Name: Condicional Knockdown de genes en líneas celulares de cáncer para estudiar el reclutamiento de monocitos/macrófagos que el microambiente del Tumor (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Aprende el knockdown condicional de genes en líneas celulares de cáncer usando el sistema Tet-ON para estudiar el reclutamiento de monocitos y macrófagos al microambiente tumoral.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Los autores desean reconocer Jacqueline Rosenberg para corregir el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los nosotros Departamento de salud y servicios humanos/nacional institutos de salud con una subvención YA DeClerck (concesión 5R01 CA 129377) y la TJ Martell Foundation. MH Kubala es el receptor de un premio de beca de desarrollo de carrera de investigación del Instituto de investigación de Saban en el Hospital Los Angeles de los niños.

La sección de protocolo que utiliza monocitos humanos obtenidas de voluntarios sanos sigue las pautas del Comité de ética de Investigación Hospital Los Ángeles humanos de los niños y ha sido aprobada por la Junta de revisión institucional en el Material humano Número de protocolo: CCI 08-00208.
1. preparación de líneas celulares de cáncer con tetraciclina regulado shRNA expresión
<ol><li>Clonación del shRNA PAI-1 en Tet-pLKO-puro vector 8 , 9<ol>
<li>Diseño de oligómeros de shRNAs que contienen edadI y EcoRI escote sitio en el extremo 5', la secuencia de sentido, un lazo de 6 nucleótidos y la secuencia antisentida. Nota: Oligonucleótidos típicos están diseñados como sigue: oligo Forward: 5' CCGG - 19-21 bp sentido - CTCGAG - 19-21 bp antisentido - TTTTT, oligo Reverse: sentido de 5' AATTAAAAA-19-21 bp - CTCGAG - 19-21 antisentido de bp 3'. Protocolo detallado para el diseño de oligómero puede encontrarse en el 8. En este estudio se analizaron 3 secuencias de shRNA contra PAI-1 para el efecto de silenciamiento más fuerte: shRNA 132, shRNA 2, shRNA 333y revueltos33 están incluidos en la tabla 1.</li>
		<li>Templar los oligómeros de shRNA y revueltos shRNA oligómeros.<ol>
<li>Reconstituir de oligonucleótidos a 100 μm en agua y mezcla de oligonucleótidos hacia adelante de 1 μl, oligonucleótidos inversa de 1 μl y 8 μl de H2O.</li>
			<li>Para templar los oligonucleótidos, mezclar lo siguiente: mezcla de oligonucleótidos de 1 μl, 5 μl de tampón 10 mM Tris (hidroximetil) aminometano (Tris), pH 7.5, 50 mM cloruro de sodio (NaCl), 10 mM cloruro de magnesio (MgCl2), 1 mM dithioerythritol (DTE) y 44 μl de H 2 O.</li>
			<li>Incubar la mezcla en un termociclador de la reacción en cadena (PCR) de polimerasa a 95 ° C durante 5 minutos, apague el instrumento y espere hasta que se alcance la temperatura ambiente (RT).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Oligonucleótidos recocidos precipitados al añadir 5 μl 3 M acetato de sodio pH 5.2 a 50 μl habían recocido oligonucleótidos.<ol>
<li>Añadir 100 μl frío 100% etanol (EtOH) e incubar durante 30 min a 80 ° C. Centrifugar en una centrífuga de sobremesa a la máxima velocidad durante 30 min a 4 ° C.</li>
			<li>Eliminar el sobrenadante, agregar 500 μl de frío 70% EtOH, centrifugar por 30 min, eliminar el sobrenadante y disolver el pellet en 20 μl de H2O.</li>
			<li>Evaluar la concentración de oligonucleótidos recocidos por espectrofotometría midiendo la absorbancia a 260 nm. Oligonucleótidos diluidas a la concentración final de 1 ng/μl.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Preparar el medio Luria Bertani (LB) y las placas de agar LB.<ol>
<li>De medio LB, disolver 10 g triptona, extracto de levadura 5 g, 10 g de NaCl en 1 L de agua. Ajustar el pH del medio a pH 7.0 con 1 N NaOH y autoclave.</li>
			<li>Para las placas de agar LB, añadir 15 g/L de agar en medio LB. Autoclave y enfriar hasta aproximadamente 50 ° C. Añadir antibiótico y verter a las placas.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Raya las bacterias transduced con Tet-pLKO-puro vector (véase la Tabla de materiales) en LB placa de agar suplementado con ampicilina μg/mL 100 e incubar durante la noche (O/N) a 37 ° C.</li>
		<li>Inocular 100 mL LB suplementado con ampicilina 100 de μg/mL (LB/ampicilina) con 1 Colonia de la placa y crecer O/N con agitación a 37 ° C.</li>
		<li>IsolateTet-pLKO-puro de la cultura bacteriana de 100 mL utilizando un kit de aislamiento de plásmidos.</li>
		<li>Preparar la reacción de restricción para el Tet-pLKO-puro vector con enzimas de restricción EcoRI y africanas como sigue: 1 μl de EcoRI, 1 μl de africanas, 5 μl de tampón de 10 x, 1 μl ADN de plásmido (1 μg), 42 μl de H2O. Incubar 1 h a 37 ° C. Para obtener suficiente de vector exfoliado, preparar reacciones de hasta 5 x 50 μl.</li>
		<li>Utilice gel de agarosa al 1% para purificar exfoliado vector del gel de agarosa usando un kit de purificación de ADN. Para aumentar el rendimiento de la DNA, minimizar la agarosa al cociente de la DNA en el gel usando un peine de gel de agarosa para grandes pozos y quitando con cuidado la mayor parte de la agarosa de la banda con un bisturí.</li>
		<li>Preparar la mezcla de reacción de la ligadura siguiente: oligonucleótidos ng recocido 1, vector exfoliados de 50 ng, 2 μl de tampón de ligasa 10 x, 1 ligasa μl y el agua hasta 20 μl. ligan el vector con oligonucleótidos shRNA recocido a 16 ° C O/N.<ol>
<li>Preparar además, una reacción de control negativo sin oligonucleótidos para vector uncleaved parcialmente hendido y auto ligado que dan lugar a colonias positivas falsos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Mediante técnicas de transformación estándar, transformar mezclas de ligadura en células bacterianas competentes químicamente diseñadas para evitar la recombinación homóloga de vectores lentivirales que contienen repeticiones directas.</li>
		<li>Crecer las bacterias en las placas con ampicilina O/N a 37 ° C. Nota: Si se produce el crecimiento de las colonias satélite, repetir la transformación y crecer las bacterias a 30 ° C para retardar el crecimiento y prevenir así las colonias satélite.</li>
		<li>Para verificar la ligadura acertada, escoge entre las colonias solo 10-20, inoculando 2 mL LB/ampicilina culturas y una placa de ampicilina como placa de la bolsa (para ser utilizado como un clon positivo más adelante). Crecen cultivos líquidos con agitación O/N a 37 ° C. Incube la placa O/N a 37 ° C.</li>
