Name: Fabricación y validación de un sistema de órganos-en-viruta con electrodos integrados directamente cuantificar Transendothelial resistencia eléctrica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Aprende a fabricar un sistema de órganos-en-viruta con electrodos integrados para medir directamente la resistencia eléctrica transendotelial en modelos de barrera hematoencefálica.

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Agradecemos a Johan Bomer para fabricación del molde y Mathijs Bronkhorst para discusiones fructíferas y asistencia a la representación de los datos.
Esta investigación fue financiada por: SRO microdispositivos de L.I. Segerink, MIRA Instituto de biomédica de la ingeniería biomédica y la medicina técnica, Universidad de Twente; SRO órganos-on-Chips de A.D. van der Meer, MIRA Instituto de ingeniería biomédica y la medicina técnica, Universidad de Twente; y VESCEL, ERC Advanced Grant a A. van den Berg (grant no. 669768).

1. fabricación del dispositivo de órgano-on-chip <ol><li>hacer una réplica PDMS de un molde con los diseños de canales, fabricados mediante técnicas de fotolitografía estándar y obtener las piezas PDMS del chip de microfluidos.
	<ol><li>Pesa aproximadamente 27 g PDMS base agente y agente endurecedor 2,7 g; la relación entre la masa tiene que ser 10:1. Esto es bueno para una losa de PDMS de espesor 3 mm en un molde con diámetro de 130 mm (5 pulgadas). Estos componentes se mezclan completamente.</li>
		<li>Desgasificar la mezcla en un desecador durante aproximadamente 45 minutos para eliminar las burbujas de aire.</li>
		<li>Mientras tanto, preparar el molde para la mezcla líquida de PDMS de pegar cinta adhesiva transparente en el molde o colocar el molde en un soporte adecuado de la oblea.</li>
		<li>Vierta la mezcla desgasificada de PDMS en el molde. Si el aire que las burbujas permanecen en la mezcla PDMS o en la superficie del molde, lo degas otra vez durante aproximadamente 30 minutos</li>
		<li>Curar la mezcla PDMS en una estufa a 60 ° C durante 4 h. permita que se enfríen.</li>
		<li>En una campana de flujo cruzado, tire el PDMS curado del molde, el molde se puede reutilizar inmediatamente para hacer réplicas PDMS más.</li>
		<li>Cortar la réplica PDMS en separado parte superior y parte inferior chip partes mediante líneas de corte en el PDMS.</li>
		<li>Perforar cuatro agujeros en la parte superior con un punch de biopsia sharp con 1 mm de diámetro en forma de entradas y salidas. Sacador del interior al exterior para prevenir los desechos PDMS de recoger en el chip. Cubrir las partes del chip con cinta transparente para protegerlos contra el polvo.</li>
		<li>Cortar las membranas de policarbonato de Transwell insertos cuadrados de aproximadamente 3 × 3 mm 2.</li>
	</ol></li> <li>Montar una membrana porosa libre de fugas entre dos partes PDMS para montar un dispositivo de dos capas unida con una membrana porosa. 
	Nota: Este protocolo es adaptado de Griep et al. 19 y Chueh et al. 26 <ol><li>preparar un mortero PDMS/tolueno con 0,7 g de agente base PDMS, 0,07 g de agente de curado y 540 μl de tolueno, resultando en una proporción de 5:3. Vórtice el mortero bien.</li>
		<li>Spin-capa 200 μL de mortero sobre un cubreobjetos de vidrio a 1500 rpm por 60 s (aumentado a 1000 rpm/s) para adquirir una capa fina y uniforme de mortero.</li>
		<li>Transferir una capa delgada de mortero de lo cubreobjetos sobre una parte inferior y parte superior de la viruta con un rodillo de tinta. Poner la parte de abajo en un plato apto para horno.</li>
		<li>Con un sistema de pinzas, sumerja los bordes de una membrana en el mortero cubierto de vuelta y colóquelo cuidadosamente en el centro de la parte inferior</li>
		<li>Con cuidado coloque la parte superior en la parte inferior prestando atención a la alineación. 
