Name: El ensayo de reconstitución de organoides (ORA) para el análisis funcional del tallo Intestinal y las células del nicho (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: Aprende el ensayo de reconstitución de organoides para analizar células madre Lgr5+ y células de nicho Paneth mediante modificaciones genéticas o bioquímicas. Este método permite estudios específicos por tipo celular.

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Este estudio fue posible gracias a fondos de la sociedad holandesa del cáncer (KWF; EMCR 2012-5473) y el mundo el cáncer investigación fondos Internacional (WCRF, proyecto no. 2014-1181)

Todos los procedimientos se realizaron según las pautas y leyes de bienestar animal local.
1. preparación de instrumentos, medios de cultivo y platos
<ol><li>Sistema de autoclave 1 intestinales tijeras, tijeras normales y pinzas en un recipiente estéril.</li>
	<li>Colocar un plato de 96 pozos (fondo plano) en una incubadora a 37 ° C.</li>
	<li>Preparar 10 mL de medio de cultivo completo con los reactivos indicados en la tabla de materiales.</li>
	<li>Incubar el medio completo a 37 ° C en un baño de agua.</li>
	<li>Descongele la membrana basal reconstituida colocando en un cubo de hielo. La membrana basal reconstituida se convertirá en líquido a 4 ° C.</li>
	<li>Llene 4 placas de Petri con solución salina tamponada con fosfato frío o abreviado PBS (4 ° C).</li>
</ol>2. aislamiento de las criptas intestinales pequeñas
<ol><li>Sacrificio por inhalación de CO2 de un Lgr5- eGFP-IRES-CreERt2 ratón sobre fondo C57BL6/J. Disecar el peritoneo longitudinalmente con un par de tijeras.</li>
	<li>Mantenga el estómago con el fórceps y cortadas transversalmente por la mitad.</li>
	<li>Con las tijeras intestinales de ahora en adelante, sacar el intestino y colocar en una placa de Petri con PBS. Nota: Tijeras intestinales tienen una fuerte y una punta Roma. La punta Roma de estas Tijeras es no dañar la arquitectura de la cripta vellosidad al abrir el intestino.</li>
	<li>Comenzar colocando la punta Roma en el estómago y empuje suavemente a través del píloro. Continúe cortando con las tijeras y tracción con el fórceps.</li>
	<li>Una vez que el intestino entero se abre longitudinalmente, lavar en PBS frío sujetándola con las pinzas y enjuáguelo suavemente en la solución de PBS con movimientos en forma de U.</li>
	<li>Una vez que se eliminan todos los restos de heces, proceder a alisar el intestino en una tabla de cortar, luminal hacia arriba. El lado luminal es fácilmente reconocible por la ausencia de vasos sanguíneos y por su aspecto pálido en comparación con la parte exterior.</li>
	<li>Con un portaobjetos de vidrio, quite con cuidado las vellosidades raspando el intestino aplanado. Realizar este paso dos veces a lo largo de toda la longitud del tejido.</li>
	<li>Trocear el intestino con una cuchilla quirúrgica estéril 2-5 mm.</li>
	<li>Colocar los pequeños fragmentos intestinales en un tubo de 50 mL que contiene 10 mL de PBS frío hielo.</li>
	<li>Limpiar los fragmentos de tejido, eliminando cualquier impureza restante transfiriendo hacia arriba y hacia abajo en el PBS. Deseche el sobrenadante y repetir este paso hasta que el PBS es totalmente claro.</li>
	<li>Añadir 15 mL PBS frío, para llevar el volumen final total de PBS a 25 mL. Añadir 2 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) e incubar durante 45 min sobre un rodillo de 4 ° c.</li>
	<li>Descartar el PBS/EDTA.</li>
	<li>Añadir 10 mL de PBS y separar las criptas mediante pipeteo duramente los fragmentos de tejido hacia arriba y hacia abajo (por lo menos tres veces). Recoger el sobrenadante.</li>
	<li>Repita el paso 2.13 cuatro veces. Añadir el medio de cultivo para alcanzar un volumen final de 50 mL.</li>
	<li>Sedimenten las células por centrifugación (300 x g durante 5 min).</li>
	<li>Resuspender el precipitado en 10 mL de medio de cultivo y las criptas de pellets por centrifugación (80 x g durante 3 min).</li>
</ol>3. célula preparación
<ol><li>Deseche el sobrenadante de las criptas sedimentados y resuspender en 1 mL de tripsina como-enzimas junto con 50 μl DNasa (50 μg/mL).</li>
	<li>Incubar las células en un baño de agua a 32 ° C por 2 min.</li>
	<li>Añadir 10 mL de medio de cultivo. Disocian las criptas en las células mediante pipeteo duramente hacia arriba y hacia abajo por lo menos 5 veces.</li>
	<li>Filtrar la solución a través de un tamiz de 40 μm (para eliminar grumos y otras impurezas) y de la pelotilla de las células a 300 x g durante 5 minutos.</li>
</ol>4. galjanoplastia y citometría de flujo
<ol><li>Preparar 50 mL de solución salina tamponada de 1 x Hank o solución de suero (FCS) HBSS/2% vaca fetal y resuspender el precipitado en 1 mL para cada 106 células</li>
	<li>Añadir a la suspensión de células BV421 Lin– (CD31, CD45, TER119) a una concentración de 1: 100 y CD24-APC y CD117-PE ambos a una concentración de anticuerpos de 1: 250 por 30 min.</li>
	<li>Tipo Lgr5+ células madre y células de Paneth en separado bajo atan los tubos. Para obtener más información sobre la distribución de protocolos para Lgr5+ y células de Paneth, véase Roth et al. 7 y Schewe et al. 6<ol>
<li>Centrifugar las células clasificadas a 300 x g durante 5 min resuspender las células en 100 μl de medio con los componentes descritos en 1.3 (véase la Tabla de materiales).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tratamiento (p. ej., por modificación química o genética) de las células de Paneth (n = 2000) o las células de vástago Lgr5+ (n = 2000).<ol>
<li>Para tratar células, se utilizan 5 μl de reactivo de transfección mediada por liposomas en un volumen total de 100 μl de medio de cultivo y ARN interferente pequeño (siRNA) a una concentración de 100 nM. Incubar durante 30 min a 37 ° C por siRNA o por el tiempo necesario para la modificación solicitada.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lavan las células dos veces en 500 μl de medio de cultivo.</li>
	<li>Centrifugar a 300 x g durante 5 minutos y resuspender las células en 10 μl de medio de cultivo.</li>
	<li>Los dos componentes celulares de la piscina (Paneth o Lgr5+ células) 20 μl volumen total y centrifugar a 300 x g durante 5 min a TA.</li>
	<li>Co incubar el Paneth y células de Lgr5+ durante 10 min a TA.</li>
	<li>Extraiga 10 μl del sobrenadante y deje un menisco de líquido para asegurarse para no aspirar el sedimento celulares.</li>
	<li>Añadir 30 μl de reconstituido la membrana basal a las células para un volumen total de 40 μl, resuspender las células y de la placa en una placa bien 96 precalentado. Después de 10 min, añadir 200 μL de medio completo (véase la Tabla de materiales). Medio de cambio cada 48 h.</li>
	<li>Cuenta de multiplicidad de organoide en día 5.</li>
</ol>