		<li>Sellar la placa con parafilm y tienda a 6 ° C.</li>
		<li>Aislar ADN plasmídico de culturas líquidas usando un kit de aislamiento de plásmidos.</li>
		<li>Realizar el análisis de restricción del DNA plasmídico aislado de colonias resistentes a ampicilina con enzima XhoI. Para cada clon, prepare la siguiente mezcla de reacción: 0,5 μl XhoI, 2.5 μl de tampón 10 x, 1 μl ADN de plásmido (0,5 μg) y 21 μl de H2O. Incubar 1 h a 37 ° C. Analizar el resultado de la reacción de restricción mediante la ejecución de la reacción en un gel de agarosa al 1%. Nota: El análisis de restricción del vector WT por XhoI generará 3 fragmentos: 8.447, 1.800 y 200 bp. La secuencia de embutidora en Tet-pLKO-puro vector de 1.800 bp no está presente en clones positivos que contiene el shRNA-PAI-1 y la digest XhoI dará lugar a fragmentos de ADN del tamaño: 8.447, 190 y 130 bp. Como se muestra en la figura 1, el fragmento de bp 2.000 no se encuentra en la DNA aislada del número de colonias resistentes a ampicilina: 3, 8 y 11. Dependiendo del diseño de los oligonucleótidos, pueden variar la longitud y el número de fragmentos obtenidos en el ADN de las colonias positivas.</li>
		<li>Para comprobar la correcta inserción de las secuencias de shRNAs en el vector de Tet-pLKO-puro secuencia8,9.</li>
		<li>Inocular 100 mL de cultivo LB/ampicilina con la colonia que contiene la copia correcta y O/N de crecer a 37 ° C.</li>
		<li>Aislar DNA plasmídico utilizando un kit de aislamiento de plásmidos.</li>
	</ol></li>
	<li>Generación de partículas de lentivirus.
	<ol>
<li>Un plato de cultivo de tejidos de 15 cm de la capa con poli-l-lisina al cubrir la superficie del plato con agua estéril solución de 0.01% Poly-L-lisina e incubar a temperatura ambiente durante 15 minutos retirar la solución por la aspiración y secar los platos.</li>
		<li>Células de semilla 5 x 106 293 de riñón embrionario humano (HEK293) en el plato de la polivinílico-L-lisina-revestidas de 15 cm, y cultura en medio de modificado Eagle de Dulbecco Medium (DMEM) suplementado con 10% FBS y 1% mezcla de penicilina/estreptomicina (Pen/Strep) a 37 ° C, 5% CO 2 hasta llegar a confluencia de 70%.</li>
		<li>Para producir partículas virales, transfectar las células HEK293 con 25 μg pLKO-Tet-a-shRNA, 25 μg psPAX, (plásmido de empaquetado) y 5 μg pMD2.G plásmidos (plásmidos expresando su envolvente) utilizando el reactivo de transfección. Nota: los plásmidos psPAX y pMD2.G son un regalo del laboratorio de Didier Trono (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne, Suiza).</li>
		<li>Inducir las células HEK293 al día siguiente cambiando el medio DMEM suplementado con 10 mM sodio butirato y 20 mM HEPES pH 7.2 y cultivo de 8 h.</li>
		<li>Lavar las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y añadir 25 mL de fresco DMEM medio conteniendo 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido ácido (HEPES) pH 7.2. Después de incubación a 37 ° C por 48 h, recoger cuidadosamente medio que contiene el virus mediante pipeteo; Evite derrames.</li>
		<li>Filtrar el medio recogido a través de un filtro de jeringa de 0.45 μm para eliminar las células HEK293. El medio que contiene partículas virales puede ser utilizado inmediatamente o almacenado a-80 ° C para su uso posterior.</li>
	</ol></li>
	<li>Generación de líneas de células transfected estable
	<ol>
<li>HCT116 células de cáncer de colon y las células de cáncer de mama MDA-MB-231 a 50.000 células/pozo en medio DMEM suplementado con 10% suero bovino fetal (FBS) y 1% de la semilla pluma/Strep en una placa de 12 pozos. Incubar a 37 ° C en 5% de CO2 hasta que las células son confluentes de 60-70%.</li>
		<li>Lavar las células con PBS y añadir 1 mL de virus que contiene medio cáncer de las células y O/N de incubar a 37 ° C en 5% CO2. Como control, añadir 1 mL de medio fresco de DMEM suplementado con 10% FBS y 1% pluma/Strep a 2 pocillos con células de cáncer.</li>
		<li>Para sacar el medio que contiene el virus de la aspiración. Lavan las células con PBS y cambiar el medio DMEM con 10% (v/v) libre de tetraciclina FBS (Tet-libre) y 1% pluma/Strep.</li>
		<li>Después de 72 h, lavar las células con PBS y cambiar el medio DMEM 10% FBS TTE libre 1% pluma/Strep, puromicina de 1 μg/mL para la selección de células transfectadas por el virus.<ol>
<li>Dependiendo de la línea celular utilizada, ajuste la concentración de puromicina para la óptima selección prueba la gama de concentraciones de puromicina (0.1, 0.5, 1, 2 y 5 μg/mL) en las células no-transduced y eligiendo la menor concentración donde sobreviven ningunas células control después de 3 días de la cultura.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Seleccionar las células virus-transduced por cultivo de células en presencia de puromicina 3-14 días. Como controles, preparar dos pozos adicionales con las células no-transduced, uno con medio que contiene puromicina y uno sin puromicina. Observar muerte parcial de las células de puromicina en el pozo con las células virus-transduced en comparación con el control de pozos. Nota: Las células no-transduced no crecerá en presencia de puromicina.</li>
		<li>Verificar la eficacia de la DC condicional en el cáncer de colon resistente a la puromicina HCT116 y las células de cáncer de mama MDA-MB-231. Nota: La concentración efectiva de doxiciclina varía según la línea celular utilizada y debe titularse (típicamente de 100 ng/mL a 2 μg/mL).<ol>
<li>Determinar la concentración de doxiciclina que no se tóxicos para las células pero eficaz disminuyendo la expresión de la proteína de interés. En este protocolo, 1 μg/mL fue utilizado con éxito en vitro.</li>
			<li>La cultura de las células durante 72 h en presencia y ausencia de doxiciclina de 0.1, 1 y 2 μg/mL. Verificar el nivel de expresión de la proteína regulada (aquí, PAI-1) en la célula lisada por Western blot análisis. Comparar las células HCT116 y MDA-MB-231 condicional expresa shRNA control revuelto células.</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>Preparación de medio condicionado
	<ol>
<li>Semilla 1 x 106 células transfectadas estable con doxiciclina regulado pLKO-shRNA lentivirus que contiene platos de 10 cm.</li>