		Nota: No ejerza presión sobre el chip y deslice la parte superior sobre la parte inferior para evitar que el mortero de entrar en los canales y la obstrucción de la membrana.</li>
		<li>Cubrir las entradas de fichas con cinta transparente para evitar que el polvo penetre en el chip y hornear a 60 ° C durante 3 h.</li>
	</ol></li> <li>Integrar los electrodos en los canales de la cara. 
	Nota: Este protocolo es adaptado de Griep et al. 19 y Douville et al. 18 <ol><li>cortar alambre de platino en trozos de aproximadamente 2 cm. limpiar por sumergirse en acetona durante 30 minutos enjuague con agua y etanol y dejar para secar.</li>
		<li>En una campana de flujo cruzado, poner un chip en un plato plástico. Inserte cuatro alambres de platino en los canales de electrodo de un chip con un par de pinzas y doblarlas hacia abajo sobre el plato de plástico para permitir la fijación en el plato en un paso posterior. Inserte los cables 0.7-1 mm en el canal cultura, pasado el cruce del canal en forma de T.</li>
		<li>Aplique una gota de pegamento UV-curable en la entrada del canal de electrodo y el pegamento llenar el canal alrededor del electrodo por fuerzas capilares.</li>
		<li>Interruptor UV y curado el pegamento cuando llega al final del canal del electrodo. 
		PRECAUCIÓN: No mire a la fuente de luz UV como esto puede dañar sus ojos.</li>
		<li>Para fijar los cuatro electrodos integrados para el plato de plástico con un pegamento de epoxy de dos componentes. Esto permite facilitar la manipulación de los electrodos durante las mediciones sin el riesgo de tirar los electrodos desde el chip.</li>
		<li>Cubrir las virutas con cinta transparente y hornear a 60 ° C por 2 h. permita que se enfríe y almacene polvo hasta su uso. De esta manera puede ser almacenado con seguridad por hasta un mes.</li>
	</ol></li></ol> 2. Cultivo de células endoteliales derivado del cerebro en un chip <ol><li>capa de los chips para promover la fijación de la célula.
	<ol><li>Llene ambos canales con fosfato tampón salino (PBS) para mojar antes de introducir los reactivos. Ver bajo el microscopio si hay burbujas de aire en los canales. Si es así, quite por lavado con PBS extra.</li>
		<li>Llenar ambos canales con 30 μl de fibronectina humana de 20 μg/mL en PBS. Incubar a 37 ° C durante 3 horas. Verifique las burbujas de aire y, si es necesario, limpie los canales con PBS y rellene con fibronectina solución.</li>
		<li>Limpie las virutas con medio de crecimiento endotelial e incúbelos a 37 º C y 5% CO 2 en una incubadora durante 2 h.</li>
		<li>Medir el TEER de las fichas en blanco tal como se describe en el paso 3 para garantizar que todos los electrodos están en contacto directo con el fluido en los canales. En fichas vacías, los valores típicos de TEER son 0-1 Ω cm 2.</li>
	</ol></li> <li>Las células de la semilla en el canal superior.
	<ol><li>Retire el medio de cultivo de un frasco de cultivo (área de cultura de 75 cm 2) con una monocapa confluente de células endoteliales microvasculares cerebrales humanas (D3/hCMEC).</li>
		<li>Lavar las células con PBS. Añadir 2 mL de tripsina 0,05%-EDTA e incubar a 37 ° C y 5% CO 2 para 2-5 minutos hasta que las células han separado del frasco de cultura.</li>
		<li>Desactivar la tripsina con medio de cultivo suplementado con suero bovino fetal (FBS) de 20%. Contar las células y calcular el número total de células en suspensión.</li>
		<li>Mientras tanto, centrifugar las células hCMEC/D3 a 390 x g durante 5 minutos y retirar el sobrenadante.</li>
		<li>Resuspender el precipitado de células en el volumen adecuado de medio de crecimiento endotelial (EGM-2) para llegar a una concentración de 5 x 10 6 células/mL. Esto se traduce en una densidad de siembra de 2 x 10 5 células/cm 2 en el chip.</li>
		<li>Lentamente pipetee 30 μl de la suspensión bien mezclado de la célula en el canal superior y retire la pipeta de la entrada en un movimiento fluido y sigue ejerciendo presión.</li>
		<li>Comprobar la densidad de siembra bajo un microscopio. Debe lograrse una distribución uniforme de las células en el canal superior.</li>
		<li>Incubar las virutas a 37 ° C y 5% CO 2 para por lo menos 1 h. eliminar cualquier célula no inscritos con medio de cultivo endotelial.</li>
	</ol></li> <li>Mantener la cultura endotelial de la en-viruta.
