el riñón de ratón adulto. Este método es una nueva herramienta para abordar cuestiones clave en nefrología, como por ejemplo, cómo la expresión de una proteína de interés afecta al riñón adulto. La principal ventaja de esta técnica es que produce la expresión de proteínas de forma reproducible, concretamente en el riñón, a diferencia de otros métodos que también pueden producir expresión génica en otros órganos.La demostración visual de este método es fundamental, ya que la inyección de la pelvis renal requiere una exposición cuidadosa y debe realizarse rápidamente para que el ADN plasmático ingrese a las células. Comience por resuspender el ADN plasmídico en el tampón de administración hidrodinámica. En una almohadilla térmica que circula por agua cubierta con una almohadilla azul, coloque el mouse.Con una afeitadora diseñada para el aseo de mascotas, afeita el lado izquierdo de la espalda del ratón desde el hombro hasta la grupa y desde el flanco hasta la columna vertebral. Limpie el cabello suelto y los residuos y aplique ungüento veterinario en ambos ojos para prevenir la desecación de la córnea. Ahora, prepare 100 microlitros que contengan de 10 a 50 microgramos de ADN plasmídico diluido en una jeringa separada para cada ratón que esté anestesiado, asegurándose de que no haya burbujas de aire.La aguja debe estar fijada permanentemente sin un seguro. Antes de realizar la cirugía, vacíe los instrumentos quirúrgicos estériles sin tocarlos en una bandeja estéril colocada sobre la almohadilla térmica. Ahora, levanta el ratón y colócalo en un campo de visión iluminado.Del embalaje, retire los hisopos antisépticos cutáneos con gluconato de clorhexidina al 3,15 % y alcohol isopropílico al 70 % y colóquelos cerca del animal. Use guantes quirúrgicos estériles y, comenzando desde el sitio de la incisión, frote al animal con un nuevo hisopo de alcohol con clorhexidina, tres veces con movimientos circulares. Ahora, ubique el sitio de la incisión.Pellizque la piel con pinzas y, con unas tijeras, corte la capa de piel aproximadamente a un centímetro de la columna vertebral, por debajo de la caja torácica. Haz otro corte de un centímetro por debajo en la capa muscular. Localice el riñón y, sin tocarlo, expóngalo suavemente de la cavidad abdominal aplicando una presión constante y suave sobre el abdomen con los dedos.Exponer el riñón a veces es difícil. Aplique una presión suave en el abdomen y la columna vertebral para evitar dañar el bazo. Si se salen órganos que no sean el riñón, devuélvalos suavemente a la cavidad corporal con pinzas cerradas si es necesario.Luego, separe suavemente el riñón de la grasa circundante lo suficiente para visualizar la pelvis renal, que se puede ver como un pequeño punto blanco. Después de visualizar la pelvis renal, use pinzas cerradas para empujar hacia abajo el lado derecho del riñón para que la pelvis renal permanezca a la vista. Luego, agarre la jeringa de insulina cargada en la mano derecha sosteniéndola paralela a la superficie de trabajo e inserte la aguja con cuidado en la pelvis renal.Una vez insertada la aguja, inyecte la solución rápidamente, en tres segundos. Deje que la aguja permanezca en su lugar durante aproximadamente 10 segundos para evitar el reflujo de la solución. Luego, retire la aguja lenta y cuidadosamente y regrese el órgano a la cavidad abdominal estirando suavemente el sitio de la incisión con pinzas cerradas.Ahora, sutura la capa muscular con suturas reabsorbibles de cinco o y coloca de dos a cuatro nudos independientes. Del mismo modo, sutura la capa de piel con suturas de nailon no absorbible de cinco o seis O y coloca de dos a cuatro nudos independientes. Para evaluar la eficacia de la transfección, se introducen 10 microgramos de un plásmido que expresa