		<li>Crecimiento de líneas celulares en medio del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con 10% FBS Tet-libre y 1% pluma/Strep en ausencia y presencia de 1 doxiciclina μg/mL durante 72 h a 37 ° C en 5% CO2, añadir doxiciclina fresca todos los días. Nota: Medio RPMI es compatible con las condiciones de cultivo de monocitos. La doxiciclina es un compuesto sensible luz. Proteger las culturas de célula de la luz por la cubierta con papel de aluminio y evitar trabajar bajo exposición directa a la luz.</li>
		<li>Recoger el medio mediante pipeteo, filtrar con filtro de 0.45 μm y congelar a-80 ° C en alícuotas.</li>
	</ol></li>
</ol>2. aislamiento de monocitos de sangre humana
<ol><li>Aislamiento de monocitos de sangre periférica humana. Nota: Monocitos humanos primarios son aislados de 7 mL de glóbulos blancos, concentrados en un filtro de leucocitos Obtenido de donantes de plaquetas sanas. Según el donante, un filtro de leucocitos produce entre 1 x 109 y 2 x 109 de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs), aproximadamente el 10% de los cuales constituyen monocitos.<ol>
<li>Preparar la estación de trabajo en el gabinete de flujo laminar.</li>
		<li>Esterilizar las tijeras y el flujo laminar con luz ultravioleta (UV) durante 30 minutos.</li>
		<li>Rocíe el filtro de leucocitos con 70% EtOH y secado al aire dentro del gabinete de flujo laminar.</li>
		<li>Cortar ambos extremos del filtro de leucocitos con tijeras y vaciar el contenido del filtro en un tubo de 50 mL.</li>
		<li>Diluir hasta 90 mL agregando PBS con 1% (v/v) FBS (PBS/FBS).</li>
		<li>Preparar tubos de 3 x 50 mL con 15 mL de solución de densidad gradiente. La capa lentamente 30 mL de sangre de PBS/FBS diluido sobre la densidad solución gradiente usando un aspirador situado en flujo gravitatorio para evitar la mezcla de las capas.</li>
		<li>Centrífuga de un rotor de columpio a 400 x g a temperatura ambiente sin los frenos durante 25 minutos.</li>
		<li>Desechar la capa superior y transferencia de la capa media contiene PBMCs a un nuevo tubo 50 mL.</li>
		<li>Añadir QUE PBS/FBS hasta 50 mL y centrifugar a x 120 g a temperatura ambiente durante 10 minutos retirar el sobrenadante que contiene las plaquetas. Repita este paso dos veces más.</li>
		<li>Resuspender el precipitado en 50 mL de PBS/FBS y contar las PBMCs usando un hemocitómetro. Centrifugue a 120 g de x en RT y resuspender el precipitado en PBS/FBS que contiene 1 mM dihidratada del ácido (EDTA) (FBS/PBS/EDTA) a una concentración final de 5 x 107 células/mL.</li>
		<li>Utilice un kit de selección negativa para enriquecer monocitos por agotamiento de las células no-monocytic. Nota: El kit de la selección negativa utiliza un cóctel de anticuerpos (CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123 y glycophorin A) contra T células NK células, neutrófilos, B células, los granulocitos y eritrocitos. Los complejos de anticuerpos se unen a la superficie de estas células no-monocytic y a las partículas magnéticas de dextrano. Cuando el tubo se coloca en un imán, los granos se adhieren a las paredes del tubo y eliminar las células no-monocytic de la solución.<ol>
<li>Añada 50 μl del anticuerpo cóctel a 1 mL de 5 x 107 PBMCs/mL, mezclar con una pipeta, incubar 10 min a granos magnéticos de RT. Añadir 50 μl a las PBMCs con el cóctel de anticuerpos, mezclar con una pipeta e incube durante otro 10 min a TA.</li>
			<li>Se suman FBS/PBS/EDTA a 25 mL y coloque la mezcla PBMC en un imán que puede alojar un tubo de 50 mL. Incubar 10 min a RT. magnética granos se adhieren a las paredes del tubo y secuestrar las células no-monocytic de la solución.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Con una pipeta de 25 mL, retire la solución que contiene monocitos del tubo en el imán. Tenga cuidado de no tocar los lados del tubo con la pipeta.</li>
		<li>Centrifugue la solución a 250 x g a temperatura ambiente, retirar el sobrenadante y resuspender el precipitado que contiene monocitos en Medio RPMI con 10% FBS Tet-libre y 1% pluma/Strep.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ensayo de migración en camara Boyden
<ol><li>Preparar la solución de albúmina de suero bovino (BSA) 1% (p/v) disolviendo 1 g de BSA en 100 mL de agua ultrapura y filtrar con un tamaño de poro de 0.2 μm para esterilizar.</li>
	<li>Incubar los membrana porosa insertos en 1% BSA una solución estéril O/N para mejorar la adherencia de los macrófagos a la membrana. Monocitos/macrófagos, utilizar 5-8 μm poro tamaño inserciones.<ol>
<li>Llenar un plato de cultivo de tejido estéril con solución al 1% BSA y colocar los insertos en el plato. Aplique 200 μL 1% BSA solución dentro de los rellenos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave los insertos dos veces colocándolos en un plato llenado de PBS estéril y aplicar PBS dentro del filtro.</li>
	<li>40.000 células HCT116 o MDA-MB-231 en Medio RPMI de 0,5 mL que contiene 10% FBS Tet-libre y 1% de la semilla pluma/Strep por pozo, en un plato 24-well, por triplicado. Como alternativa, coloque 0.5 mL de medio condicionado previamente generado en el pozo como fuente de chemoattractant.</li>
	<li>Al día siguiente, monocitos placa 8.000 en el preparado insertar volumen 0.3 mL de Medio RPMI con 10% FBS Tet-libre y 1% pluma/Strep, en triplicado e incubar a 37 ° C en 5% CO2.</li>
	<li>Recoger los insertos después de 48 h. Nota: La longitud de un experimento debe ser optimizada dependiendo de las condiciones específicas y células utilizadas, realizando un experimento de evolución temporal donde se recogen los partes movibles en tiempos de incubación diferentes.<ol>
<li>Sacudir el exceso medio y pase precisamente la superficie interna con un aplicador con punta de algodón para eliminar las células que no migran.</li>
		<li>Mancha de la cara externa de los rellenos utilizando el método de Wright-Giemsa.</li>
		<li>Cuidadosamente Instale 3 insertos de vidrio deslizante en un aceite de inmersión de microscopio de alta viscosidad, asegurándose que el lado del filtro con los macrófagos migrados se enfrenta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Imágenes de las diapositivas utilizando un microscopio óptico con objetivo 20 X. Tome fotos de 9 campos de filtro. La cuenta migrados macrófagos en 9 campos de filtro.</li>
</ol>