	<ol><li>Dos veces por día, insertar las puntas de pipeta llena de medio de cultivo como reservorios en las entradas y cambiar el medio dentro de la viruta por flujo de gravedad. 
		Nota: Para evitar burbujas de aire entrar en los microcanales y destruyendo la capa de células, asegúrese de hacer contacto líquido-líquido entre la punta de la pipeta y el líquido en la parte superior del chip antes de insertar la punta en una entrada. Esto puede facilitarse mediante la adición de una pequeña gota en la en / salida antes de la inserción de la pipeta.</li>
		<li>Añadir depósitos de punta de pipeta en los enchufes para evitar que los canales seque.</li>
		<li>Incubar las virutas a 37 ° C y 5% CO 2.</li>
	</ol></li></ol> 3. Mediciones de TEER en chip <ol><li>configurar the aparato de medición de TEER, consisten en un amplificador lock-in y un circuito de cable de la sonda como se especificó en Van der Helm et al. 16 por otra parte, analizadores de aplicación o impedancia también son adecuados para estas medidas de TEER impedancia.</li>
	<li>Tomar el chip de la incubadora y permita que alcance la temperatura ambiente durante al menos 10 min retirar cualquier líquido del plato plástico alrededor de los electrodos para evitar electrodo puente fuera el chip de.</li>
	<li>Tomar el espectro de impedancia de 200 Hz a 1 MHz para cada combinación de dos electrodos, dando por resultado 6 espectros de impedancia por chip en sólo 5-10 minutos Compruebe si los espectros de impedancia tienen las magnitudes esperadas y formas para validar la medición de TEER, como es se describe en la sección de resultados.</li>
	<li>Volver a poner el chip en la incubadora a 37 ° C y 5% CO 2 después de terminar la medición.</li>
	<li>Procesar los espectros de impedancia obtenidos para llegar a un valor normalizado de TEER.
	<ol><li>Get medido resistencia <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq1.jpg"> entre electrodos <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq2.jpg"> y <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq3.jpg">, como se indica en la figura 2B y D, de la meseta resistente a 10 kHz en los espectros de impedancia correspondiente.</li>
		<li>Calcular el TEER utilizando las seis resistencias medidas correspondiente a un chip a la vez punto utilizando la ecuación de 2 Figura 16: 
		<img alt="Equation 20" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq20.jpg"> en esta ecuación, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq4.jpg"> es el área de la cultura a través del cual se midió la resistencia &lt; img alt = " Ecuación 5"src="/files/ftp_upload/56334/56334eq5.jpg "/ &gt; es la resistencia de la barrera celular y la membrana, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq6.jpg">, <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq7.jpg">, <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq8.jpg"> y <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq9.jpg"> son la resistencia los valores medidos a través de la barrera celular y <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq10.jpg"> y <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/56334/56334eq11.jpg"> son los valores de resistencia medidos en la canales rectos. 16 la ecuación se deriva el circuito equivalente que se muestra en la figura 2.</li>
	</ol></li> <li>Restar el TEER en blanco de TEER en todos los puntos de tiempo para obtener el desarrollo de la TEER tiempo.</li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este manuscrito, se presentaron la ingeniería de un dispositivo de órgano-on-chip y la determinación directa de la resistencia eléctrica de transendothelial (TEER) una barrera celular cultivado en el dispositivo. El método presentado de la integración de electrodos sin equipo de sala limpia y la determinación directa de TEER usando cuatro electrodos es aplicable a cualquier dispositivo de órgano-on-chip con dos compartimentos de microfluidos. El diseño de chip y la geometría pueden ser adaptados para caber los requisitos de los experimentos previstos, mientras los cuatro electrodos se separan en dos compartimientos. Los cuatro electrodos pueden incluso convenientemente insertarse en las entradas de fichas existentes, siempre y cuando se fijación en lugar por la duración de las mediciones de seis. El método de unión libre de fugas puede optimizarse para diferentes membranas y geometrías canal cambiando la proporción PDMS/tolueno. Un mayor contenido de tolueno resulta en una capa de recubrimiento centrifugado más fina de mortero26 y puede ser más conveniente para los canales de menos y más estrechos en las partes PDMS. Un menor resultados contenido tolueno en un mortero más grueso capa26 y pueden ser más adecuados incluir más gruesas membranas entre las partes PDMS.
