Gran volumen, iluminación conductualmente relevantes para Optogenetics en Primates no humanos
3 de octubre de 2017
Se presenta un protocolo para construir un iluminador penetrante de tejido para ofrecer luz sobre grandes volúmenes con diámetro mínimo.
El objetivo general de este protocolo es crear un iluminador de tejidos de gran volumen que se adapte bien a las manipulaciones optogenéticas en primates no humanos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como ¿cómo contribuyen las poblaciones de neuronas en las diferentes regiones del cerebro al comportamiento y cómo pueden los patrones de activación neuronal temporalmente específicos en una región afectar a otra región? La principal ventaja de esta técnica es que utiliza la luz y, por lo tanto, permite la manipulación optogenética de grandes volúmenes cerebrales relevantes para el comportamiento con un daño tisular mínimo.
Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la medicina traslacional debido a las similitudes entre los cerebros de los primates humanos y no humanos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se necesita algo de práctica para aplicar la cantidad adecuada de presión al tirar de estas fibras. Para comenzar este procedimiento, use un par de tijeras afiladas para cortar una sección de fibra óptica plástica de 250 micrómetros de diámetro que sea al menos 10 centímetros más larga que la longitud total deseada del iluminador.
A continuación, retire de 15 a 20 centímetros de cubierta de polietileno de un extremo de la fibra óptica de plástico con un pelacables de calibre 22. Luego, asegure los tres a cinco centímetros más distales del extremo pelado de la fibra en una abrazadera de tornillo de banco. Sostenga el extremo encamisado de la fibra tenso con una mano, con un tirón constante y constante.
La fibra debe estar paralela al suelo, alejada del tornillo de banco. Mantenga esta tensión constante en la fibra durante el calentamiento y el enfriamiento, de modo que la fibra permanezca recta y tensa a medida que se adelgaza. Usando la configuración más baja de una pistola de calor de doble temperatura, caliente la sección pelada de la fibra hasta que se adelgace a un diámetro de 60 a 100 micrómetros, o aproximadamente el diámetro de un cabello humano.
Mantenga la tensión constante en la fibra mientras deja que se enfríe. Si no se mantiene la tensión o se sobrecalienta la fibra, es posible que la fibra se enrosque o se rompa. Para ayudar a mantener una tensión constante en la fibra mientras la calientas, usa tu mano no dominante para que no tengas que soltarla cuando estés usando la pistola de calor.
Además, puede envolver suavemente la fibra alrededor de la palma de la mano para obtener un agarre aún mejor. Una vez que la fibra se haya enfriado por completo y se haya alcanzado el diámetro deseado, pellizque la fibra a tres centímetros del punto más estrecho en ambos lados. Con un tirón rápido y brusco a lo largo del eje de la fibra, separe los lados para crear una punta cónica.
Luego, examine la punta cónica a baja potencia bajo un microscopio de disección. Si la punta es bifurcada o rizada, desecha la fibra. Incluso con mucha práctica, alrededor de un tercio de las fibras tendrán puntas bifurcadas o rizadas.
Simplemente desechamos esas fibras en lugar de tratar de repararlas, ya que es muy rápido y económico sacar otra. Prepárese para grabar la punta cónica colocando un trozo de cinta de laboratorio cerca del extremo de la punta, dejando expuesta la longitud deseada de la punta. Aquí quedan expuestos los últimos cinco milímetros.
La cinta protege la fibra del grabado por encima de la longitud deseada de emisión de luz. Después de eso, doble un pequeño cuadrado de hoja de carburo de silicio de cinco micrómetros entre el pulgar y el índice. Coloque la punta de la fibra entre los dos lados de la hoja de lapeado y grabe suavemente la fibra con pequeños movimientos circulares.
Gire con frecuencia la fibra para que todos los lados queden grabados de manera uniforme. A continuación, retire unos cinco milímetros de la cubierta de polietileno del extremo opuesto del iluminador con un pelacables de calibre 22. Luego, corte el extremo opuesto plano con un cuchillo caliente para alisar la superficie.
Coloque un conector en el extremo del iluminador opuesto a la punta grabada. Esto permite que el iluminador se conecte a un cable óptico o láser. Después, pula el extremo opuesto con láminas de lapeado sucesivamente más finas.
Posteriormente, inserte el extremo opuesto plano en una férula de acero inoxidable de 260 micrómetros de diámetro interior hasta que quede al ras con el extremo de la férula. Confirme visualmente que el extremo opuesto está pulido suave y uniformemente con un microscopio de fibra. Pega la férula verticalmente en el borde de la mesa con la abertura más pequeña de la férula apuntando hacia abajo.
