Name: Gran volumen, iluminación conductualmente relevantes para Optogenetics en Primates no humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-03T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Aprende a construir un iluminador de tejido de gran volumen para optogenética en primates no humanos. Este método permite manipular volúmenes cerebrales extensos con mínimo daño tisular, facilitando el estudio de poblaciones neuronales y su contribución al comportamiento en neurociencia.

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LCA reconoce la financiación de una beca de la NDSEG, la GRFP NSF y los amigos del Instituto McGovern. EP reconoce financiación el Harry y Eunice Nohara UROP fondo, la clase del MIT de 1995 UROP fondo y el fondo de la UROP de MIT. ESB reconoce fondos del NIH 03A1 2R44NS070453 el Premio de Harvey del IET y el Premio de Fundación Robertson de células madre de Nueva York. RD reconoce la financiación de los NIH EY017292. Michael Williams ayudó el equipo para organizar y reunir suministros antes de la filmación.

Nota: todos los procedimientos animales estaban de acuerdo con las directrices de los NIH y fueron aprobados por el Instituto de Massachusetts de tecnología Comité de cuidado Animal.
 1. iluminador fabricación <ol><li>Use un par de tijeras afiladas para cortar un tramo de 250 μm de diámetro fibra óptica de plástico que por lo menos 10 cm de largo mayor que el deseado iluminador total.</li>
	<li>Sacar 15-20 cm de chaqueta de polietileno de un extremo de la fibra óptica de plástico con un pelacables 22 calibre.</li>
	<li>Garantizar la distal más 3-5 cm del extremo pelado de la fibra en una abrazadera de tornillo de banco mesa.</li>
	<li>Sujete el extremo con forro de la fibra tensa con una mano con un tirón constante constante. La fibra debe estar paralela al piso, perpendicular a la prensa. Mantener esta tensión constante en la fibra durante el calentamiento y enfriamiento (pasos 1.5 y 1.6 abajo) para que la fibra quede recta y tensa como diluye.</li>
	<li>Utilizando la posición más baja de una pistola de calor de doble temperatura (570/1.000 ° F), calentar la sección pelada de la fibra hasta que se adelgaza a un diámetro de 60-100 μm, o sobre el diámetro de un cabello humano.</li>
	<li>Mantener la tensión constante de la fibra permitiendo la fibra que se enfríe. Falta de mantenimiento de tensión puede provocar la fibra rizar.</li>
	<li>Confirmar el diámetro de la punta adelgazada bajo un microscopio de disección. Alternativamente, uno puede utilizar pinzas.
	<ol><li>Si la fibra no es lo suficientemente delgada, repita los pasos 1.4 por 1.6 según sea necesario para alcanzar el diámetro de la punta deseada.</li>
		<li>Opcional si vuelve a tirar, ponga una marca pequeña en la porción más estrecha de la fibra si se calentarán otra vez para que el centro de la pistola de calor apunta a la parte más estrecha de la fibra.</li>
		<li>Si la fibra es demasiado delgada, volver a empezar.</li>
	</ol></li> <li>Una vez que la fibra se haya enfriado por completo y se ha conseguido el diámetro deseado, apriete la fibra 3 cm desde el punto más estrecho a cada lado. Con un rápido y agudo tire del eje de la fibra, separar los lados para crear una punta cónica.</li>
	<li>Examinar la punta cónica bajo una potencia baja (por ejemplo, 4 X) en el microscopio de disección. Si la punta está bifurcada o rizada ( figura 1f), descartar la fibra de.</li>
	<li>Preparación para grabar la punta cónica colocando un trozo de cinta de laboratorio cerca del extremo de la punta, dejando lo últimos 5 mm expuesto. La cinta protege la fibra del aguafuerte sobre la longitud deseada de la emisión de luz. Esta longitud de la punta fue seleccionada basado en el grueso de la corteza de primates en la región de destino. Pudiera estar expuesta una longitud más larga o más corta dependiendo de la longitud deseada de la iluminación. Si desea una longitud de punta de grabado de pistas diferentes, el borde de la cinta de laboratorio puede ser acercado a o más lejos de la punta cónica.</li>
	<li>Plegar un cuadrado pequeño (~ 1 x 2 pulgadas) de 5 μm carburo de silicio pulido hoja entre los dedos pulgar e índice. Coloque la punta de la fibra entre los dos lados de la hoja de pulido y grabado suavemente la fibra mediante pequeños movimientos circulares, como si un BB del balanceo entre el pulgar y el índice. Girar con frecuencia la fibra para que los lados están grabados uniformemente. Aparece la punta de la fibra &#8220; rugosa &#8221; a simple vista en las áreas que han sido grabadas, mientras que zonas no grabadas aparecen típicamente lisas.</li>
	<li>1.11 Repita el paso con un óxido de aluminio de 3 μm lapeado hoja.</li>
	<li>Colocar un conector en el extremo de la luz frente a la punta al ácido. Esto permite que el iluminador conectar un cable óptico o láser. 
	Nota: Este método difiere el método preferido para fijación de vidrio / fibras ópticas de sílice en las virolas. Porque la virola de metal es más duro que la fibra óptica de plástico, pulido de la fibra y la férula como una unidad después de pegado puede dañar el plástico de la fibra óptica como pequeños fragmentos de metal producido durante el proceso de pulido se pueden incrustar en fibra plana-hendida.
	<ol><li>Quitar unos 5 mm de la chaqueta de polietileno desde el lado opuesto del iluminador con un pelacables 22 calibre.</li>