Como puede verse en los espectros de impedancia esquemática en la figura 2A y los espectros experimentales Figura 2E y 2F, las mediciones de impedancia son influenciadas por la capacitancia de doble capa en la interfase electrodo-medio. Debido al pequeño tamaño de los electrodos dentro de los microcanales, la capacitancia de doble capa puede dominar sobre la meseta resistente de la barrera celular en espectros de impedancia, que complica la cuantificación de la TEER. Para superar esto, se pueden insertar los electrodos en los canales de cultura antes de la fijación. Esto aumentará la superficie del electrodo expuesto al medio de cultivo y con que la capacitancia de doble capa se incrementará también. Esto resulta en un cambio de la pendiente capacitiva a frecuencias más bajas, por lo que la meseta resistente de la barrera celular puede ser más fácilmente reconocido y cuantificado. Aunque la resistencia de la vía medida entre dos electrodos será menor, esto no influirá en la cuantificación de TEER siguiendo el método presentado.
Durante la medición a través de la barrera celular, es posible que no se puede reconocer la meseta extra resistente. Esto puede ser el resultado de una conexión fluídica entre los dos canales, por ejemplo, si la membrana está mal cerrada por el mortero, conduce a un trazado medido alrededor de la barrera celular. Además, puede haber un puente eléctrico fuera de la viruta si los electrodos son conectados por una gota de medio de cultivo. Esto generalmente se combina con una impedancia inferior medida y puede resolverse mediante la eliminación de esta puente de medio de cultivo. Por último, si hay no hay meseta resistiva y la impedancia medida es órdenes de magnitud mayores de lo esperado, puede ser una conexión suelta en el cableado o en la fuente de alimentación.
En el futuro, se puede aumentar la relevancia fisiológica de la BBB-on-chip actual exponiendo las células endoteliales para distorsionar el estrés a nivel fisiológico, que se divulga para promover la tirantez BBB diferenciación y aumento de la barrera y es difícil de lograr en modelos convencionales en vitro . 29 además, el canal de la parte inferior del dispositivo presentado proporciona un compartimiento conveniente para las células derivadas de cerebro ser cultivadas conjuntamente con el endotelio. Esto también se espera que aumente la función de barrera y también permite el estudio de las complejas interacciones entre los tipos de células relevantes en condiciones patológicas. 29
En conclusión, el órgano-en-viruta descritos en esta publicación pueden ser fabricados usando equipo normal de laboratorio y se muestra para proporcionar mediciones directas de TEER usando cuatro electrodos integrados que impiden la inspección visual de la célula estudiada capa. La aplicabilidad de este dispositivo en el campo de órganos-on-chips fue demostrada por mímico el BBB en este chip y seguimiento el TEER durante el período de cultivo. Un anfitrión de otros órganos (barrera) se puede mímico por incluyendo otros tipos de células relevantes en este chip. Además, el método para medir TEER puede aplicarse fácilmente en otros dos compartimiento-órgano-en-viruta dispositivos para llegar a valores TEER reproducibles y significativos que pueden compararse a través de dispositivos y sistemas.