Luego, llene una jeringa de un mililitro con epoxi plástico y coloque una aguja roma de calibre 18 en la jeringa. Después de esto, use la aguja para aplicar epoxi hacia abajo en la férula. Llene la férula completamente con epoxi.
Inserte la fibra en la férula de modo que quede al ras con la parte inferior de la férula. Si es necesario, limpie el exceso de epoxi de la superficie pulida de la fibra con una toallita húmeda sin pelusa antes de secar. En este paso, prepare un microdrive de torre antes de cada sesión de prueba.
A continuación, fije un tubo guía de calibre 25 con una punta biselada a la abrazadera inferior de la transmisión. Fije el iluminador de gran volumen en la abrazadera superior de la misma unidad. Esta abrazadera está unida al motor de accionamiento.
Luego, pase el iluminador de gran volumen a través del tubo guía completamente y confirme que la punta del iluminador se extienda más allá de la punta del tubo guía. Alternativamente, se puede aplicar cinta de laboratorio a la fibra para que la cinta, en lugar de la fibra en sí, quede sujeta, para proteger la fibra. A continuación, sumerja el tubo guía y el iluminador en una solución antiséptica para la esterilización.
Coloque una rejilla esterilizada personalizada con un espaciado de orificios de un milímetro dentro de la cámara limpia y asegúrela en una orientación preespecificada con el tornillo en el costado de la cámara. Retraiga el iluminador esterilizado del tubo guía tirando del iluminador hacia arriba con pinzas romas estériles. La punta del iluminador debe estar de cinco a 10 milímetros por encima de la punta del tubo guía.
Fije el microdrive al soporte y coloque el tubo guía en el orificio de la rejilla de destino. A continuación, baje la etapa de microaccionamiento hasta que el tubo guía esté justo a través del nivel de la duramadre. Al mismo tiempo, baje el iluminador manualmente con pinzas estériles.
Si hay alguna resistencia, retraiga el iluminador de cinco a 10 milímetros, espere 10 minutos y vuelva a intentarlo. Si todavía hay resistencia en el segundo intento, retraiga la punta del iluminador en el tubo guía, baje el tubo guía 0,25 milímetros y vuelva a intentarlo. Conecte la férula en el otro extremo del iluminador a la configuración óptica más grande o al láser.
Esta figura muestra que las tasas de error aumentaron significativamente con la iluminación. Y los gráficos rasterizados aquí muestran la inhibición de las neuronas que abarcan el grosor de 2,5 milímetros de la corteza. Y el potencial de campo local que muestra el artefacto de luz que abarca 4,5 milímetros.
Una vez dominado, se puede construir un iluminador de gran volumen utilizando esta técnica en 10 a 15 minutos, más el tiempo de secado epoxi. La calibración agrega otra media hora más o menos, por lo que para maximizar la eficiencia, generalmente fabricamos varios iluminadores a la vez. Al asistir a este procedimiento, es importante recordar que muchos de los iluminadores no cumplirán con los estándares de control de calidad.
Está bien. Si no pasan la inspección de la punta, los descartamos. Pero si fallan la calibración, generalmente los volvemos a pulir y repetimos la calibración.
Después de su desarrollo, esta técnica ayudó a allanar el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia utilizaran la optogenética para suprimir la activación neuronal y modular el comportamiento en primates no humanos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir un iluminador de tejido de gran volumen.
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Resumen
Este protocolo describe la construcción de un iluminador que penetra en el tejido, diseñado para manipulaciones optogenéticas en primates no humanos. La técnica tiene como objetivo iluminar grandes volúmenes cerebrales minimizando el daño tisular, facilitando así la investigación sobre el comportamiento neuronal y las interacciones.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Optogenética
- Neurobiología
Antecedentes
- Comprender las poblaciones neuronales es fundamental para la neurociencia.
- La optogenética permite un control preciso de la actividad neuronal.
- Los modelos en primates no humanos son relevantes para la medicina traslacional.
- Minimizar el daño en el tejido es esencial para prácticas de investigación éticas.
Objetivo del estudio
- Crear un iluminador de gran volumen para estudios de optogenética.
- Investigar cómo diferentes regiones cerebrales contribuyen al comportamiento.
- Explorar el impacto de los patrones de disparo neuronal en distintas regiones.
Métodos Utilizados
- Cortar un segmento de fibra óptica plástica a la longitud deseada.
- Aplicar la presión adecuada al tirar de las fibras.
- Usar tijeras afiladas para cortes precisos.
- Montar el iluminador para una entrega óptima de luz.
Resultados principales
- El iluminador entrega eficazmente luz a grandes volúmenes cerebrales.
