Condicional Knockdown de genes en líneas celulares de cáncer para estudiar el reclutamiento de monocitos/macrófagos que el microambiente del Tumor

El conjunto de este protocolo consiste en utilizar la desactivación condicional de la expresión génica en las células cancerosas para estudiar el reclutamiento de monocitos y macrófagos en el microambiente tumoral in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del microambiente tumoral con respecto a la naturaleza del intercambio entre las células cancerosas y las células del sistema inmunitario. La principal ventaja de esta técnica es que el sistema utilizado aquí requiere la clonación de un solo vector, permite la generación rápida de múltiples clones y exhibe niveles muy bajos de espesor.

También se ha demostrado un método para la purificación de monocitos humanos sin contacto directo con anticuerpos, que evita la activación accidental y da como resultado una población pura de más del 95% de monocitos humanos. Para producir partículas virales, transfecte placas de 150 milímetros confluentes al 70% de células HEK-293 con 25 microgramos de shRNA pLKO-tet-on, 25 microgramos del plásmido de empaquetamiento psPAX y cinco microgramos del plásmido que expresa la envoltura pMD2. G utilizando reactivo de transfección según protocolos estándar.

Agregue la mezcla a los platos de 150 milímetros. Al día siguiente, inducir la producción lentiviral en las células cambiando el medio a DMEM suplementado con butirato de sodio 10 milimolares y HEPES 20 milimolares. Cultivo durante ocho horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Después de ocho horas, lavar las células con PBS y agregar 25 mililitros de medio DMEM fresco con HEPES de 20 milimolares y sin butirato de sodio. Después de la incubación durante 48 horas, recoja cuidadosamente el medio que contiene el virus con una pipeta. Para generar líneas celulares estables, comience por sembrar células de cáncer de colon HCT-116 y células de cáncer de mama MDA-MB-231 en una placa de 12 pocillos y 50.000 células por pocillo.

Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Cuando las células estén confluentes en un 60-70%, lávelas con PBS y agregue un mililitro de medio que contenga virus a cada pocillo. Al día siguiente, retire con cuidado el medio que contiene el virus por aspiración.

Luego, después de lavar las células con PBS, agregue un medio que contenga FBS sin tetraciclina. Después de 72 horas, lavar las células como antes y agregar medio suplementado con un microgramo por mililitro de puromicina para la selección de células transfectadas por virus. Seleccione las células transducidas por el virus cultivándolas en presencia de puromicina durante tres a 14 días.

Obsérvese la muerte parcial de los pocillos por puromicina en las células con células transducidas por virus. Las células no transducidas no crecerán en presencia de puromicina. Cuando estas células de control hayan muerto, se debe continuar el cultivo de las líneas celulares reguladas condicionalmente durante dos semanas en presencia de antibióticos para crear las líneas celulares reguladas condicionalmente.

Verificar la eficacia de la eliminación condicional en las células de cáncer de colon HCT-116 y MDA-MB-231 resistentes a la puromicina mediante la adición de medio con diferentes concentraciones de doxiciclina y el cultivo de las células durante 72 horas. Después de preparar el lisado celular, verifique el nivel de derribo mediante el análisis de Western blot. Aquí se muestran los niveles de PAI-1.

Para aislar los monocitos de sangre periférica, primero prepare tres tubos de 50 mililitros que contengan 15 mililitros de solución de gradiente de densidad. A continuación, utilice un controlador de pipeta configurado en flujo gravitacional para colocar lentamente 30 mililitros de sangre diluida sobre la solución de gradiente de densidad. Centrífuga en un rotor oscilante a 400 g a temperatura ambiente sin interrupciones durante 25 minutos.

Después de la centrifugación, deseche la capa superior y transfiera la capa intermedia que contiene células mononucleares de sangre periférica a un tubo nuevo de 50 mililitros y agregue PBS suplementado con FBS hasta 50 mililitros. Centrifugar a 120 g a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después del centrifugado, retire el sobrenadante que contiene plaquetas.

Después de la centrifugación y recolección final, resuspender el pellet en 50 mililitros de PBS suplementado con FBS y contar las células mononucleares de sangre periférica con un hemocitómetro. Después de centrifugar las células a 120 g, vuelva a suspender el pellet en PBS suplementado con FBS que contenga un milimolar de EDTA hasta una concentración final de 50 millones de células por mililitro. A continuación, comience a enriquecer los monocitos añadiendo 50 microlitros de cóctel de anticuerpos de selección negativa por cada mililitro de suspensión celular y mezcle.

Incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, agregue 50 microlitros de perlas magnéticas por mililitro, mezcle e incube durante otros 10 minutos. Luego agregue PBS con FBS y EDTA hasta 25 mililitros y coloque la mezcla mononuclear de sangre periférica en un imán que pueda acomodar un tubo de 50 mililitros.

Después de incubar durante 10 minutos a temperatura ambiente, las perlas magnéticas se adherirán a las paredes del tubo y secuestrarán las células no monocíticas de la solución. Utilice una pipeta de 25 mililitros para extraer la solución que contiene monocitos del tubo, teniendo cuidado de no tocar los lados del tubo con la pipeta. Después de centrifugar y eliminar el sobrenadante, vuelva a suspender el pellet que contiene monocitos en un medio RPMI que contenga un 10% de FBS libre de TET y un 1% de estreptococo en pluma.

Comience el ensayo sembrando 40.000 células HCT-116 o MDA-MB-231 en un volumen de 0,5 mililitros en los pocillos de una placa de 24 pocillos por triplicado. Al día siguiente, agregue un filtro al pozo. A continuación, colocan 8.000 monocitos en un volumen de 0,3 mililitros en un inserto de membrana porosa tratado con BSA colocado en la parte superior de las células cancerosas y se incuban a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Recoja los insertos después de 48 horas. Sacude el exceso de medio y desliza con precisión la superficie interna con un aplicador con punta de algodón para eliminar las células que no migraron. Tiñe el lado exterior del inserto con el método de Wright-Giemsa.

Después de montar los filtros con los macrófagos migrados hacia arriba, obtenga imágenes de los portaobjetos con un microscopio óptico con un objetivo de 20 potencias. Tome fotografías de nueve campos por filtro y cuente los macrófagos migrados en todos los campos. El ensayo de la cámara de Boyden se utilizó para cuantificar la migración de monocitos hacia las células cancerosas.

En presencia de células de cáncer de mama MDA-MB-231, la migración de monocitos se inhibió en un 33% después de la adición de doxiciclina al cocultivo para regular a la baja PAI-1. Esta inhibición de la migración de monocitos fue más pronunciada en presencia de células de cáncer de colon HCT-116, donde la eliminación de PAI-1 mediante la administración de doxiciclina redujo la migración de monocitos en un 74 %. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar un sistema de tet-on funcional para la reducción de la expresión génica en líneas celulares de cáncer humano para estudiar el efecto quimioatrayente de la proteína secretada PAI-1 derivada del cáncer en los monocitos humanos.