<ol><li>Barker, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+stem+cells+in+small+intestine+and+colon+by+marker+gene+Lgr5%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of stem cells in small intestine and colon by marker gene Lgr5.</a> Nature. 449, 1003-1007 (2007).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+constitute+the+niche+for+Lgr5+stem+cells+in+intestinal+crypts%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts.</a> Nature. 469, 415-418 (2011).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Lgr5+stem+cells+build+crypt-villus+structures+in+vitro+without+a+mesenchymal+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche.</a> Nature. 459, 262-265 (2009).</li>
<li>Clevers, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Development+and+Disease+with+Organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Modeling Development and Disease with Organoids.</a> Cell. 165, 1586-1597 (2016).</li>
<li>Cantrell, M. A., Kuo, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoid+modeling+for+cancer+precision+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Med%22%5BJournal%5D)">Organoid modeling for cancer precision medicine.</a> Genome Med. 7, 32(2015).</li>
<li>Schewe, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Phospholipases+A2+Are+Intestinal+Stem+Cell+Niche+Factors+with+Distinct+Roles+in+Homeostasis%2C+Inflammation%2C+and+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Secreted Phospholipases A2 Are Intestinal Stem Cell Niche Factors with Distinct Roles in Homeostasis, Inflammation, and Cancer.</a> Cell Stem Cell. 19, 38-51 (2016).</li>
<li>Roth, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paneth+cells+in+intestinal+homeostasis+and+tissue+injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury.</a> PLoS One. 7, e38965(2012).</li>
<li>Rodriguez-Colman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+metabolic+identities+in+the+intestinal+crypt+supports+stem+cell+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interplay between metabolic identities in the intestinal crypt supports stem cell function.</a> Nature. 543, 424-427 (2017).</li>
<li>Dow, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apc+Restoration+Promotes+Cellular+Differentiation+and+Reestablishes+Crypt+Homeostasis+in+Colorectal+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Apc Restoration Promotes Cellular Differentiation and Reestablishes Crypt Homeostasis in Colorectal Cancer.</a> Cell. 161, 1539-1552 (2015).</li>
<li>Yilmaz, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+in+the+Paneth+cell+niche+couples+intestinal+stem-cell+function+to+calorie+intake%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">mTORC1 in the Paneth cell niche couples intestinal stem-cell function to calorie intake.</a> Nature. 486, 490-495 (2012).</li>
<li>Igarashi, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((mTORC1+and+SIRT1+Cooperate+to+Foster+Expansion+of+Gut+Adult+Stem+Cells+during+Calorie+Restriction%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">mTORC1 and SIRT1 Cooperate to Foster Expansion of Gut Adult Stem Cells during Calorie Restriction.</a> Cell. , 436-450 (2016).</li>
</ol>