Órganos-on-chips son rápidamente emergiendo como una nueva y prometedora clase de in vitro modelos de tejido. 1 en estos modelos, las células se cultivan dentro de dispositivos de microfluidos que están diseñados de tal manera que imitan el microambiente fisiológico de las células. 1 , 2 el resultado más realista comportamiento fisiológico o patológico de las células que se puede esperar de los modelos convencionales en vitro de diseño simple y funciones básicas. 3 , 5 , 6 además, órganos en fichas proporcionan un mejor ambiente controlable que en vivo los modelos y pueden incorporar tejido sano y enfermo de origen humano para replicar fielmente la patología y fisiología humana. Los avances recientemente resumidos en el desarrollo de barreras de sangre – cerebro en chips (BBBs en virutas) muestran que el campo está avanzando rápidamente hacia adelante. 7
Otra ventaja de órganos en fichas es que permiten monitoreo en tiempo real y continuo del tejido cultivado dentro del dispositivo por microscopía, análisis bioquímicos en línea y sensores integrados. 1 , 2 por ejemplo, medición de resistencia eléctrica transendothelial o transepitelial (TEER) es un método eficaz para el control de forma no invasiva el desarrollo y la interrupción de la formación de barrera de los tejidos. 8 , 9 , 10 TEER es la resistencia eléctrica a través de una barrera celular y por lo tanto es indicativo de la integridad de la barrera y la permeabilidad. 10 órganos en astillas las barreras celulares se cultivan generalmente en una membrana que separa dos canales fluídicos, que representa el apical y basolateral compartimientos de ese tejido de barrera. En tales fichas, mediciones de TEER pueden realizarse convenientemente con electrodos insertados en las entradas y salidas de los dos canales. 3 , 4 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 sin embargo, inserción manual y reinserción de los electrodos pueden fácilmente resultar en errores de colocación y en las variaciones en la resistencia como por ejemplo las diferencias en la resistencia de los caminos más largos o más cortos a través de microcanales son significativos en comparación con la resistencia de la barrera de la célula. 16 para eliminar errores de reinserción, aparatos con electrodos integrados se han propuesto. Sin embargo, la mayoría de estos electrodos integrados bloquean la vista, al inspeccionar el cultivo de tejidos17,18,19,20,21 o requieren especializados sala de procesos para la fabricación. 17 , 22
El dispositivo de órgano-en-viruta descrito en esta publicación, aplicado por primera vez en una publicación anterior,16 combina la estabilidad de los electrodos integrados con visibilidad en la capa de la célula medida y la facilidad de fabricación. El diseño y la fabricación de este chip se muestra en la figura 1. En Resumen, este aparato consta de dos partes de polidimetilsiloxano (PDMS) con las impresiones del canal que son enlazadas juntos libre de fugas con una membrana de policarbonato con 0.4 μm los poros en el medio. Cuatro electrodos de alambre de platino se introduce y fija en su lugar con un fotocurables adhesivo bien fuera del área de cultura. Todos estos pasos de fabricación pueden realizarse con equipos de laboratorio, sin necesidad de un ambiente de sala limpia. Además de esto, se pueden hacer seis mediciones de impedancia utilizando estos cuatro electrodos, permitiendo aislamiento directo de medida TEERAN, independiente de la resistencia de los microcanales conduce a la sección transversal y así minimizar la influencia de variaciones no-biológicos en el sistema tales como (re) errores de inserción. 16
Para demostrar la aplicabilidad de este dispositivo y las mediciones directas de TEER, que la barrera blood - brain (BBB) fue replicada en este chip. Esta barrera biológica consiste en células endoteliales especializadas y regula el transporte entre sangre y cerebro para proporcionar la homeostasis cerebral. 23 , 24 para imitar la BBB, el canal superior del dispositivo microfluídico fue alineado con células endoteliales microvasculares cerebrales humanas de la línea celular hCMEC/D3 (proporcionado amablemente por el Dr. P.-O. Couraud, INSERM, París, Francia). 25 el método presentado es, sin embargo, más generalmente aplicable a cualquier dispositivo de órgano-on-chip con dos compartimientos, permitiendo la determinación directa de TEER utilizando fácilmente integrados electrodos.