		<li>Cortar el extremo opuesto con un cuchillo caliente para alisar la superficie.</li>
		<li>Pulir el extremo opuesto con lapeado sucesivamente más finas hojas: 0.3 μm, 5 μm, 3 μm y 1 μm.</li>
		<li>Insertar el plano opuesto extremo en una virola de acero inoxidable de diámetro interno de 260 μm hasta que quede a ras con el extremo del casquillo.</li>
		<li>Confirmar visualmente que el extremo opuesto se pule suavemente y uniformemente con un microscopio de fibra.</li>
		<li>Quitar la fibra de la férula y cintas la virola verticalmente sobre el borde de una mesa con la fibra apuntando hacia abajo.</li>
		<li>Llene una jeringa de 1 mL con epoxy plástico y coloque una aguja Roma de 18 calibre a la jeringa de.</li>
		<li>Utilice la aguja para aplicar epoxy abajo en la virola. Llenar completamente la virola con el epóxido.</li>
		<li>Inserte la fibra en el ferrule.</li>
		<li>Limpie cualquier exceso de epoxy de la superficie pulida de la fibra con un paño húmedo sin pelusa antes de secar, si es necesario. De lo contrario, epoxi sobrante puede eliminarse después de 12-24 h.</li>
		<li>Tienda la fibra suavemente hasta calibración y coloque un tapón sobre la férula.</li>
	</ol></li></ol> 2. Iluminador de calibración y Control de calidad Nota: estos métodos para la calibración de evaluación para no linealidad a diferentes distancias de la punta de la fibra de salida de luz. Desigual distribución de la luz resulta típicamente de un &#8220; lleno de baches &#8221; o &#8220; ondulado &#8221; cónico.
<ol><li>Crear un blindaje ligero diafragma para la parte superior de la esfera integradora utilizando absorbiendo luz hoja ( figura 2). 
	Nota: Use guantes cada vez que manejo la luz absorbente papel aluminio para evitar que la piel los aceites desde la creación de manchas que reflejan luz.
	<ol><li>Doblez a 2 &#8221; 4 &#8221; pieza de luz absorbente papel sobre sí mismo para formar un 2 &#8221; x 2 &#8221; Plaza. un método alternativo es cortar un 2 &#8221; x 2 &#8221; Plaza con una luz absorción lateral y una luz que refleja de lado (es decir, un lado de papel de aluminio estándar); sin embargo, el método de doblado es más seguro ya que proporciona un borde embotado para manejar el diafragma en el paso siguiente.</li> <li>doble cinta de laboratorio o con cinta aislante a lo largo de los bordes de la plaza para enlazar los bordes no doblado. Esto une los lados tanto protege contra cortes de bordes afilados.</li>
		<li>Perfore un agujero en el centro de la plaza con una aguja de 26 calibre.</li>
		<li>Quitar el tornillo grande en la tapa de la esfera de integración y cubrir la abertura con el diafragma. Coloque el agujero sobre el centro. Si el diafragma se creó con una absorción de luz y una luz que refleja el lado, coloque la luz absorbente lado arriba y la luz que refleja hacia abajo, hacia el interior de la esfera integradora. 
		Nota: Para evitar polvo y la suciedad entren en la esfera de integración y que el agujero de centrado, seguro el diafragma hacia el exterior de la esfera integradora con cinta lab.</li>
	</ol></li> <li>Medida de luz de salida a lo largo de la punta en otros 500 μm un micromanipulador o brazo estereotáctica y una esfera de Ulbricht. 
	Nota: Cuando el láser está en se deben usar gafas de seguridad de la longitud de onda adecuada.
	<ol><li>Conecte el extremo opuesto de la fibra de un láser o la luz de la fuente, pero no activan la luz todavía de la salida.</li>
		<li>Fijar el iluminador para un soporte estereotáctica (preferably con cinta de laboratorio) con la punta de 7-10 mm por debajo de la parte inferior del soporte del.</li>
		<li>Tornillo el titular estereotáxicas en el brazo estereotáctica</li>
		<li>Alinee la punta de la luz con el agujero en el centro del diafragma. Cero el instrumental quirúrgico cuando la punta está en el mismo nivel exacto que el diafragma.</li>
		<li>Girar apagado las luces de la habitación y cero la esfera integradora.</li>
		<li>Activar el láser (u otra fuente de luz) y medir la potencia total de la luz salida a través de la. 
		Nota: Utilizar la menor potencia posible para las pruebas de calibración.</li>
		<li>Baje la fibra 500 μm en el integrando esfera y repita el paso 2.2.6.</li>
		<li>Continuar bajando la fibra dentro de la esfera de integración y medir la salida de luz total en 500 μm incrementos hasta el apagado de niveles de potencia de luz total 
		PRECAUCIÓN: Total potencia de luz debe nivel una vez la punta toda la esfera. No continúe bajando la fibra más 1-2 mm más allá del grabado punta longitud. Si la punta entra en contacto con la parte inferior de la esfera de integración, pueden derretir o arruinar la esfera integradora.</li>
	</ol></li> <li>Confirmar una fibra uniforme grabada trazando total potencia de luz de salida como una función de hasta qué punto la fibra se ha reducido en la esfera de integración para confirmar linealidad.</li></ol>
 3. iluminación en Vivo
 Nota:, estos métodos se muestran usando un modelo de plástico en lugar de un primate no humano.
<ol><li>Implante se implantó una cámara de grabación de 25 mm de diámetro sobre el área cerebral de interés antes de la experimentación.</li>