<ol><li>Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+transgenic+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Conditional transgenic technologies.</a> J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).</li>
<li>Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour-associated+macrophages+as+treatment+targets+in+oncology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology.</a> Nat Rev Clin Oncol. , (2017).</li>
<li>Franklin, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cellular+and+molecular+origin+of+tumor-associated+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages.</a> Science. 344 (6186), 921-925 (2014).</li>
<li>Ruffell, B., Coussens, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+therapeutic+resistance+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Macrophages and therapeutic resistance in cancer.</a> Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).</li>
<li>Sharma, P., Allison, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+immune+checkpoint+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The future of immune checkpoint therapy.</a> Science. 348 (6230), 56-61 (2015).</li>
<li>Mizuguchi, H., Hayakawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+adenovirus-mediated+tetracycline-controllable+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system.</a> Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).</li>
<li>Meyer-Ficca, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+inducible+expression+systems+in+transient+transfection+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies.</a> Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).</li>
<li>Wiederschain, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-vector+inducible+lentiviral+RNAi+system+for+oncology+target+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation.</a> Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).</li>
<li>Wee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN-deficient+cancers+depend+on+PIK3CB%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).</li>
<li>Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Down-regulation+of+CXCR4+by+inducible+small+interfering+RNA+inhibits+breast+cancer+cell+invasion+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro.</a> Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).</li>
<li>Wiznerowicz, M., Trono, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conditional+suppression+of+cellular+genes%3A+lentivirus+vector-mediated+drug-inducible+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference.</a> J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).</li>
<li>Solari, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MYCN-dependent+expression+of+sulfatase-2+regulates+neuroblastoma+cell+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival.</a> Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).</li>
<li>Liao, Y., Tang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inducible+RNAi+system+and+its+application+in+novel+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics.</a> Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).</li>
<li>Chen, H. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15576901">Boyden chamber assay.</a> Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).</li>
<li>Jungi, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+chemotaxis+by+a+reversible+Boyden+chamber+eliminating+cell+detachment%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Arch+Allergy+Appl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment.</a> Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).</li>
<li>Jung, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+against+autocrine+motility+factor+suppress+gastric+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Lett%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer.</a> Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).</li>
<li>Park, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+Sorbus+commixta+on+the+invasion+and+migration+of+human+hepatocellular+carcinoma+Hep3B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells.</a> Int J Mol Med. , (2017).</li>
<li>Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes%2C+peripheral+blood+mononuclear+cells%2C+and+THP-1+cells+exhibit+different+cytokine+expression+patterns+following+stimulation+with+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide.</a> Mediators Inflamm. 2013, 697972(2013).</li>
<li>Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+peripheral+blood+monocytes+versus+THP-1+monocytes+for+in+vitro+biocompatibility+testing+of+dental+material+components%5BTitle%5D)+AND+%22J+Oral+Rehabil%22%5BJournal%5D)">Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components.</a> J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).</li>
<li>Tsuchiya, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+human+acute+monocytic+leukemia+cell+line+%28THP-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1).</a> Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).</li>
<li>de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+human+peripheral+blood+monocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Mem+Inst+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">A simple method for human peripheral blood monocyte isolation.</a> Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).</li>
<li>Flo, R. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+selection+of+human+monocytes+using+magnetic+particles+covered+by+anti-lymphocyte+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies.</a> J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).</li>
<li>Grondahl-Hansen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen+activator+inhibitor+type+1+in+cytosolic+tumor+extracts+predicts+prognosis+in+low-risk+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients.</a> Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).</li>
<li>Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiation+of+serous+ovarian+cancer+from+cystic+to+solid+tumors+is+associated+with+increased+expression+of+mRNA+for+urokinase+plasminogen+activator+%28uPA%29%2C+its+receptor+%28uPAR%29+and+its+inhibitor+%28PAI-1%29%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1).</a> Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).</li>
<li>Devy, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pro-+or+antiangiogenic+effect+of+plasminogen+activator+inhibitor+1+is+dose+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent.</a> FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).</li>
<li>Bajou, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen+activator+inhibitor-1+protects+endothelial+cells+from+FasL-mediated+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis.</a> Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).</li>
<li>Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen+activator+inhibitor-1+promotes+inflammatory+process+induced+by+cigarette+smoke+extraction+or+lipopolysaccharides+in+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Lung+Res%22%5BJournal%5D)">Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells.</a> Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).</li>
<li>Ji, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+Targeting+of+Plasminogen+Activator+Inhibitor-1+Decreases+Vascular+Smooth+Muscle+Cell+Migration+and+Neointima+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Arterioscler+Thromb+Vasc+Biol%22%5BJournal%5D)">Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).</li>
<li>Carmeliet, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+role+of+plasminogen+activator+inhibitor-1+in+arterial+wound+healing+and+neointima+formation%3A+a+gene+targeting+and+gene+transfer+study+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice.</a> Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).</li>
<li>Cao, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocytic+receptor+LRP+together+with+tPA+and+PAI-1+coordinates+Mac-1-dependent+macrophage+migration%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration.</a> EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).</li>
<li>Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25342286">Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5).</a> Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).</li>
<li>Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasminogen+activator+inhibitor-1+is+a+critical+downstream+target+of+p53+in+the+induction+of+replicative+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence.</a> Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).</li>
<li>Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protumorigenic+activity+of+plasminogen+activator+inhibitor-1+through+an+antiapoptotic+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function.</a> J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).</li>
<li>Bennett, S., Breit, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variables+in+the+isolation+and+culture+of+human+monocytes+that+are+of+particular+relevance+to+studies+of+HIV%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV.</a> J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).</li>
<li>Geissmann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+monocytes%2C+macrophages%2C+and+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells.</a> Science. 327 (5966), 656-661 (2010).</li>
<li>Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+monocytes+undergo+excessive+apoptosis+following+temozolomide+activating+the+ATM%2FATR+pathway+while+dendritic+cells+and+macrophages+are+resistant%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant.</a> PLoS One. 7 (6), e39956(2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Compuesto por una variedad de tipos celulares, la TME es crucial para el desarrollo del cáncer. Para determinar las condiciones de crecimiento óptimo, las células cancerosas atraen monocitos a través de la secreción de factores quimiotácticos. Aquí presentamos un protocolo para estudiar el mecanismo de reclutamiento de monocitos por células tumorales en vitro. Para ello, se utiliza una combinación de sistema de expresión inducible gene, purificación de monocitos humanos primarios y como un ejemplo de un análisis...