En este manuscrito, primero se describe el proceso de fabricación del dispositivo de órgano-en-viruta con electrodos integrados. Siguiente, el procedimiento siembra y cultivo de células endoteliales cerebrales dentro del aparato se explica, así como las medidas de TEER la en-viruta. En la sección de resultados, se muestran mediciones representativas de TEER y procesamiento de datos se clarifica. Por último, la función de barrera de la BBB-on-chip, monitoreado durante 3 días, se presenta, demostrando la aplicabilidad de los métodos para monitorear TEER y dispositivo presentado.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Materiales</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agente base de polidimetilsiloxano (PDMS) y agente de curado: Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona</td><td>Dow Corning</td><td>1673921</td><td></td></tr><tr><td>Scotch Magic tape</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Punzón de biopsia, 1,0 mm de diámetro</td><td>Integra Miltex</td><td>33-31AA-P/25</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de policarbonato, 0,4 y micro; m tamaño de poro</td><td>Corning</td><td>3401</td><td>Corte de insertos de cultivo Transwell</td></tr><tr><td>Tolueno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>244511</td><td></td></tr><tr><td>Alambre de platino, 200 &micro; m diámetro</td><td>Alfa Aesar</td><td>10287</td><td></td></tr><tr><td>Adhesivo curable por UV: Norland Optical Adhesive 81</td><td>Norland Products</td><td>NOA 81</td><td></td></tr><tr><td>Adhesivo epoxi: Loctite M-31 CL Hysol</td><td>Henkel</td><td>30673</td><td></td></tr><tr><td>hCMEC/D3 cells</td><td></td><td></td><td>Línea celular endotelial microvascular cerebral humana, amablemente proporcionada por el Dr. P.-O. Couraud, INSERM, París, Francia</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina plasmática humana, 20 &micro; g/ml</td><td>Gibco</td><td>33016015</td><td></td></tr><tr><td>Medio de crecimiento endotelial-2 (EGM-2)</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>Medio basal endotelial-2 (EBM-2) suplementado con EGM-2</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA SingleQuots, 0.05%</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company </td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oven</td><td>Binder</td><td>9010-0190</td><td></td></tr><tr><td>Barnizador giratorio: Spin 150</td><td>Polos</td><td>SPIN150-NPP</td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz UV, 365 nm durante 5 s a 350 mW/cm2</td><td>Fabricado internamente</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga: Centrífuga Allegra X-12R Beckman</td><td>Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Binder</td><td>CB E2 150</td><td></td></tr><tr><td>Boxense</td><td>LocSense</td><td></td><td>Amplificador de bloqueo con circuito de cable de sonda, especializado para mediciones TEER en chip</td></tr></tbody></table>

fabricación y validación de un sistema de órganos-en-viruta con electrodos integrados directamente cuantificar transendothelial resistencia eléctrica

Fabrication and Validation of an Organ-on-chip System with Integrated Electrodes to Directly Quantify Transendothelial Electrical Resistance

Órganos en chips, en vitro modelos que involucran el cultivo de tejidos (humanos) dentro de dispositivos microfluídicos son rápidamente emergentes y la promesa de proporcionar útiles de investigación herramientas para el estudio de la enfermedad y la salud humana. Para caracterizar la función de barrera de capas cultivadas dentro de dispositivos de órgano-on-chip, se mide a menudo transendothelial o transepitelial resistencia eléctrica (TEER). Con este fin, electrodos generalmente están integrados en el chip por métodos de micromecanizado para proporcionar mediciones más estables que se consigue con la inserción manual de los electrodos en las entradas de la viruta. Sin embargo, estos electrodos con frecuencia dificultan la inspección visual de la capa de células estudiadas o requieren cleanroom costosos procesos para la fabricación. Para superar estas limitaciones, el dispositivo descrito aquí contiene cuatro electrodos fácilmente integrados que se colocan y se fija fuera del área de cultura, haciendo posible la inspección visual. Usando estos cuatro electrodos que puede cuantificar la resistencia de seis rutas de medición, de la cual el TEER puede ser directamente aislado, independiente de la resistencia de microcanales llenos de medio de cultivo. La barrera blood - brain fue replicada en este dispositivo y su TEER fue supervisado para demostrar la aplicabilidad del dispositivo. Este chip, los electrodos integrados y el método de determinación de TEER son generalmente aplicables en órganos en fichas, para imitar a otros órganos o a ser incorporados en los sistemas de órgano en el chip.