	<li>Realizar anatómica resonancia magnética (RM) antes de la experimentación. Colocar una rejilla de encargo de la grabación en la cámara y llene con lubricante quirúrgico estéril para permitir la visualización de cuadrícula y determinación del nivel de las estructuras del cerebro dura y objetivo.</li>
	<li>Preparar una torre micro-coche antes de cada sesión de evaluación.
	<ol><li>Afijo abrazaderas de un tubo de guía de 25 calibre con punta biselada en el medio e inferior en la unidad. Dos pinzas sirven para garantizar que el tubo de guía recta. Dos de estas abrazaderas se pueden mover manualmente si lo desea. 
		Nota: El tubo guía puede ajustaron o soldado a las abrazaderas de.</li>
		<li>Fijar el iluminador de gran volumen en la abrazadera superior en la misma unidad. Esta abrazadera se une al motor.</li>
		<li>El iluminador de gran volumen a través del tubo guía del hilo de rosca totalmente y confirmar que la punta del iluminador se extiende más allá de la punta del tubo guía de. 
		Nota: La longitud del iluminador que se extiende pasado el extremo del tubo guía es igual a la distancia entre la dura y el margen inferior de la región del cerebro blanco, como determinada mediante MRI.</li>
		<li>Sumerja el tubo guía y el iluminador en una solución antiséptica (p. ej., clorohexidina) para esterilizar.</li>
	</ol></li> <li>Colocar una rejilla personalizada esterilizada dentro de la cámara limpia y fijarla en una orientación previamente especificada con un tornillo en el lado de la cámara. La rejilla que se muestra aquí tiene espacio de 1 mm; sin embargo, puede personalizar el espacio según sea necesario. 
	Nota: Esto debe ser idéntico a la red y orientación en la resonancia magnética anatómica.</li>
	<li>Garantizar el soporte de micro-coche estereotáctico en la cámara de grabación en una orientación predeterminada.</li>
	<li>Retraer el iluminador esterilizado del tubo guía tirando el iluminador usando pinzas estériles, romos. La punta del iluminador debe ser 5-10 mm por encima de la punta del tubo guía. 
	Nota: El iluminador se doblará hacia fuera entre el tubo guía y la abrazadera. Esto no dañará el iluminador flexible.</li>
	<li>Fijará la unidad micro al titular y coloque el tubo guía en el agujero de rejilla blanco.</li>
	<li>Baje la fase de impulsión micro hasta el tubo guía está sólo hasta el nivel de la duramadre. 
	Nota: Si lo desea, una segunda unidad de micro con un electrodo puede ser colocada en el escenario y baja en un agujero de red diferentes. El campo local potencial de este electrodo mostrará un artefacto de luz dependiente de la distancia, que puede utilizarse para confirmar la colocación iluminador.</li>
	<li>Trate de la parte inferior el iluminador manualmente con pinzas estériles.
	<ol><li>Si hay alguna resistencia, retraiga el iluminador 5 - 10 mm, esperar 10 minutos para permitir que el tejido y vuelva a intentarlo.</li>
		<li>Si todavía hay resistencia en el segundo intento, retraer la punta de iluminador en el tubo guía, bajo la guía del tubo de 0,25 mm e inténtelo de nuevo.</li>
		<li>Repetir hasta las diapositivas de iluminador a través del tubo guía sin ninguna resistencia.</li>
		<li>Baje el iluminador hasta que esté bien tenso. 
		PRECAUCIÓN: No empuje el iluminador con fuerza contra resistencia. En estos casos el tubo guía normalmente ha no penetró la dura completamente. Empujar con fuerza la fibra hará que se curva sobre sí mismo, evitando la fibra de entrar en el cerebro y posiblemente destruir la punta ( figura 1 g).</li>
	</ol></li> <li>Conecte el casquillo en el otro extremo del iluminador a la óptica más grande establecido o láser.</li>
	<li>Asegúrese de que la luz no es visible a los primates no humanos.
	<ol><li>Usar black out blindaje u hoja para abarcar completamente las grabación torres de absorción de luz.</li>
		<li>Colocar todas las conexiones ópticas en sobres protegidos de luz absorbente papel.</li>
		<li>Escudo de todos los cables de parche con cualquier luz absorbente papel o cinta aislante negra.</li>
		<li>Como precaución extra, poner un banco de diodo electroluminoso (LED) de la trampa del mismo color de luz utilizado en el experimento detrás de los primates no humanos y encender los indicadores LED continuamente a 2,5 Hz. Esto evita que los ojos ajuste completamente a la oscuridad. Si hubiera salida inadvertida de luz, esta luz intermitente ayudaría a evitar la fuga de servir como un disparador de comportamiento.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Jazayeri, M., Lindbloom-Brown, Z., Horwitz, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Saccadic+eye+movements+evoked+by+optogenetic+activation+of+primate+V1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Saccadic eye movements evoked by optogenetic activation of primate V1.</a> Nat Neurosci. 15 (10), 1368-1370 (2012).</li>
<li>Gerits, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetically+Induced+Behavioral+and+Functional+Network+Changes+in+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Optogenetically Induced Behavioral and Functional Network Changes in Primates.</a> Curr Biol. 22 (18), 1722-1726 (2012).</li>
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<li>Cavanaugh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optogenetic+inactivation+modifies+monkey+visuomotor+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Optogenetic inactivation modifies monkey visuomotor behavior.</a> Neuron. 76 (5), 901-907 (2012).</li>
</ol>