Los macrófagos asociados tumor (TAMs) contribuyan al desarrollo de tumor por promover el crecimiento del tumor, metástasis y regular la respuesta inmune2. Cáncer células inflamatorias monocitos recluta, que infiltran el tumor y se diferencian en pro-tumorigenic TAMs3. Infiltración del tumor con TAMs correlaciona con mala evolución clínica y se ha relacionado con la función inmunosupresora de macrófagos4,5. Sin embargo, los mecanismos del reclutamiento de macrófagos que el tumor no se exploraron bien y una mejor comprensión de los caminos implicados es crucial para más adelanto del campo y prometedoras terapias. Uno de los retos en el estudio de las interacciones entre las células tumorales y células normales en el microambiente del tumor (TME) es la complejidad de los mecanismos y las células involucradas, que requieren enfoques en vitro que permiten la disección de la diafonía. Aquí presentamos una metodología versátil que puede ser aplicada para estudiar el efecto paracrino de un cáncer derivado de la célula, la proteína secretada sobre la migración de otros tipos celulares como macrófagos, en vitro. Utiliza un sistema donde la expresión de shRNA contra una cáncer derivado de células proteína que participa en el reclutamiento de monocitos está bajo el control del promotor inducible por tetraciclina, se cuantificaron el efecto paracrino de la proteína secretada en monocitos. En el presente Protocolo, la clonación de secuencias de shRNAs en la tetraciclina se presenta regulado vector seguido por generación de líneas celulares de cáncer estable. Además, la purificación de monocitos humanos primarios y un análisis de la cámara de Boyden se utilizan para analizar el efecto paracrino de una proteína de la célula de cáncer derivada sobre la migración de monocitos.
Downregulation de proteína codificación genes comúnmente se aplica con técnicas de siRNA y shRNA, aunque no sin limitaciones en su uso. La precipitación a largo plazo (KD) de genes puede provocar secundarias respuestas adaptativas de las células que interfieren con los resultados experimentales. Falta de control temporal sobre expresión génica hace difícil estudiar el papel dinámico de una proteína con el tiempo o el papel de una proteína crucial para la supervivencia de la célula. Esta cuestión es especialmente importante en entornos en vivo , donde el papel de una proteína en el desarrollo del tumor y la progresión podría requerir regulación a la baja de la expresión de la proteína de interés sólo después de establecido el tumor. KD condicional tiene la ventaja de evitar un pronto efecto letal del KD en las células y para permitir el análisis del papel de la proteína en diferentes etapas de crecimiento del tumor, mientras que KD incondicional podría resultar en la falta de desarrollo del tumor.
Un número de sistemas condicionales de KD se han desarrollado para abordar las limitaciones de la KD estable. Los sistemas de expresión génica condicional incluyen ecdisona-inducible sobreexpresión sistemas, el sistema de inducción de citocromo P-450 de1, y tetraciclina regulado sistemas de expresión de genes. Los sistemas de expresión de genes regulados por tetraciclina permiten control sobre la expresión de shRNAs sobre adición de antibiótico tetraciclina (o su análogo más estable - doxiciclina). En Tet-sobre los sistemas, se induce la expresión de shRNAs en presencia de tetraciclina/doxiciclina dando lugar a una expresión génica KD, mientras que en los sistemas de Tet-OFF, se suprime la expresión de shRNAs en presencia de tetraciclina que resulta en la expresión génica. Una desventaja del sistema inducible por tetraciclina es previamente divulgados bajos niveles de expresión de shRNAs en ausencia de doxiciclina - supuesta filtración6,7. En el Tet-sistema descrito aquí, sobre la administración de la tetraciclina, la Unión de la proteína represora (TET) de tetraciclina constitutivamente expresada a la Tet respuesta secuencia de elemento (TRE) dentro de la H1 es la región del promotor de shRNAs de interés suprimió. Esto resulta en la expresión de shRNA y la inhibición de la traducción de la proteína de interés en una manera dependiente de la tetraciclina8,9.
Otros sistemas de Tet-ON disponibles incluyen simultánea knock-in del TetO secuencia entre la caja TATA y el elemento de secuencia proximal (PSE) y entre transcripción y caja TATA Inicio Sitio desarrollado por Chan et al. 10 este sistema requiere menos dosis tóxicas de tetraciclina para regular la expresión del shRNA, sin embargo, bajo un estado de no inducido, niveles bajos de shRNA se expresan. La caja asociada a Krüppel (Cascarudo) basado en Tet-ON system11 incluye KRAB, una proteína dedo de zinc, que temas genes situados dentro de un rango de 3 kb del sitio de unión de KRAB supresión transcripcional. La tTRKRAB de la proteína quimérica puede enlazar a TetO, y debido a la amplia gama de capacidad controlable de ADN, TetO no necesita ser limitada entre la transcripción comienzan sitio y el promotor y tiene bajo impacto sobre la actividad del promotor. Bajo estado no inducida, informó de este sistema controlable de interferencia de RNA para mostrar un menor nivel de expresión se filtró de shRNAs11,12; sin embargo, requiere un enfoque alternativamente, dos vectores de clonación. En comparación con sistemas de KD condicionales previamente desarrollados como el sistema inducible por la ecdisona de sobreexpresión o sistema de inducción de citocromo P-450, sistema reglamentado de tetraciclina tiene la ventaja de su robustez y su reversibilidad y por lo tanto es la más habitualmente utilizada sistema13. El sistema utilizado en el presente Protocolo tiene la ventaja sobre el TetO doble knock-en sistema y KRAB Tet-ON requiere vector recto hacia adelante, solo la clonación, que permite la generación rápida de múltiples clones, y presenta niveles muy bajos de filtración en la ausencia de doxiciclina.
TME es fundamental para el desarrollo del cáncer. Para facilitar el crecimiento del tumor, las células de cáncer reclutan monocitos inflamatorios secretando proteínas quimiotácticas. Monocitos reclutados infiltran el tumor y se diferencian en pro-tumorigenic TAMs que contribuyen al crecimiento del tumor y la metástasis. Estudios in vitro del reclutamiento de células inmunes utilizan ensayos de migración, con Boyden, ensayo de cámara siendo ampliamente usado14,15,16,17. En este ensayo, la fuente de proteína chemoattractant, por ejemplo, las células cancerosas, o una proteína purificada, se coloca en la cámara inferior. Las células inmunes se colocan en el compartimiento superior separado por membrana porosa del compartimiento inferior. Las células migran hacia el gradiente de aumento de chemoattractant y los que se encuentran en la parte inferior de la membrana son manchadas y contaron con el microscopio. Aquí probamos la chemoattractant función de inhibidor de activador del plasminógeno 1 (PAI-1) en monocitos mediante la generación de líneas celulares de cáncer estable, inducible en expresión de PAI-1 es regulada por la adición de doxiciclina. Utilizamos monocitos humanos primarios en el ensayo de migración cámara de Boyden para evaluar el papel de PAI-1 en la migración de monocitos. Diferencias entre monocitos humanos primarios y líneas de células monocytic ampliamente utilizado como THP1 han divulgado y son de patrones de expresión de citoquinas diferentes18; por ejemplo, 5-10 veces aumento en los niveles de expresión de TNF-α por las células THP1 comparado con monocitos humanos19. Las células THP1 se derivan de las células monocytic de la leucemia humana, son fáciles de mantener y proliferan con una media de tiempo de 19-50 h20de duplicación. Por el contrario, los monocitos humanos se caracterizan por una vida corta en ausencia de factores de crecimiento. Desde monocitos son purificados de sangre de los donantes, una gran cantidad de variabilidad que se produce entre los individuos y según el método de purificación, puede producirse la contaminación con otros tipos de células. Sin embargo, los monocitos primarios son relevantes y se ha recomendado utilizar o confirmar los resultados obtenidos con las líneas de células monocytic en monocitos primarias de investigación biológica19. Aquí se describe un protocolo para la purificación de monocitos humanos primarios de la sangre periférica. Otros métodos de purificación de monocitos son protocolos de densidad gradiente y adherencia y procedimiento de dos pasos con solo gradientes de Ficoll-Hypaque, seguido de un gradiente de Percoll21. La pureza de la población de monocitos obtenida por esas gamas de métodos entre 70-90%. El método descrito aquí utiliza un gradiente de densidad, seguido de una selección negativa inmune22 y permite la purificación de monocitos humanos sin contacto directo con los anticuerpos, así evitando su activación accidental y resultando en un > 95% de la población pura de monocitos.
El protocolo presentado aquí se utiliza para establecer un sistema funcional de Tet-ON para expresión génica KD en líneas celulares de cáncer humano para estudiar el efecto de chemoattractant del cáncer secretan la proteína derivada del PAI-1 en monocitos. PAI-1 se sobre expresa por una variedad de tumores y paradójicamente, su expresión se correlaciona con resultado clínico pobre23,24. El papel pro-tumorigenic de PAI-1 es el resultado de su pro-angiogénicos y anti-apoptotic funciones25,26. PAI-1 se ha demostrado para contribuir a los inflamación promoviendo el reclutamiento de macrófagos al sitio de inflamación27. PAI-1 fue demostrado para promover el músculo liso cellmigration28,29 y a participar en el Mac-1 dependiente macrófago migración30. Sobre-expresión de PAI-1 también ha demostrado mejorar significativamente el reclutamiento de macrófagos Raw 264.7 en de los tumores de melanoma B16F1031. Sin embargo, el papel de PAI-1 en la migración de TAM no ha sido investigado en detalle. Utilizamos el protocolo descrito para responder a la pregunta de si el PAI-1 atrae monocitos a las células cancerosas. Esta metodología permite la disección de la diafonía entre tumor y TME por silenciar la proteína secretada en las células del cáncer y analizar los componentes de lo TME.