Los mismo resultados de la espectroscopia de impedancia eléctrica a través de un chip sin células (línea sólida) y a través de una barrera celular (línea discontinua) se muestran en la figura 2A. Pueden identificarse cuatro grandes regiones, cada uno dominado por un componente eléctrico específico. Por debajo de aproximadamente 1 kHz, la capacitancia de doble capa en la interfase medio electrodo-cultura domina, caracterizado por una pendiente negativa de la magnitud de la impedancia y un desplazamiento de fase a-90 °. La frecuencia en que domina la capacitancia de doble capa, depende del área de electrodo expuesto al medio de cultivo. La meseta resistente por encima de 1 kHz (sin células) o 100 kHz (con células) con un desplazamiento de fase cerca de 0 °, corresponde a la resistencia de medio de cultivo dentro de los canales de microfluidos, dependiendo de la longitud de canal y área de sección transversal y dentro del membrana, dependiendo de la porosidad y el espesor. Cuando se mide a través de una barrera celular, una meseta extra resistente entre 1 y 10 kHz es vista así como un máximo local en el diagrama de fases. Esta región es de importancia crítica para la determinación de la TEER como un claro aumento en los resultados de impedancia cuando las células están presentes en la ruta medida y por lo tanto se llaman la "región de interés". La extra cuesta entre 10 y 100 kHz corresponde a la capacidad de barrera celular, que surge a partir de las membranas de bicapa lipídica eléctricamente aislante y depende de la superficie total de la capa de células. 27 los límites de estas regiones, así como la magnitud de la impedancia dependen del sistema en estudio y cambian, entre otras cosas, dimensiones del canal, conductividad del medio de cultivo, colocación de los electrodos y tipo de la célula. Para más información acerca de la teoría y práctica de espectroscopia de impedancia eléctrica en la formación de barrera de los tejidos se recomienda el artículo de revisión de Benson et al . 28
Datos representativos de las mediciones de TEER se muestran un chip en blanco y un chip con una capa de células endoteliales de cerebro de hCMEC/D3 en Figura 2E y 2F, respectivamente. En Resumen, espectroscopía de impedancia se realizó mediante seis mediciones con cuatro electrodos: dos medidas a través de canales llenos de medio de cultivo de células (líneas sólidas) y cuatro a través de los canales de la membrana y - si está presente - la barrera celular (líneas discontinuas). Estas rutas de seis medición pueden identificarse en el circuito equivalente resistencia de la figura 2B, que se deriva de la sección transversal esquemática (figura 2) y vista superior (Figura 2D). Las mediciones de chip en blanco (Figura 2E) muestran la típica forma de los espectros de impedancia sin las células, como se ilustra en la figura 2A. Las mediciones a través de la barrera celular (líneas punteadas en la figura 2F) se asemejan a los espectros de impedancia típica con las células en la figura 2A. Nota que la magnitud de la impedancia y la fase de cambio de aumento a 1 MHz. Esta es la respuesta típica de la configuración de la medición a altas frecuencias y no es de origen experimental.
Para determinar el TEER utilizando los espectros de impedancia experimentales, primero la resistencia de la viruta medido se determina, que es la resistencia total de la capa de la célula, los canales y la membrana. Para ello, fue elegida una frecuencia de lectura adecuado en la región de interés, que es el máximo local en el diagrama de fase con las células y cerca de desplazamiento de fase de 0 ° sin células: 10 kHz. Con las seis resistencias medidas a 10 kHz, medida entre los cuatro electrodos, el TEER se calcula directamente usando la ecuación en la figura 2F.