luciferasa en el ADN diluido para inyectarlo y realizar imágenes de animales vivos al día siguiente.Coloque la primera jaula de ratones en la cámara y ciérrela. Una vez anestesiado, inyecte a cada ratón por vía intraperitoneal 100 microlitros de luciferina descongelada y registre la hora. Seleccione el ID de usuario correcto y, en la barra de menú superior, haga clic en adquisición y seleccione guardar automáticamente dos en el menú desplegable.Inicialice el sistema haciendo clic en inicializar. Espere a que finalice la inicialización y cambie el campo de visión a D, para obtener una imagen de cinco ratones. Asegúrese de que los animales estén colocados en el orden deseado y que sus espaldas estén mirando hacia la cámara para visualizar el riñón.Luego, presione adquirir cinco minutos después de la inyección para tomar la imagen. Después de la adquisición, retire los ratones de la máquina de imágenes. Apague el gas.Limpie la cámara, los peines nasales y la platina de imagen. Para analizar los datos, después de hacer clic en las herramientas de ROI, haga clic en el icono del círculo y seleccione uno en el menú desplegable para colocar el nuevo ROI en la imagen como lo indica un óvalo rojo con cuatro cuadrados a su alrededor. Para ajustar el tamaño del ROI, coloque el cursor sobre un cuadrado rojo y arrastre para encerrar el área púrpura que se superpone al riñón inyectado.Ahora, haga clic con el botón derecho en este ROI y seleccione duplicar ROI para duplicar el ROI en la ventana actual y moverlo al siguiente mouse. Después de colocar todos los ROI desde el menú directamente encima de la imagen, cambie las unidades de recuentos a fotones de radiancia. Por último, cree una hoja de cálculo de las mediciones exportando los datos de ROI desde el paladar de herramientas haciendo clic en Herramientas de ROI y luego en el icono de la regla del lápiz.Se muestra la expresión génica específica del riñón de plásmidos reporteros. A todos los ratones se les inyectó plásmido pTet que expresaba luciferasa de luciferasa de luciérnaga mejorada, mientras que a los ratones dos, tres y cinco también se les inyectó plásmido pEF1-alfa-tdtomato, que expresa la proteína fluorescente roja, tdtomato. Generalmente, el resplandor en ratones jóvenes estará dentro de un orden de magnitud.Es posible que algunos ratones no muestren niveles apreciables de luminosidad, ya sea debido a la baja eficiencia de transfección o a la falta del propio transgén. La inyección de tampón hidrodinámico sirve como control. No se observa expresión de plásmido cuando se le da solo el tampón hidrodinámico.En los primeros días después de la transfección, es probable que haya un número bajo de células que den positivo para el transgén. Estas células se ven localizadas en parches en las áreas infiltradas por el líquido de inyección. En esta imagen, las señales verdes provienen de los túbulos proximales, que están teñidos para la aglutinina de loto tetragonolobus y las señales rojas son de las células transfectadas que expresan el gen reportero tdtomato.Una vez dominada, la cirugía se puede realizar en menos de 10 minutos, sin embargo, la anestesia tarda en inducirse y recuperarse. Por lo tanto, dos personas capacitadas, trabajando en estrecha colaboración, podrían hacer solo alrededor de 10 a 15 ratones por día. Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar ratones jóvenes.La técnica hidrodinámica no funciona tan bien en los órganos fibróticos más viejos. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis de muestras de sangre, orina y tejido renal, con el fin de evaluar la expresión del gen de interés. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo inyectar ADN plasmídico en la pelvis renal para lograr la expresión de proteínas específicas del riñón.