<table><tbody><tr><td>Vector lentiviral Tet-pLKO-puro</td><td>Addgene</td><td>21915</td><td></td></tr><tr><td>FBS (sin tetraciclina)</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-15</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10771-500ML</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Kit de enriquecimiento de monocitos humanos</td><td>StemCell</td><td>19059</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>StemCell</td><td>18002</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI HF</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>AgeI HF</td><td>NEB</td><td>R3552S</td><td></td></tr><tr><td>Cortar Tampón inteligente</td><td>NEB</td><td>B7200S</td><td></td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>PROMEGA Wizard SV Sistema de limpieza de gel y PCR</td><td>PROMEGA</td><td>A9281</td><td></td></tr><tr><td>psPAX vector</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G vector</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 Químicamente competente&nbsp;E. coli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Hema 3 juego de tinción para el protocolo de tinción de Wright-Giemsa</td><td></td><td>123-869</td><td></td></tr><tr><td>células HEK293</td><td>ATCC</td><td>CRL-1573</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Enzima de restricción XhoI</td><td>NEB</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Ligasa</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>Tampón de ligasa</td><td>NEB</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M solución</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R1021</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>The Big Easy" EasySep Magnet</td><td>Stem Cell</td><td>18001</td><td></td></tr><tr><td>0.1% Solución de Poly-L-Lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8920</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7670</td><td></td></tr><tr><td>Butirato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; Filtros de jeringa</td><td>M VWR International</td><td>28145-479</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881-500g</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano (Tris)</td><td>Invitrogen</td><td>15504-020</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653-5 kg</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de magnesio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266-100g</td><td></td></tr><tr><td>ditioeritritol (DTE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8255-5g</td><td></td></tr><tr><td>etanol (EtOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>792780</td><td></td></tr><tr><td>triptona</td><td>Amresco</td><td>J859-500g</td><td></td></tr><tr><td>extracto de levadura</td><td>Fluka</td><td>70161-500g</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>ampicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9393-5g</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águila Modificada' s Medio (DMEM)</td><td>Corning</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Corning</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanoácido sulfónico (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>puromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9620</td><td></td></tr><tr><td>Hicalato de doxiciclina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9891-25g</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)</td><td>Corning</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R1021</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Soporte permeable para placa de 24 pocillos con 8.0&mu; m Membrana de PET transparente</td><td>Becton Dickinson</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina de suero bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>Aplicador con punta de algodón&nbsp;</td><td>Medline</td><td>MDS202000</td><td></td></tr><tr><td>Protocolo Hema 3 Paquete STAT&nbsp;</td><td>Fisher Scientific Company</td><td>123-869</td><td></td></tr><tr><td>Resolve Aceite de inmersión, alta viscosidad</td><td>Richard Allan Scientific</td><td>M4004</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr></tbody></table>