Mientras que optogenetic herramientas son ampliamente utilizados para el estudio de la enfermedad y la fisiología en roedores, el desafío técnico de iluminar los volúmenes grandes del cerebro limitó el uso de optogenetics en primates no humanos. Pionera en estudios en monos utiliza densidades de energía de luz grande (~ 100 mW/m2 a 20 W/mm2) para iluminar pequeños volúmenes, tal vez &#60; 1 mm3y efectos conductuales modestos reportados con opsins excitatorias de la corteza<sup class="xref...

Optogenetic herramientas, que permiten un control neuronal exacto milisegundo, impulsado por la luz son ampliamente utilizadas para estudiar la fisiología funcional y comportamiento en roedores e invertebrados. Sin embargo, desafíos técnicos limitó el uso de optogenetics en el cerebro de primates no humanos, que tiene un volumen ~ 100 x más grande que el cerebro de roedores 1.
Para facilitar la optogenetics estudios en primates no humanos, un iluminador fue diseñado para abordar dos objetivos concurrentes: iluminación de gran volumen y penetración mínimo daño. Los intentos anteriores para abordar uno de estos problemas vienen en la cara del otro. Paquetes de fibras se iluminan grandes volúmenes pero con mayor diámetro y, por lo tanto, daños2,3. Fibras de vidrio afilado reducen el daño de la penetración, pero estrecho foco luz a superficies de emisión de luz &#60; 100 μm2 4,5. Iluminación externa del cerebro a través de una ventana en la dura elude el reto de daños de penetración y puede permitir la iluminación de gran volumen, pero sólo puede ser utilizado para algunos superficiales cerebro áreas6.
Para crear un iluminador de gran volumen, de pequeño diámetro (Figura 1a), la punta de un plástico óptico de fibra es cónico y el núcleo y el revestimiento son grabadas (Figura 1bc). A diferencia de otras fibras afiladas que enfocar luz en un punto estrecho, el grabado permite que la luz escape uniformemente hacia fuera los lados de la punta, por lo tanto, distribución de luz ampliamente sobre un área grande (figura 1 de). Debido a daños de penetración son proporcional al diámetro de la penetración, este iluminador no tiene más daño de penetración que una fibra convencional, pero tiene &#62; 100 x la luz emitiendo luz superficie de área y ofrece más ampliamente con 1/100 la potencia de luz densidad en un cerebro fantasma (1.75% agarosa) (Figura 1e). Un modelo Monte Carlo (figura 1f) ilustra la diferencia de propagación de luz entre una fibra convencional y el iluminador de gran volumen cuando tienen densidades de energía de luz igual como su superficies de emisión de luz. Cada iluminador es calibrada individualmente usando una esfera integradora (Figura 2a, b) para asegurar la distribución lumínica a lo largo de la punta (figura 2C).
Este iluminador de gran volumen ha sido validado con la manipulación de optogenetic de comportamiento y de disparo neuronal en primates no humanos. La longitud de la punta de la fibra puede ser adaptada a cualquier área del cerebro y al mapa de campo receptivo individual de cada animal. El iluminador puede ser asociado con un electrodo de penetración para grabaciones neuronales que abarcan la longitud de la iluminación. Además, porque la fibra puede llevar cualquier color de la luz visible, puede ser asociado con cualquiera de las moléculas de optogenetic disponible disponibles.