hydrodynamic-renal-pelvis-injection-for-non-viral-expression-proteins

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Fuente: Gupta, K., et al. Inyección intrarrenal de Escherichia coli en un modelo de ratón de pielonefritis.  J. Vis. Exp. (2017).Este vídeo muestra la inyección intrarrenal de E. coli en la pelvis renal de una rata anestesiada para inducir una infección renal localizada, modelando la pielonefritis aguda. Destaca los pasos quirúrgicos clave y las técnicas asépticas necesarias para establecer un modelo de infección in vivo reproducible para análisis posteriores.

Inyección intrarrenal de E. coli en la pelvis renal de una rata

Source: Van Lidth de Jeude, et al. A Protocol for Lentiviral Transduction and Downstream Analysis of Intestinal Organoids. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates the process of producing viral particles through transfection of embryonic kidney cells with plasmid–polyethylenimine complexes, which leads to viral genome expression, particle assembly, and virus collection in the medium.

Polyethylenimine-Mediated Transfection of Embryonic Kidney Cells for Recombinant Virus Production

En este video, presentamos el protocolo para la inyección hidrodinámica de plásmidos en la pelvis renal del riñón de ratón para la transfección de ácidos nucleicos. Esta técnica permite la administración de plásmidos específicos de órganos mediante la utilización del principio de alta presión hidrostática, que impulsa con fuerza los plásmidos al sitio específico sin causar lesiones tisulares.

Inyección hidrodinámica de pelvis renal: una técnica para administrar directamente el ADN a las células renales de un modelo murino

En este video, demostramos la administración de fármacos intrarrenales en ratas a través de la arteria renal. Este método es beneficioso para mejorar la orientación de los fármacos, la potencia de los fármacos y minimizar la toxicidad sistémica.

Administración intrarrenal de fármacos en ratas: un método para administrar fármacos terapéuticos en riñón de rata mediante inyección intraarterial

Aquí, presentamos un protocolo para utilizar mapas de destino y trazadores de linaje para dirigir inyecciones en blastómeros individuales que dan lugar al riñón de embriones de Xenopus laevis.

Técnica de microinyección a Target a los países en desarrollo<em&gt; Xenopus</em&gt; riñón

Las lesiones renales efectuados desde nefrotóxicos, que incluyen medicamentos que van desde antibióticos a los agentes quimioterapéuticos, pueden dar lugar a trastornos complejos cuya patogénesis se conoce por completo. Este protocolo se muestra cómo el pez cebra se puede utilizar para el modelado de la enfermedad de estas condiciones, que se pueden aplicar a la identificación de medidas renoprotective.

Nefrotoxina Microinyección en pez cebra para modelar la lesión renal aguda

La administración de fármacos para la recuperación de la función renal requiere el control de la localización y distribución del compuesto terapéutico. A continuación, describimos en detalle una técnica sencilla para la entrega intrarrenal de drogas en ratas. Este procedimiento se puede realizar fácilmente sin mortalidad y alta reproducibilidad.

Intravascular de entrega de los productos biológicos para el riñón de rata

Este manuscrito describe un modelo quirúrgico de pielonefritis en ratas utilizando una infección intrarrenal directa por Escherichia coli en la pelvis renal. El procedimiento experimental se puede utilizar para estudiar la patogénesis de la pielonefritis, así como la inflamación y la fibrosis asociadas.

Intrarrenal Inyección de Escherichia coli En un modelo de rata de pielonefritis

Este manuscrito describe un método para el parto selectivo a un solo riñón a través de un catéter colocado en la aorta abdominal infrarenal en el ratón.

Entrega directa de medicamentos al riñón a través de la arteria renal

Aquí, entregamos imitaciones exógenas de miARN sintetizadas artificialmente al riñón a través de la inyección de venas de cola de un vector no viral y nanopartículas de polietilenimina en varios modelos de ratón con enfermedad renal. Esto condujo a una sobreexpresión significativa de miARN objetivo en el riñón, lo que resultó en una progresión inhibida de la enfermedad renal en varios modelos de ratón.

Entrega de miRNA sintetizado artificialmente exógeno imitador al riñón utilizando nanopartículas de polietilenimina en varios modelos de ratón con enfermedad renal

Este informe detalla el método de inyección localizada de vectores AAV a través de la pelvis renal para una transferencia de genes efectiva y segura al riñón del ratón.

Entrega efectiva y segura de genes al riñón de ratón mediante inyección lenta retrógrada en la pelvis renal de vectores de virus adenoasociados

Aprende a realizar inyección hidrodinámica en la pelvis renal de ratones adultos para lograr expresión específica de proteínas en el riñón. Esta técnica reproducible permite investigar funciones genéticas en nefrología.

Inyección hidrodinámica la Pelvis Renal para la no expresión de proteínas en el riñón

Explorar más videos