- Se logra un daño tisular mínimo durante el procedimiento.
- Facilita la manipulación optogenética en estudios conductuales.
- Proporciona información sobre las interacciones neuronales y los comportamientos.
Conclusiones
- El protocolo mejora las capacidades de la investigación optogenética.
- Tiene implicaciones significativas para comprender la función cerebral.
- Estudios futuros pueden aprovechar esta técnica para la investigación traslacional.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la manipulación optogenética de volúmenes cerebrales grandes y relevantes para el comportamiento en primates no humanos con daño tisular mínimo, apoyando la investigación en neurociencia traslacional. Al entregar luz en volúmenes tisulares de ~10 mm³, este método conecta la validación de dianas preclínicas y el fenotipado conductual en un modelo filogenéticamente relevante. El enfoque reduce el riesgo biológico en la desactivación de dianas al permitir la interrogación a nivel de circuito con una mayor especificidad espacial en comparación con las fibras ópticas convencionales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar las contribuciones de poblaciones neuronales al comportamiento a través de circuitos cerebrales distribuidos.
- Valor operativo: Facilita la validación causal de objetivos mediante modulación optogenética temporalmente precisa en contextos etológicamente relevantes.
- Valor predictivo: Aumenta la confianza en el mecanismo objetivo al vincular patrones de actividad neuronal con resultados conductuales en un modelo predictivo transnacional.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Proporciona un sistema estandarizado de entrega de luz para una dosificación optogenética consistente entre sesiones experimentales.
- Valor operativo: Facilita ensayos conductuales reproducibles mediante una iluminación estable y de gran volumen, sin las limitaciones del acoplamiento con electrodos.
- Preparación para ensayos: Permite un control optogenético de alta fidelidad en sujetos libres de movimiento, apoyando el cribado conductual longitudinal.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad traslacional: Aprovecha las similitudes anatómicas y fisiológicas entre los cerebros de primates no humanos y humanos para mejorar la validez predictiva del acoplamiento al blanco.
- Reducción de riesgos preclínicos: Permite evaluar los efectos de la modulación del blanco sobre comportamientos complejos relevantes para los modelos de enfermedades neuropsiquiátricas.
- Avance ajustado al riesgo: Apoya las decisiones de continuar o no continuar al demostrar la eficacia de la modulación del blanco en una especie girocéfala con comportamiento complejo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento al permitir la validación de objetivos a nivel de circuito después de la identificación inicial del objetivo y antes de la optimización del fármaco líder, particularmente para objetivos del SNC que requieren confirmación del fenotipo conductual.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la interrogación basada en hipótesis de circuitos neuronales implicados en comportamientos relacionados con enfermedades.
- Selección: Permite la perturbación optogenética estandarizada en ensayos conductuales para la validación del efecto de compuestos.
- Análisis: Genera lecturas cuantificables de comportamiento y electropisiológicas (por ejemplo, tasas de error, supresión del disparo neuronal, artefactos de potencial de campo local) para evaluar la interacción con el objetivo.
- Investigación Traducional: Conecta la modulación del objetivo molecular con resultados conductuales a nivel de sistemas en un modelo con alta relevancia traslacional para la cognición humana.
- Reutilización Empresarial: Representa una plataforma escalable para uso repetido en múltiples objetivos y paradigmas conductuales tras la fabricación inicial y control de calidad.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al permitir el control específico por tipo celular sobre grandes poblaciones neuronales durante el comportamiento.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad mediante procedimientos estandarizados de fabricación, calibración de control de calidad y esterilización.
- Valor estratégico: Disminuye el riesgo en el avance de objetivos al proporcionar evidencia causal de las relaciones entre objetivos y comportamientos en un modelo preclínico.
- Impacto en el portafolio: Informa la priorización de objetivos ajustada al riesgo al validar la relevancia funcional de los objetivos en dominios conductuales complejos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas microquirúrgicas, manejo de fibras ópticas y procedimientos estériles para la implantación neural.
- Depende de instrumentación especializada, incluyendo microposicionadores, tubos guía, cámaras de esterilización y sistemas de acoplamiento láser.
- Necesita estandarización entre equipos multidisciplinarios de neurociencia, ingeniería y cuidado animal para la producción y uso consistente de iluminadores.
- Incluye consideraciones de adaptación para diferentes profundidades objetivo (estructuras superficiales frente a profundas) y volúmenes de iluminación según los objetivos experimentales.
- Comprende limitaciones prácticas, como tasas de éxito variables en el estirado de fibras y la formación de puntas, lo que requiere fabricación por lotes y cribado de control de calidad.
