Fabricación y validación de un sistema de órganos-en-viruta con electrodos integrados directamente cuantificar Transendothelial resistencia eléctrica

El objetivo general de este video es mostrar cómo fabricar y usar chips microfluídicos con electrodos integrados para mediciones de resistencia eléctrica transendotelial o transepitelial, o mediciones TEER. Esto se demuestra utilizando una barrera hematoencefálica en el chip microfluídico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los órganos en chips al permitir la medición directa de la función de barrera de, por ejemplo, el tejido de barrera hematoencefálica utilizando electrodos integrados.

La principal ventaja de nuestra técnica es que los electrodos se integran fácilmente en los sistemas Organ-on-Chip y que los resultados de esto se pueden comparar entre los diferentes sistemas. Las implicaciones de esta tecnología se extienden hacia la comprensión de la función de la barrera hematoencefálica en la salud y la enfermedad, el descubrimiento de fármacos y la medicina personalizada. Aunque este método se puede utilizar para proporcionar información sobre la función de la barrera hematoencefálica, también se puede utilizar en el contexto de otros sistemas Organ-on-Chip como el Lung-on-Chip y el Gut-on-Chip.

Para comenzar este procedimiento, mezcle bien 27 gramos de agente base PDMS y 2,7 gramos de agente de curado. A continuación, desgasifique la mezcla en un desecador durante aproximadamente 45 minutos para eliminar las burbujas de aire. Mientras tanto, prepare el molde para la mezcla líquida de PDMS pegando cinta transparente alrededor del molde o coloque el molde en un soporte de obleas adecuado.

Vierta la mezcla de PDMS desgasificada en el molde. A continuación, cure la mezcla de PDMS en un horno a 60 grados centígrados durante cuatro horas y deje que se enfríe después. En una campana de flujo cruzado, extraiga el PDMS curado del molde.

Corte la réplica del PDMS en partes de viruta superior e inferior separadas utilizando líneas de corte en el PDMS. A continuación, perfore cuatro agujeros en las partes superiores con un punzón de biopsia afilado de un milímetro de diámetro para formar entradas y salidas. Perfore de adentro hacia afuera para evitar que se acumulen residuos de PDMS en el chip.

A continuación, cubra las piezas de la viruta con cinta adhesiva transparente para protegerlas contra el polvo. Posteriormente, corte las membranas de policarbonato de los insertos transwell en cuadrados de aproximadamente tres por tres milímetros cuadrados. Después de eso, ensamble una membrana porosa sin fugas entre dos partes de PDMS para ensamblar un dispositivo de dos capas interconectado con una membrana porosa.

Para ello, prepare un mortero de tolueno PDMS utilizando 0,7 gramos de agente base PDMS, 07 gramos de agente de curado y 540 microlitros de tolueno. Agite el mortero a fondo, luego centrifuga 200 microlitros de mortero sobre un cubreobjetos de vidrio a 1500 rpm durante 60 segundos para adquirir una capa delgada y uniforme de mortero. A continuación, transfiera una fina capa de mortero desde el cubreobjetos a la parte inferior de la viruta con un rodillo de tinta.

Coloque la parte inferior en una fuente apta para horno y luego transfiera el mortero a la parte superior de la viruta. Con un juego de pinzas, sumerja los bordes de una membrana en el mortero espinado y colóquelo con cuidado en el centro de la parte inferior. Después de eso, coloque con cuidado la parte superior en la parte inferior mientras presta atención a la alineación.

Cubra las entradas de las virutas con cinta adhesiva transparente para evitar que el polvo entre en las virutas y hornéelas a 60 grados centígrados durante tres horas. Tener cuidado es muy importante en este paso. No ejerza presión sobre la viruta y no deslice la parte superior sobre la parte inferior, para evitar que el mortero ingrese a los canales y obstruya la membrana.

Para integrar los electrodos en los canales laterales, corte un alambre de platino en trozos de dos centímetros de largo. A continuación, sumérgelos en acetona durante 30 minutos. Luego enjuáguelos con agua y etanol y déjelos secar.

En una campana de flujo cruzado, coloque una viruta en un plato de plástico. Inserte cuatro alambres de platino en los canales de electrodos del chip con un par de pinzas y dóblelos hacia abajo sobre el plato de plástico para permitir la fijación al plato en el siguiente paso. Inserte los cables de 0,7 a un milímetro en el canal de cultivo más allá de la unión del canal en forma de T.

A continuación, aplique una gota de pegamento curable por UV en la entrada del canal del electrodo y deje que el pegamento llene el canal por fuerzas capilares. A continuación, encienda los rayos UV y cure el pegamento cuando llegue al final del canal del electrodo. Fijación de los cuatro electrodos integrados a la placa de plástico con un adhesivo epoxi de dos componentes.