condicional knockdown de genes en líneas celulares de cáncer para estudiar el reclutamiento de monocitos/macrófagos que el microambiente del tumor

Conditional Knockdown of Gene Expression in Cancer Cell Lines to Study the Recruitment of Monocytes/Macrophages to the Tumor Microenvironment

siRNA y shRNA-mediada derribar los métodos de regulación de la expresión génica (KD) son herramientas muy valiosas para entender la función del gen y proteína. Sin embargo, en el caso que la KD de la proteína de interés tiene un efecto letal sobre las células o el efecto esperado del KD es dependiente del tiempo, incondicionales métodos KD no son apropiados. Sistemas condicionales son más adecuados en estos casos y han sido objeto de mucho interés. Estos incluyen sistemas de sobreexpresión de ecdisona-inducible, citocromo P-450 inducción sistema1, y la tetraciclina regulado sistemas de expresión de genes.
El sistema de expresión de gene de tetraciclina regulado permite control reversible sobre la expresión de la proteína por la inducción de expresión de shRNAs en presencia de tetraciclina. En este protocolo, se presenta un diseño experimental utilizando sistema Tet-ON funcional en líneas celulares de cáncer humano condicional regulación de la expresión génica. Entonces se demuestra el uso de este sistema en el estudio de la interacción monocito célula de tumor.

Tres secuencias de shRNAs fueron probadas para el KD más eficiente de PAI-1. Para ello, secuencias shRNA contra PAI-1 y revueltos (tabla 1) se clonaron en vectores de expresión Tet-pLKO-puro siguiendo el protocolo descrito anteriormente. La línea de células de fibrosarcoma HT 1080 fue estable transfected con constructos generados y las células fueron tratadas con doxiciclina durante 3 días. La expresión de PAI-1 se verificó por Western Blot ()<strong clas...

Este protocolo sirve como un esquema para establecer un sistema funcional de Tet-ON en líneas celulares de cáncer y su posterior utilización, en particular para estudiar el papel de proteínas derivadas de células de tumor en el reclutamiento de monocitos/macrófagos que el microambiente del tumor.

Condicional Knockdown de genes en líneas celulares de cáncer para estudiar el reclutamiento de monocitos/macrófagos que el microambiente del Tumor

siRNA and shRNA-mediated knock down (KD) methods of regulating gene expression are invaluable tools for understanding gene and protein function. However, ...