<table><tbody><tr><td>Fibra óptica de plástico</td><td>Fibra óptica industrial</td><td>SK-10</td><td>250 micras de diámetro, línea Super Eska</td></tr><tr><td>Pelacables</td><td>Klein Tools</td><td>11047</td> Abrazadera de tornillo de <td>banco de calibre 22</td></tr><tr><td></td><td>Wilton</td><td>11104</td><td>Abrazadera de tornillo de banco de montaje en mesa genérica</td></tr><tr><td>Pistola de calor de doble temperatura</td><td>Milwaukee</td><td>8975-6</td><td>570 / 1,000 &deg; F</td></tr><tr><td>Marcador de laboratorio</td><td>VWR</td><td>52877</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>VistaVision</td><td>82027-156</td><td>Microscopio estereoscópico con luz incandescente doble, aumento de 2X/4X, disponible en VWR Cinta de</td></tr><tr><td>laboratorio</td><td>VWR</td><td>89097-972</td><td>Paquete de 4 de color violeta; sin embargo, el color de la cinta no importa Hoja de</td></tr><tr><td>lapeado de carburo de silicio</td><td>ThorLabs</td><td>LF5P</td><td>Grano de 5 micras, paquete de 10</td></tr><tr><td>Hoja de lapeado de óxido</td><td>de aluminio ThorLabs</td><td>LF3P</td><td>grano de 3 micras, paquete de 10</td></tr><tr><td>hojas de lapeado de óxido de aluminio</td><td>ThorLabs</td><td>LF1P</td><td>grano de 1 micra, paquete de 10</td></tr><tr><td>hojas de lapeado de alúmina calcinada</td><td>ThorLabs</td><td>LF03P</td><td>grano de 0,3 micras, paquete de 10</td></tr><tr><td>cuchillos calientes</td><td>Fibra óptica industrial</td><td>IF370012</td><td>60 vatios, servicio pesado</td></tr><tr><td>Alcance de inspección de</td> <td>fibraThorLabs</td><td>FS201</td><td>opcional</td></tr><tr><td>Férula de acero inoxidable</td><td>Fibra óptica de precisión</td><td>MM-FER2003SS-265</td><td>265 micras diámetro interior</td></tr> 1 <tr><td>mL jeringa</td><td>BD</td><td>14-823-30</td><td>La punta Luer-lok es preferible para reducir el riesgo de fugas, pero no es estrictamente necesaria</td></tr><tr><td>Epoxi plástico</td><td>Fibra óptica industrial</td><td>40 0005</td><td></td></tr><tr><td>Aguja roma de calibre 18</td><td>BD</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>Toallita sin pelusa de 1,5 pulgadas de largo (KimWipe)ThorLabs</td><td></td> <td>KW32</td><td>disponible en muchos proveedores</td></tr><tr><td>Lámina absorbente ligera</td><td>ThorLabs</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>Cinta aislante</td><td>3M</td><td>Temflex 1700</td><td>Opcional, puede sustituir a otras marcas / modelos</td></tr><tr><td>Aguja afilada de calibre 26 &nbsp;</td><td>BD</td><td>305111</td><td>0,5 pulgadas de longitud</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Siskiyou</td><td>70750000E</td><td>puede sustituir a otras marcas/modelos</td></tr><tr><td>Brazo esteretáctico</td><td>Kopf</td><td>1460</td><td>puede sustituir a otras marcas/modelos</td></tr><tr><td>Las gafas de seguridad láser</td><td>KenTeK</td><td>KCM-6012</td><td>deben seleccionarse en función del color del láser utilizado, ejemplo dado aquí</td></tr><tr><td>Láser u otra fuente de luz</td><td>vortran</td><td>Stradus 473-50</td><td>ejemplo de láser azul</td></tr><tr><td>Esfera integradora</td><td>ThorLabs</td><td>S142C</td><td>Medidor de potencia adjunto, también disponible en ThorLabs, artículo #PM100D</td></tr><tr><td>Cámara de grabación Ultem</td><td>Crist instrument company</td><td>6-ICO-J0</td><td>Personalizado con muesca de alineación</td></tr><tr><td>Microdrive de torre con abrazaderas</td><td>NAN</td><td>DRTBL-CMS</td><td></td></tr><tr><td>Tubo guía</td><td>Personalizado</td><td>N/A</td><td>Hecho de aguja espinal (BD) de calibre 25 o tubo romo</td></tr><tr><td>Sistema de controlador NAN</td><td>NAN</td><td>NANDrive</td><td></td></tr><tr><td>Diseño de cuadrícula personalizado</td><td></td> Planos <td>personalizados</td><td>personalizados disponibles a pedido</td></tr><tr><td>Pinzas romas</td><td>FischerScientific</td><td>08-875-8A</td><td>pinzas romas genéricas de acero inoxidable Pinzas</td></tr><tr><td>digitales</td><td>Neiko</td><td>01407A</td><td>Disponible en amazon.com. Puede seleccionar un calibrador de resolución más fina para mediciones más precisas.</td></tr><tr><td>Cable</td><td>de conexión ThorLabs</td><td>FG200LCC-custom</td><td>Este es un ejemplo de muchos cables de conexión posibles. Siempre que el diámetro de la fibra sea menor o igual al diámetro de la fibra del iluminador de gran volumen y siempre que los conectores interactúen, cualquier cable de conexión (vidrio o plástico, comprado o fabricado en el laboratorio) está bien para esta aplicación.</td></tr><tr><td>Tapones antipolvo de plástico transparente</td><td>ThorLabs</td><td>CAPF</td><td>Paquete de 25</td></tr><tr><td>manguitos de acoplamiento divididos de cerámica</td><td>Precision Fiber Products, Inc.</td><td>SM-CS1140S</td><td></td></tr></tbody></table>

gran volumen, iluminación conductualmente relevantes para optogenetics en primates no humanos