Los autores tienen ninguna competencia interés financiero u otros conflictos de intereses

El ORA permite el refinado análisis funcional de los dos componentes esenciales del nicho de células madre intestinales, es decir, Lgr5+ y células de Paneth. Este enfoque ha sido empleado previamente por nosotros y otros con ligeras modificaciones6,10,11. Aquí, presentamos el procedimiento ORA como un protocolo de laboratorio estandarizadas y reproducibles. También, nos informe sobre los efectos de la desregu...

El epitelio intestinal es el tejido más rápidamente renueva a sí misma en el cuerpo mamífero y, como tal, ha sido objeto de una gran cantidad de estudios dirigidos a la identificación y caracterización funcional de las células madre adultas que residen en la parte inferior de la cripta de Lieberkühn, destinado por la expresión del gen Lgr5 y dependiente de señales Wnt canónico1. En particular, las células de vástago Lgr5+ flanqueadas y apoyadas por las células del nicho especializado, es decir, las células de Paneth, que también dependen de Wnt de señalización para su maduración2. Juntos, estos dos tipos celulares subyacen autorenovación de la guarnición epitelial intestinal y mantener el equilibrio homeostático diario: Lgr5+ células rápidamente se dividen y dan lugar a progenitoras y más especializan intestinal epitelial células; Células de Paneth proporcionan factores del nicho fundamental (p. ej., Dll1, Wnt3, EGF) para Lgr5+ células madre2. La capacidad de las criptas intestinales cuando plateado ex vivo para formar estructuras organizadas y renueva a sí misma llama organoides o "mini-entrañas", se ha explotado como una herramienta experimental para proporcionar la penetración en procesos tales como la auto renovación y diferenciación en condiciones normales y patológicas incluyendo cáncer4. Se han establecido culturas organoide de varios tejidos, incluyendo el intestino, páncreas, hígado y riñón de ratón y muestras humanas4. El método de extracción y los factores de crecimiento empleados para el desarrollo de las culturas de estos organoides son específicas de tejido y diseñado para impulsar la diferenciación multilineal y mímico lo más cerca posible el original nicho de células madre en vivo. Organoides pueden tener aplicaciones potenciales incluyendo el tratamiento de enfermedades genéticas, la evaluación de eficacia terapéutica en el cáncer, el análisis de toxicidad de la droga o el estudio de la organogénesis in vitro5.
En general, la principal limitación de organoide culturas cuando establecido a partir de muestras de tejido es la falta de especificidad celular. Por ejemplo, organitas intestinales establecidas de criptas intestinales toda no permiten el análisis de los componentes celulares, englobado dentro de la fuente de tejido (por ejemplo, contienen criptas todo Lgr5+, Paneth, y células progenitoras).
Aquí, describimos un nuevo método, conocido como ORA, que combina las ventajas de las culturas organoide intestinal con el análisis funcional de sus componentes más fundamentales, a saber, madre (Lgr5+) y células de nicho (Paneth). Esto se logra a través de la capacidad única de Paneth y células de Lgr5+ para asociar físicamente a otro cuando co incuban y dan lugar a organoides2,6,10. Aprovechando esta característica y tratados previamente los dos tipos celulares individualmente antes de lo que les permite reconstituir el organitas. Al hacerlo, cada componente de la célula puede estar expuesto a determinada droga, factor de crecimiento, inhibidor bioquímico, modificación genética o tratamiento químico antes de la reconstitución y la formación de organoide. Por lo tanto, usando el análisis ORA permitirá la determinación de si un determinado tratamiento farmacológico o modificación genética tiene un efecto específico sobre las células madre o sus contrapartes de nicho.