Después de esto, cubra las papas fritas con cinta adhesiva transparente y hornee a 60 grados centígrados durante dos horas. Deje que se enfríen y guárdelos sin polvo hasta su uso. Para recubrir los chips y promover la adhesión de las células, primero llene ambos canales con PBS antes de introducir los reactivos.

Revise bajo un microscopio si hay burbujas de aire en los canales. Si es así, elimínelos enjuagándolos con PBS adicional. A continuación, llene ambos canales con 30 microlitros de 20 microgramos por mililitro de fibronectina humana en PBS.

Incubarlos a 37 grados centígrados durante tres horas. A continuación, enjuague las virutas con medio de crecimiento endotelial e incubelas a 37 grados centígrados durante dos horas. Después, mida el TEER de las virutas en blanco para asegurarse de que todos los electrodos estén en contacto directo con el fluido de los canales.

Para ello, tome un chip de la incubadora y deje que alcance la temperatura ambiente durante al menos diez minutos. Retire cualquier líquido de la placa de plástico alrededor de los electrodos para evitar la formación de puentes eléctricos fuera del chip. A continuación, tome el espectro de impedancia de 200 hercios a un megahercio por cada combinación de dos electrodos, lo que da como resultado seis espectros de impedancia por chip en cinco a diez minutos, a partir de los cuales se puede determinar directamente el TEER.

Compruebe si los espectros de impedancia tienen las magnitudes y formas esperadas para validar la medición de TEER. Ahora, prepare una suspensión celular para que se asiente en el canal superior retirando el medio de cultivo de un matraz de cultivo con monocapa confluente de células hcMEC/D3. Después de eso, lave las células con PBS.

Retire el PBS y luego agregue dos mililitros de EDTA de tripsina al 05 por ciento e incube a 37 grados centígrados durante dos a cinco minutos hasta que las células se hayan desprendido del matraz de cultivo. A continuación, desactive la tripsina con un medio de cultivo suplementado con un 20 por ciento de FBS. Cuente las celdas y calcule su número total en suspensión.

Mientras tanto, centrifuga las células hcMEC/D3 a 390 veces g durante cinco minutos. Luego, retire el sobrenadante y vuelva a suspender la pelletización de células en el volumen adecuado del medio de crecimiento endotelial para dar como resultado una concentración de cinco millones de células por mililitro correspondiente a una densidad de siembra de 200 mil células por centímetro cuadrado en el chip. A continuación, pipetee lentamente 30 microlitros de la suspensión celular bien mezclada en el canal superior y retire la pipeta de la entrada con un movimiento fluido sin dejar de ejercer presión.

Verifique la densidad de siembra bajo un microscopio. Se debe lograr una distribución uniforme de las células en todo el canal superior. A continuación, incube los chips a 37 grados centígrados y al cinco por ciento de dióxido de carbono durante al menos una hora.

Después, enjuague las células no adheridas con un medio de cultivo endotelial. Tenga en cuenta que TEER se monitorea durante el período de cultivo. Este es el espectro de impedancia esquemático típico que muestra la magnitud de la impedancia y el desplazamiento de fase frente a la frecuencia para la espectroscopia de impedancia eléctrica en chips sin celdas y con celdas.

Hay cuatro regiones principales que están dominadas por la capacitancia de doble capa en los electrodos, la resistencia del medio de cultivo, la resistencia de la barrera celular o la capacitancia de la membrana celular. La región de interés indica dónde se puede cuantificar la contribución de la capa celular. Y esta es la fórmula para calcular TEER a partir de las resistencias medidas entre las seis combinaciones de cuatro electrodos.

Aquí se muestra el TEER promedio de cuatro BBB en chips durante el período de cultivo de tres días, alcanzando una meseta de 22 más o menos 1,3 ohmios centímetro cuadrado. Para la comparación, se incluyen datos de chips en blanco, que muestran la variación marginal y la desviación de cero ohmios centímetros cuadrados en el mismo período en comparación con la variación en el valor de TEER de los chips con celdas. La microcopia de fluorescencia de los núcleos teñidos reveló una monocapa continua de endotelio tanto en el PDMS como en la membrana en la ubicación indicada en el recuadro.

La inmunofluorescencia reveló la presencia de la proteína de unión estrecha zonula occludens, lo que indica que las uniones estrechas específicas de BBB entre las células dan lugar al TEER medido. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de la fabricación y el uso de chips con electrodos integrados para mediciones de TEER en Organs-on-Chips. Esta técnica se puede utilizar en el campo de la investigación de la barrera hematoencefálica para estudiar la administración directa y las características de la enfermedad en, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer.

Siguiendo este procedimiento, la función de barrera del endotelio cerebral diferenciada de las células madre pluripotentes inducidas de origen humano también se puede monitorear para aplicaciones en medicina personalizada.