Large Volume, Behaviorally-relevant Illumination for Optogenetics in Non-human Primates

Este protocolo describe un iluminador de gran volumen, que fue desarrollado para la manipulación de optogenetic en el cerebro de primates no humanos. El iluminador es una modificado fibra óptica de plástico con punta de grabado al agua fuerte, tal que la luz que emite la superficie es &#62; 100 x de una fibra convencional. Además de describir la construcción del iluminador de gran volumen, este protocolo detalla la calibración de control de calidad para asegurar la mejor distribución lumínica. Además, este protocolo describe técnicas para insertar y retirar el iluminador de gran volumen. Estructuras superficiales y profundas pueden ser iluminadas. Este iluminador de gran volumen no necesita estar físicamente junto a un electrodo, y porque la luz está hecha de plástico, no de vidrio, simplemente se dobla en circunstancias cuando destruiría fibras ópticas tradicionales. Porque este iluminador ofrece luz sobre volúmenes de tejido conductualmente relevantes (≈ 10 mm3) sin mayor daño de penetración de una fibra óptica convencional, que facilita estudios de comportamiento usando optogenetics en primates no humanos.

La iluminación de los volúmenes grandes del cerebro en primates no humanos permite la manipulación del comportamiento relevante optogenetic. Acker et al. (2016) utiliza este iluminador de gran volumen con la halorodopsina rojo-cambiado de puesto, las mordazas 7 para estudiar la contribución temporal del campo frontal del ojo (FEF) para Movimientos sacádicos memoria-dirigida en dos monos rhesus. Específicamente, las neuronas de la FEF fueron inyectadas con un vector viral que contiene las ...

Se presenta un protocolo para construir un iluminador penetrante de tejido para ofrecer luz sobre grandes volúmenes con diámetro mínimo.

Gran volumen, iluminación conductualmente relevantes para Optogenetics en Primates no humanos

This protocol describes a large-volume illuminator, which was developed for optogenetic manipulations in the non-human primate brain. The illuminator is a ...