<table><tbody><tr><td>Advanced DMEM F12 *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>35050061</td><td>Concentración final: 10 mM</td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Concentración final: 1%</td></tr><tr><td>Hepes *Thermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>15630080</td><td>Concentración final: 10 mM</td></tr><tr><td>EGF murino recombinante *</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>PMG8041</td><td>Concentración final: 50 ng/ml</td></tr><tr><td>Recombinante murino Noggin *</td><td>Peprotech</td><td>250-38</td><td>Concentración final: 100 ng/ml</td></tr><tr><td>y27632 *</td><td>Sigma</td><td>Y0503</td><td>Concentración final: 10 &micro; M</td></tr><tr><td>Jagged-1 *</td><td>Anaspec Bio</td><td>AS-61298</td><td>Concentración final: 1 &micro; M</td></tr><tr><td>R-espondina murina recombinante *</td><td>R& Sistemas D</td><td>3474-RS-050</td><td>Concentración final: 1 mg/ml</td></tr><tr><td>Flexitube Solución génica siRNA APC</td><td>Qiagen</td><td>GS11789</td><td>Concentración final: 100 nM</td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>CD24 APC</td><td>Biolegend</td><td>101814</td><td></td></tr><tr><td>c-kit PE</td><td>Biolegend</td><td>105808</td><td></td></tr><tr><td>BV 421 CD31</td><td>Biolegend</td><td></td><td></td>102424</tr><tr><td>BV 421 CD45 Biolegend</td><td></td><td>103134</td><td></td></tr><tr><td>BV421 TER119</td><td>Biolegend</td><td>116234</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14180046</td><td></td></tr><tr><td>B6.129P2-Lgr5tm1(cre/ERT2)Cle/J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>008875</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de baja unión</td><td>Eppendorf</td><td>Z666548-250EA</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td></td></tr><tr><td>* La combinación de estos reactivos constituye el medio</td><td></td><td></td><td></td> de cultivo completo</tr></tbody></table>

el ensayo de reconstitución de organoides (ora) para el análisis funcional del tallo intestinal y las células del nicho

The Organoid Reconstitution Assay (ORA) for the Functional Analysis of Intestinal Stem and Niche Cells

El epitelio intestinal se caracteriza por un índice de rotación extremadamente rápida. En mamíferos, la guarnición epitelial toda se renueva dentro de los 4-5 días. Las células madre intestinales residen en la parte inferior de las criptas de Lieberkühn son asignadas por la expresión del gen Lgr5 y preservar la homeostasis a través de su característica alta tasa proliferativa1. A lo largo del intestino delgado, Lgr5+ las células madre están entremezcladas con células secretoras especializadas llamadas células de Paneth. Células de paneth secretan compuestos antibacterianos (por ejemplo, la lisozima y cryptdins/defensinas) y ejercen un papel que controlaba en la flora intestinal. Más recientemente, se ha descubierto una nueva función para las células de Paneth, es decir, su capacidad para proporcionar apoyo de nicho a células Lgr5+ a través de varios ligandos claves como Wnt3, EGF y Dll12.
Cuando aislado ex vivo y cultivadas en presencia de factores específicos de crecimiento y componentes de la matriz extracelular, criptas intestinales toda dan lugar a larga vida y uno mismo-renovar estructuras 3D llamado organitas muy parecidos a la cripta vellosidad arquitectura epitelial del intestino adulto3. Organoide culturas, cuando estableció de criptas enteras, permiten el estudio de auto renovación y diferenciación del nicho de células madre intestinales, aunque sin abordar la contribución de sus componentes individuales, es decir, la Lgr5+ y Células de Paneth.
Aquí, describimos un nuevo enfoque para el análisis de organoides que se aprovecha de la capacidad de Paneth y células Lgr5+ para asociarse y formar organoides cuando cultivadas conjuntamente. Este enfoque, aquí denominado "ensayo de reconstitución de organoide" (ORA), permite la modificación genética y bioquímica de Paneth o Lgr5+ células, seguidas de reconstitución en organoides. Como tal, permite el análisis funcional de los dos componentes principales del nicho de células madre intestinales.