El conjunto de este protocolo consiste en utilizar la desactivación condicional de la expresión génica en las células cancerosas para estudiar el reclutamiento de monocitos y macrófagos en el microambiente tumoral in vitro. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del microambiente tumoral con respecto a la naturaleza del intercambio entre las células cancerosas y las células del sistema inmunitario. La principal ventaja de esta técnica es que el sistema utilizado aquí requiere la clonación de un solo vector, permite la generación rápida de múltiples clones y exhibe niveles muy bajos de espesor.También se ha demostrado un método para la purificación de monocitos humanos sin contacto directo con anticuerpos, que evita la activación accidental y da como resultado una población pura de más del 95% de monocitos humanos. Para producir partículas virales, transfecte placas de 150 milímetros confluentes al 70% de células HEK-293 con 25 microgramos de shRNA pLKO-tet-on, 25 microgramos del plásmido de empaquetamiento psPAX y cinco microgramos del plásmido que expresa la envoltura pMD2. G utilizando reactivo de transfección según protocolos estándar.Agregue la mezcla

conditional-knockdown-gene-expression-cancer-cell-lines-to-study

Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

Fuente: Kubala, M. H. &amp; DeClerck, Y. A. Silenciamiento condicional de la expresión génica en líneas celulares de cáncer para estudiar la reclutamiento de monocitos/macrófagos al microambiente tumoral. J. Vis. Exp. (2017)Este video demuestra la generación de líneas celulares cancerosas con inhibición genética condicional utilizando un sistema de ARNip inducible por Tet basado en lentivirus. Se describen los pasos para la transducción viral, la selección con antibióticos y el silenciamiento...

Generación de células con knockdown condicional mediante un sistema de expresión de shRNA lentiviral sensible a la tetraciclina

Describimos aquí un protocolo para investigar la citotoxicidad de CD8 pre-activado+ T las células contra las células cancerosas mediante la detección de apoptosis cáncer células vía en tiempo real la microscopia. Este protocolo puede investigar los mecanismos detrás de la supresión de la célula de T inducida por la célula mieloide y evaluar compuestos destinados a reposición de T las células vía bloqueo de células mieloides supresores inmunes.

Tiempo real detección de Vitro Tumor de la célula apoptosis inducida por CD8+ T las células para el estudio de las funciones inmunológicas de supresores de Tumor infiltrante de células mieloides

Aquí presentamos un protocolo para cuantificar la actividad quimiotáctica de los monocitos sanguíneos en modelos de ratón, para evaluar los efectos de las intervenciones nutricionales, farmacológicas y genéticas en los monocitos sanguíneos y para caracterizar los monocitos sanguíneos derivados de los macrófagos en modelos de ratón utilizando tapones de gel de membrana de sótano cargados de monocitos-quimioattractant-1 (MCP-1).

Cuantificación de la actividad quimiotáctica monocitos en Vivo y caracterización de los macrófagos derivados de monocitos sanguíneos

Este artículo representa un ensayo in vitro útil para evaluar la capacidad del medio acondicionado de las células tumorales para atraer macrófagos.

Ensayo In Vitro para estudiar la interacción tumor-macrofago

Para probar el efecto de una quimiocina en el reclutamiento in vivo de macrófagos, se utilizó toda la hibridación in situ del monte para detectar la expresión ectópica de la quimiocina, y se utilizó inmunomanchado para etiquetar los macrófagos. Las imágenes en vivo se utilizaron para la observación en tiempo real de la migración de macrófagos.

Un modelo de expresión de chemocina ectópico para probar el reclutamiento de macrófagos in Vivo

Aquí, presentamos un método utilizando soportes de membrana permeables para facilitar el estudio de la señalización paracrina sin contacto utilizada por las células tumorales para suprimir la respuesta inmune. El sistema es susceptible de estudiar el papel de los factores secretos por tumores en la desactivación de los macrófagos de amortiguación.

Estudio de los efectos de los ligandos paracrinos secretos de tumor en la activación de macrófagos utilizando co-cultivo con soportes de membrana permeable

Este protocolo utiliza reporteros fluorescentes y clasificación celular para simplificar los experimentos en cadena en líneas de macrófagos y células T. Se utilizan dos plásmidos para estos experimentos simplificados de knock-in, a saber, un plásmido que expresa CRISPR / Cas9 y DsRed2 y un plásmido donante de recombinación homóloga que expresa EBFP2, que se integra permanentemente en el locus Rosa26 en las células inmunes.

Knock-in de genes por CRISPR/Cas9 y clasificación celular en líneas de macrófagos y células T

Este artículo describe un flujo de trabajo de técnicas empleadas para probar nuevos mediadores candidatos de metástasis de melanoma y sus mecanismos de acción.

Una plataforma de descubrimiento robusta para la identificación de nuevos mediadores de la metástasis del melanoma

Aquí, presentamos un protocolo para investigar la interacción de macrófagos primarios derivados de monocitos humanos con un esferoide tumoral en una matriz tridimensional (3D) de colágeno I, con la posibilidad de comparar el impacto de las propiedades solubles y físicas del microambiente en la invasión celular.

Ensayo de coinvasión de esferoides macrófagos y tumores

Dados los modelos de xenoinjerto limitados disponibles para estudiar las interacciones entre CART humano y células mieloides, establecimos modelos in vitro e in vivo para comprender los impactos de los macrófagos humanos en las células CART. Los hallazgos pueden generalizarse potencialmente para evaluar las funciones de los macrófagos en el microambiente tumoral y probar inmunoterapias dirigidas a macrófagos.

Estudio de las interacciones entre las células mieloides y las células T con CAR in vitro e in vivo

Aprende el knockdown condicional de genes en líneas celulares de cáncer usando el sistema Tet-ON para estudiar el reclutamiento de monocitos y macrófagos al microambiente tumoral.

Condicional Knockdown de genes en líneas celulares de cáncer para estudiar el reclutamiento de monocitos/macrófagos que el microambiente del Tumor (Video) | JoVE Journal

Condicional Knockdown de genes en líneas celulares de cáncer para estudiar el reclutamiento de monocitos/macrófagos que el microambiente del Tumor

Explorar más videos