El objetivo general de este protocolo es crear un iluminador de tejidos de gran volumen que se adapte bien a las manipulaciones optogenéticas en primates no humanos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como ¿cómo contribuyen las poblaciones de neuronas en las diferentes regiones del cerebro al comportamiento y cómo pueden los patrones de activación neuronal temporalmente específicos en una región afectar a otra región? La principal ventaja de esta técnica es que utiliza la luz y, por lo tanto, permite la manipulación optogenética de grandes volúmenes cerebrales relevantes para el comportamiento con un daño tisular mínimo.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la medicina traslacional debido a las similitudes entre los cerebros de los primates humanos y no humanos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se necesita algo de práctica para aplicar la cantidad adecuada de presión al tirar de estas fibras. Para comenzar este procedimiento, use un par de tijeras afiladas para cortar una sección de fibra óptica plástica de 250 micrómetros de diámetro que sea al menos 10 centímetros más larga que la longitud total deseada del iluminador.A continuación, retire de 15 a 20 centímetros de cubierta de polietileno de un extremo de la fibra óptica de plástico con un pelacables de calibre 22. Luego, asegure los tres a cinco centímetros más distales del extremo pelado de la fibra en una abrazadera de tornillo de banco. Sostenga el extremo encamisado de la fibra tenso con una mano, con un tirón constante y constante.La fibra debe estar paralela al suelo, alejada del tornillo de banco. Mantenga esta tensión constante en la fibra durante el calentamiento y el enfriamiento, de modo que la fibra permanezca recta y tensa a medida que se adelgaza. Usando la configuración más baja de una pistola de calor de doble temperatura, caliente la sección pelada de la fibra hasta que se adelgace a un diámetro de 60 a 100 micrómetros, o aproximadamente el diámetro de un cabello humano.Mantenga la tensión constante en la fibra mientras deja que se enfríe. Si no se mantiene la tensión o se sobrecalienta la fibra, es posible que la fibra se enrosque o se rompa. Para ayudar a mantener una tensión constante en la fibra mientras la calientas, usa tu mano no dominante para que no tengas que soltarla cuando estés usando la pistola de calor.Además, puede envolver suavemente la fibra alrededor de la palma de la mano para obtener un agarre aún mejor. Una vez que la fibra se haya enfriado por completo y se haya alcanzado el diámetro deseado, pellizque la fibra a tres centímetros del punto más estrecho en ambos lados. Con un tirón rápido y brusco a lo largo del eje de la fibra, separe los lados para crear una punta cónica.Luego, examine la punta cónica a baja potencia bajo un microscopio de disección. Si la punta es bifurcada o rizada, desecha la fibra. Incluso con mucha práctica, alrededor de un tercio de las fibras tendrán puntas bifurcadas o rizadas.Simplemente desechamos esas fibras en lugar de tratar de repararlas, ya que es muy rápido y económico sacar otra. Prepárese para grabar la punta cónica colocando un trozo de cinta de laboratorio cerca del extremo de la punta, dejando expuesta la longitud deseada de la punta. Aquí quedan expuestos los últimos cinco milímetros.La cinta protege la fibra del grabado por encima de la longitud deseada de emisión de luz. Después de eso, doble un pequeño cuadrado de hoja de carburo de silicio de cinco micrómetros entre el pulgar y el índice. Coloque la punta de la fibra entre los dos lados de la hoja de lapeado y grabe suavemente la fibra con pequeños movimientos circulares.Gire con frecuencia la fibra para que todos los lados queden grabados de manera uniforme. A continuación, retire unos cinco milímetros de la cubierta de polietileno del extremo opuesto del iluminador con un pelacables de calibre 22. Luego, corte el extremo opuesto plano con un cuchillo caliente para alisar la superficie.Coloque un conector en el extremo del iluminador opuesto a la punta grabada. Esto permite que el iluminador se conecte a un cable óptico o láser. Después, pula el extremo opuesto con láminas de lapeado sucesivamente más finas.Posteriormente, inserte el extremo opuesto plano en una férula de acero inoxidable de 260 micrómetros de diámetro interior hasta que quede al ras con el extremo de la férula. Confirme visualmente que el extremo opuesto está pulido suave y uniformemente con un microscopio de fibra. Pega la férula verticalmente en el borde de la mesa con la abertura más pequeña de la férula apuntando hacia abajo.Luego, llene una jeringa de un mililitro con epoxi plástico y coloque una aguja roma de calibre 18 en la jeringa. Después de esto, use la aguja para aplicar epoxi hacia abajo en la férula. Llene la férula completamente con epoxi.Inserte la fibra en la férula de modo que quede al ras con la parte inferior de la férula. Si es necesario, limpie el exceso de epoxi de la superficie pulida de la fibra con una toallita húmeda sin pelusa antes de secar. En este paso, prepare un microdrive de torre antes de cada sesión de prueba.A continuación, fije un tubo guía de calibre 25 con una punta biselada a la abrazadera inferior de la transmisión. Fije el iluminador de gran volumen en la abrazadera superior de la misma unidad. Esta abrazadera está unida al motor de accionamiento.Luego, pase el iluminador de gran volumen a través del tubo guía completamente y confirme que la punta del iluminador se extienda más allá de la punta del tubo guía. Alternativamente, se puede aplicar cinta de laboratorio a la fibra para que la cinta, en lugar de la fibra en sí, quede sujeta, para proteger la fibra. A continuación, sumerja el tubo guía y el iluminador en una solución antiséptica para la esterilización.Coloque una rejilla esterilizada personalizada con un espaciado de orificios de un milímetro dentro de la cámara limpia y asegúrela en una orientación preespecificada con el tornillo en el costado de la cámara. Retraiga el iluminador esterilizado del tubo guía tirando del iluminador hacia arriba con pinzas romas estériles. La punta del iluminador debe estar de cinco a 10 milímetros por encima de la punta del tubo guía.Fije el microdrive al soporte y coloque el tubo guía en el orificio de la rejilla de destino. A continuación, baje la etapa de microaccionamiento hasta que el tubo guía esté justo a través del nivel de la duramadre. Al mismo tiempo, baje el iluminador manualmente con pinzas estériles.Si hay alguna resistencia, retraiga el iluminador de cinco a 10 milímetros, espere 10 minutos y vuelva a intentarlo. Si todavía hay resistencia en el segundo intento, retraiga la punta del iluminador en el tubo guía, baje el tubo guía 0,25 milímetros y vuelva a intentarlo. Conecte la férula en el otro extremo del iluminador a la configuración óptica más grande o al láser.Esta figura muestra que las tasas de error aumentaron significativamente con la iluminación. Y los gráficos rasterizados aquí muestran la inhibición de las neuronas que abarcan el grosor de 2,5 milímetros de la corteza. Y el potencial de campo local que muestra el artefacto de luz que abarca 4,5 milímetros.Una vez dominado, se puede construir un iluminador de gran volumen utilizando esta técnica en 10 a 15 minutos, más el tiempo de secado epoxi. La calibración agrega otra media hora más o menos, por lo que para maximizar la eficiencia, generalmente fabricamos varios iluminadores a la vez. Al asistir a este procedimiento, es importante recordar que muchos de los iluminadores no cumplirán con los estándares de control de calidad.Está bien. Si no pasan la inspección de la punta, los descartamos. Pero si fallan la calibración, generalmente los volvemos a pulir y repetimos la calibración.Después de su desarrollo, esta técnica ayudó a allanar el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia utilizaran la optogenética para suprimir la activación neuronal y modular el comportamiento en primates no humanos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo construir un iluminador de tejido de gran volumen.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Behavior

Comportamiento

Las neuronas nacidas de adultos del bulbo olfatorio puede ser controlado usando optogenetically Channelrhodopsin2 que expresan lentiviral inyección en la corriente migratoria rostral y fotoestimulación crónica con una miniatura implantado LED.