El ensayo de reconstitución de organoide permite el análisis funcional separado de los componentes esenciales del nicho y células del epitelio intestinal, aquí demostrada por ARN interferente pequeño (siRNA) del gene del Apc .
Para lograr este objetivo, primero utilizamos fluorescente celular activada (FACS) para separar células Lgr5+ 8000 y 6000 células de Paneth de ratones C57BL6/J endogámicas de c...

Organoide intestinal culturas establecen de criptas todas y no permite el análisis de auto renovación y diferenciación de una manera específica de la célula. Este protocolo describe reconstitución de potencia ordenada (Lgr5+) y lugar (Paneth) células, que dan lugar a organoides permitiendo su modificación bioquímica y genética previa y análisis funcional.

El ensayo de reconstitución de organoides (ORA) para el análisis funcional del tallo Intestinal y las células del nicho

The intestinal epithelium is characterized by an extremely rapid turnover rate. In mammals, the entire epithelial lining is renewed within 4 - 5 days. ...

El objetivo general del ensayo de reconstitución de organoides es el análisis funcional de los dos componentes principales del nicho de células madre intestinales Lgr5 positivo en las células de Paneth a través de su modificación genética o bioquímica seguida de la reconstitución en organoides que se renuevan automáticamente. Este método permite abordar cuestiones específicas clave en el campo de las células madre intestinales, como la modificación genética o bioquímica en células madre y de nicho. La principal ventaja de esta técnica es que, a diferencia de otros ensayos que utilizan criptas completas, emplea células madre y de nicho clasificadas, lo que permite el análisis específico del tipo de célula.La demostración en video de este método es fundamental, especialmente cuando se trata de los pasos de disociación de tejidos y manejo de células. Si no se ejecutan correctamente, estos pasos conducirán a una mala viabilidad de la celda, especialmente después de la clasificación de hechos. Comience este procedimiento con la preparación de los materiales y el sacrificio de un ratón Lgr5 sobre un fondo C57BL/6J como se describe en el protocolo de texto.Disecciona el peritoneo longitudinalmente con unas tijeras. Sujeta el estómago con las pinzas y córtalo transversalmente por la mitad con unas tijeras intestinales a partir de este punto. Saque el intestino y colóquelo en una placa de Petri que contenga PBS.Comience colocando la punta roma en el estómago y empújela suavemente a través del píloro. Proceda cortando con las tijeras y tirando con las pinzas. Una vez abierto longitudinalmente todo el intestino delgado, lávelo en PBS frío sosteniéndolo con las pinzas y enjuagándolo suavemente en la solución de PBS con movimientos en forma de U.Una vez que se hayan eliminado todos los restos de heces, proceda a aplanar el intestino en una tabla de cortar, con el lado lumenal hacia arriba. El lado lumenal es fácilmente reconocible por la ausencia de vasos sanguíneos y por su aspecto pálido en comparación con la parte externa. Con un portaobjetos de vidrio, retire suavemente las vellosidades raspando el intestino aplanado.Realice el paso dos veces a lo largo de toda la longitud del tejido. Luego, corte el intestino delgado con una cuchilla quirúrgica estéril en pedazos de dos a cinco milímetros. Coloque los fragmentos del intestino delgado en un tubo de 50 mililitros que contenga 10 mililitros de PBS helado.Limpie los fragmentos de tejido, eliminando las impurezas restantes, pipeteándolos hacia arriba y hacia abajo en el PBS. Deseche el sobrenadante y repita el paso hasta que el PBS esté completamente limpio. A continuación, agregue 15 mililitros de PBS frío para llevar el volumen final total de PBS a 25 mililitros.Añadir dos milimolares de EDTA e incubar durante 45 minutos en un rodillo a cuatro grados centígrados. Después de desechar el PBS EDTA, agregue 10 mililitros de PBS y separe las criptas pipeteando bruscamente los fragmentos de tejido hacia arriba y hacia abajo. Luego, recoge el sobrenadante.Repita este paso cuatro veces. Agregue medio de cultivo para alcanzar un volumen final de 50 mililitros. Granular las células por centrifugación.Finalmente, vuelva a suspender el pellet en 10 mililitros de medio de cultivo antes de peletizar las criptas por centrifugación. Para la preparación de una sola célula, primero deseche el sobrenadante de las criptas peletizadas y vuelva a suspenderlas en un mililitro de enzimas similares a la tripsina junto con 50 microlitros de DNasa. Incubar