Transducción viral selectiva de adultos nacidos en las neuronas olfativas de las enfermedades crónicas En vivo Estimulación Optogenetic

El reciente desarrollo de herramientas de la neurociencia, que combinan la genética y la óptica, denominada "optogenética", permite el control sobre la actividad de circuitos neuronales con un nivel sin precedentes de la resolución espacial y temporal. Aquí les ofrecemos un protocolo para la integración en la grabación vivo con la manipulación optogenética de subconjuntos definidos genéticamente las neuronas piramidales corticales y subicular prefrontales.

Un método para la alta fidelidad Optogenética control de un individuo neuronas piramidales<em&gt; En vivo</em

optogenética se ha convertido en una poderosa herramienta para su uso en experimentos de neurociencia conductual. Este protocolo ofrece una guía paso a paso para el diseño y la configuración de sistemas láser, y proporciona un protocolo completo para llevar a cabo estimulaciones optogenéticas in vivo múltiples y simultáneas compatibles con la mayoría de los paradigmas de pruebas de comportamiento de roedores.

In vivo optogenético la estimulación del sistema nervioso central de roedores

Aquí describimos nuestra estrategia para obtener registros estables y bien aislados de una sola unidad a partir de interneuronas inhibitorias identificadas en la corteza del ratón anestesiado. Las neuronas que expresan ChR2 se identifican por su respuesta a la luz azul. El método utiliza un equipo de registro extracelular estándar y sirve como una alternativa económica a las imágenes de calcio o a los parches guiados visualmente.

Una guía para En vivo Single-unidad de grabación de Optogenetically Identificado cortical inhibitorio interneuronas

Este protocolo describe los pasos y el análisis de datos necesarios para realizar con éxito la resonancia magnética funcional optogenética (ofMRI). ofMRI es una técnica novedosa que combina la lectura de fMRI de alto campo con la estimulación optogenética, lo que permite el mapeo específico del tipo de célula de los circuitos neuronales funcionales y su dinámica en todo el cerebro vivo.

RM funcional Optogenética

Aquí, demostramos la convección guiada por resonancia magnética (RM) entrega mejorada (CED) de vectores virales en la corteza como un enfoque eficiente y simplificado para lograr la expresión optogenética a través de grandes áreas corticales en el cerebro macaco.

Convección Mejorada Entrega de Vector Viral Asociado a Adeno Optogenético a la Corteza de Rhesus Macaque Bajo Guía de Imágenes de RMN en Línea

Con la manipulación optogenética de poblaciones neuronales específicas o regiones cerebrales, el comportamiento se puede modificar con alta resolución temporal y espacial en animales en movimiento libre. Mediante el uso de diferentes herramientas optogenéticas en combinación con fibras ópticas implantadas crónicamente, se puede realizar una variedad de modulaciones neuronales y pruebas de comportamiento.

Manipulación optogenética de la actividad neuronal para modular el comportamiento en ratones que se mueven libremente

El método descrito a continuación tiene como objetivo proporcionar un protocolo completo para la preparación de neurocirugía de primates no humanos (NHP) utilizando una novedosa combinación de métodos de impresión tridimensionales (3D) y extracción de datos por resonancia magnética.

Una caja de herramientas basada en RMN para la planificación neuroquirúrgica en primates no humanos

Tal como se implementa actualmente, la optogenética en primates no humanos requiere la inyección de vectores virales en el cerebro. Un método de inyección óptimo debe ser confiable y, para muchas aplicaciones, capaz de dirigirse a sitios individuales de profundidad arbitraria que se identifican de manera fácil e inequívoca en la histología postmortem. Se presenta un método de inyección con estas propiedades.

Inyecciones de vectores AAV para optogenética en cerebro de primates no humanos anestesiados y despiertos

La luz de bioluminiscencia emitida por una enzima luciferasa que oxida un sustrato de molécula pequeña, una luciferina, se puede aprovechar para activar proteínas fotosensoriales, agregando así otra dimensión a la estimulación de la luz y permitiendo la manipulación de una multitud de funciones mediadas por la luz en las células a través de escalas temporales y espaciales.

Optogenética bioluminiscente 2.0: Aprovechamiento de la bioluminiscencia para activar proteínas fotosensoriales in vitro e in vivo

Este artículo describe los procesos automatizados para la planificación neuroquirúrgica de primates no humanos basados en imágenes de resonancia magnética (IRM). Estas técnicas utilizan pasos de procedimiento en plataformas de programación y diseño para respaldar el diseño de implantes personalizados para NHP. La validez de cada componente se puede confirmar utilizando modelos anatómicos tridimensionales (3D) impresos a tamaño real.

Una caja de herramientas de diseño de implantes neurales para primates no humanos

Aprende a construir un iluminador de tejido de gran volumen para optogenética en primates no humanos. Este método permite manipular volúmenes cerebrales extensos con mínimo daño tisular, facilitando el estudio de poblaciones neuronales y su contribución al comportamiento en neurociencia.

Gran volumen, iluminación conductualmente relevantes para Optogenetics en Primates no humanos

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