las células en un baño de agua a 32 grados centígrados durante dos minutos.Después de agregar 10 mililitros de medio de cultivo, disocie las criptas en células individuales pipeteando bruscamente hacia arriba y hacia abajo al menos cinco veces. Filtre la solución a través de un colador de 40 micras para eliminar los grumos y otras impurezas. Luego, granule las celdas individuales a 300 veces la gravedad durante cinco minutos.Para la citometría de flujo, vuelva a suspender el pellet en un mililitro de una solución salina tamponada de X Hank con un 2% de suero fetal de vaca por cada millón de células. A la suspensión celular, agregue anticuerpos marcados con Brilliant Violet 421 para el marcador de linaje CD31, CD45 y Ter119 a una concentración de uno a 100. Además, agregue anti-CD24 APC y anti-CD117 PE a una concentración de uno a 250.Después de 30 minutos, clasifique las células madre Lgr5 positivas y las células de Paneth en tubos separados de baja unión. Centrifugar las celdas clasificadas a 300 veces la gravedad durante cinco minutos. Luego, resuspenda las células en 100 microlitros de medio con los componentes descritos en el protocolo de texto.Para tratar las células, utilice cinco microlitros de reactivo de transfección mediado por liposomas en un volumen total de 100 microlitros de medio de cultivo y ARN interferente pequeño a una concentración de 100 nanomolares. Incubar las células durante 30 minutos a 37 grados centígrados para el ARN interferente pequeño, o durante el tiempo necesario para la modificación elegida. Lavar las células dos veces en 500 microlitros de medio de cultivo.Después de centrifugar las células a 300 veces la gravedad durante cinco minutos, vuelva a suspenderlas en 10 microlitros de medio de cultivo. A continuación, agrupe los dos componentes celulares en un volumen total de 20 microlitros antes de centrifugar a 300 veces la gravedad durante cinco minutos a temperatura ambiente. Coincubar las células positivas de Paneth y Lgr5 durante 10 minutos a temperatura ambiente.Retire 10 microlitros del sobrenadante y déjelos en un poco de líquido para evitar aspirar la pelletización de la célula. Luego, agregue 30 microlitros de membrana basal reconstituida a las células para un volumen total de 40 microlitros. Vuelva a suspender las células y colóquelas en una placa precalentada de 96 pocillos.Después de 10 minutos, agregue 200 microlitros de medio completo. Cambie el medio cada 48 horas. Finalmente, cuente la multiplicidad de organoides en el día cinco.La pequeña eliminación mediada por ARN interferente del gen APC murino en células madre Lgr5 positivas y la activación resultante de la vía de señalización canónica Wnt/beta-catenina afecta positivamente a la multiplicidad de organoides en comparación con sus homólogos no tratados o el control de secuencia codificada. La constitución de la activación de Wnt también rescata el requerimiento de células de Paneth como se informó anteriormente. Además, estos organoides aparecen como esferas huecas, un fenotipo bien descrito para los organoides mutantes de APC o estimulados por Wnt cuando se comparan con la morfología de los obtenidos de los dobletes de células Paneth-Lgr5.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco horas si se realiza correctamente. Al intentar esta técnica, es importante seguir todos los pasos y tiempos de incubación. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo extraer la cripta intestinal, preparar una digestión de una sola célula y reconstituir células madre y de nicho para generar organoides.Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de las células madre intestinales diseccionaran los efectos específicos de las células madre o de nicho en el intestino delgado o el intestino grueso del ratón. Aunque este método se ha establecido para el análisis funcional del nicho de células madre intestinales, también se puede aplicar a otros nichos de células madre somáticas como la glándula mamaria o el folículo piloso. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar experimentos adicionales para analizar la expresión de proteínas del genoma en los organoides, como QPCR o Western blot.

the-organoid-reconstitution-assay-ora-for-functional-analysis

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

En este protocolo de vídeo damos una explicación paso a paso de la transducción lentiviral en organoides del epitelio intestinal primario y del procesamiento y análisis posterior de estos cultivos mediante RT-PCR cuantitativo, microarrays de ARN e inmunohistoquímica.

Un protocolo para la de Lentiviral Transducción y Análisis de Aguas abajo de Intestinal organoides

Aquí, se describe un protocolo para la cosecha, mantener y tratar de ratón pequeñas organoides intestinales con patrones patógenos asociados moleculares (PAMPs) y Listeria monocytogenes, así como énfasis en la expresión génica y las técnicas de normalización adecuados para las proteínas.

los<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura y Reconocimiento de Patrones receptor de estimulación de ratón intestinal organoides

Aquí describimos una técnica para cuantificar la integridad de la barrera de los pequeños organoides intestinales. El hecho de que el método se base en organoides vivos permite la investigación secuencial de diferentes sustancias moduladoras de la integridad de la barrera o combinaciones de las mismas de una manera resuelta en el tiempo.

Investigación de la ruptura de la barrera intestinal en los organoides vivos

Este protocolo permite la diferenciación de células pluripotentes humanas en organoides intestinales. El protocolo imita el desarrollo humano normal mediante la diferenciación de células en una población de endodermo definitivo, endodermo del intestino posterior y luego epitelio intestinal. Esto hace que el protocolo sea adecuado para estudiar tanto el desarrollo intestinal como las aplicaciones de modelización de enfermedades.

Generación de organoides intestinales derivados de hiPSC para aplicaciones de modelización del desarrollo y de enfermedades

Aquí, describimos la preparación de monocapas epiteliales intestinales derivadas de organoides humanos para estudiar la función de barrera intestinal, la permeabilidad y el transporte. Como los organoides representan la respuesta original del tejido epitelial a los estímulos externos, estos modelos combinan las ventajas de la capacidad de expansión de las líneas celulares y la relevancia y complejidad del tejido primario.

Monocapa epitelial derivada de organoides: un modelo in vitro clínicamente relevante para la función de barrera intestinal

Los organoides intestinales derivados de biopsias y las tecnologías de organ-on-a-chips se combinan en una plataforma microfisiológica para recapitular la funcionalidad intestinal específica de la región.

Combinación de organoides humanos y tecnología organ-on-a-chip para modelar la funcionalidad específica de la región intestinal

El presente protocolo describe el establecimiento de un sistema organoide colónico murino para estudiar la actividad y el funcionamiento de las células madre colónicas en un modelo knockout de claudina-7.

Cultivo tridimensional de criptas colónicas murinas para estudiar la función de las células madre intestinales ex vivo

Describimos un protocolo para aislar criptas murinas del intestino delgado y cultivar organoides 3D intestinales de las criptas. Además, describimos un método para generar organoides a partir de una sola célula madre intestinal en ausencia de un nicho celular subepitelial.

El cultivo 3D de organoides a partir de criptas intestinales murinas y una sola célula madre para la investigación de organoides

Aquí, presentamos un protocolo para generar organoides intestinales de ratas y usarlos en varias aplicaciones posteriores. Las ratas suelen ser un modelo preclínico preferido, y el robusto sistema de organoides intestinales satisface la necesidad de un sistema in vitro para acompañar los estudios in vivo .

Generación y manipulación de organoides intestinales de rata

Las células madre perivasculares (PSC) son una nueva clase de madre para la regeneración celular del tejido óseo similares a las células madre mesenquimales (MSC). PSC puede ser aislado por FACS (fluorescencia de células activadas clasificación) a partir de tejido adiposo adquirido durante los procedimientos estándar de liposucción, entonces se combinan con una osteoinductivo andamio para lograr la formación de...

El uso de las células estaminales perivasculares para la regeneración ósea

Aprende el ensayo de reconstitución de organoides para analizar células madre Lgr5+ y células de nicho Paneth mediante modificaciones genéticas o bioquímicas. Este método permite estudios específicos por tipo celular.

El ensayo de reconstitución de organoides (ORA) para el análisis funcional del tallo Intestinal y las células del nicho

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