Para mostrar que el dispositivo presentado es adecuado para la determinación de TEER en órganos en virutas, el BBB fue replicado dentro de la viruta y su TEER supervisaron durante 3 días de cultivo. En la Figura 3A que se muestra la el promedio TEER ± error estándar de la media (SEM) para cuatro de BBBs en fichas, resultando en una meseta de 22 ± 1,3 Ω cm2, que es comparable a TEER de esta línea celular según lo divulgado en la literatura. 29 además, después de la terminación del experimento y tinción de fluorescencia de los núcleos, se puede ver que el endotelio cerebral forma una monocapa continua dentro del aparato (figura 3B). Tinción de inmunofluorescencia de la proteína de Unión estrecha Zonula Occludens-1 (ZO-1) demostró que las células endoteliales del cerebro mantienen su fenotipo específico de BBB y forman complejos junctional apretados.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig1.jpg"> 
Figura 1: Diseño y montaje del órgano-on-chip dispositivo con electrodos integrados. 
(A) despiece del chip de microfluidos, consistente en una parte superior de PDMS con el canal superior (TC), una membrana (M) y una parte inferior parte PDMS con el canal inferior (AC). Cuatro electrodos de alambre de platino (E1-4) se inserta y fija en los canales laterales. En el canal superior y encima de la membrana, las células endoteliales de cerebro de hCMEC/D3 fueron cultivadas para replicar el BBB. (B) montar chip, fijada a un plato de plástico. Reimpreso y adaptado con permiso de Elsevier. 16 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig1large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig2.jpg"> 
Figura 2: Datos de representante de la impedancia y la determinación de TEER. 
(A) magnitud del impedancia impedancia esquemática para mostrar espectro (Ω) y desplazamiento de fase (°) versus frecuencia (Hz), típico de espectroscopia de impedancia eléctrica en chips sin células (línea sólida) y con las células (línea discontinua). Hay cuatro grandes regiones, cada una dominada por: la capacitancia de doble capa en los electrodos, la resistencia de medio de cultivo, la resistencia de la barrera de la célula y la capacitancia de la membrana de la célula. La "región de interés" indica que la contribución de la capa de células puede ser cuantificada (flecha roja). (B) circuito equivalente resistencia de la viruta, que muestra el canal superior resistencias R1 y R3, la parte inferior canal resistencias R2 y R4 y la membrana y CE barrera resistor Rm (C) corte transversal esquemático mostrando las células endoteliales (CE) en el canal superior. (D) vista superior esquemática de la BBB chip mostrando la configuración de los electrodos y el área de cultura de 0.25 mm2 a través del cual se mide la impedancia. (E) espectros de impedancia representativas de un chip en blanco llenan de medio de cultivo celular. (F) espectros de impedancia representativas de un chip que hCMEC/D3 las células endoteliales del cerebro eran cultura durante 3 días. (G) fórmula para calcular TEER de las resistencias medidas entre todos seis combinaciones de cuatro electrodos. Reimpreso y adaptado con permiso de Elsevier. 16 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig2large.jpg" target="_blank">por favor haga clic aquí para ver un vers mayor</a>ion de esta figura.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56334/56334fig3.jpg"> 
Figura 3: Desarrollo de TEER representante de BBB-on-chip. 
(A) TEER promedio ± error estándar de la media (SEM) de cuatro BBBs-on-chips durante un período de cultivo de tres días, alcanzando una meseta en 22 ± 1.3 Ω cm2 (media ± SEM). Para la comparación, se incluyen, con marginal variación y desviación de 0 Ω cm2 en el mismo periodo en comparación con la variación y el valor TEER de chips con células datos de fichas en blanco. (B) la microscopia de la fluorescencia de núcleos teñidos reveló un continuo monocapa de endotelio, tanto en PDMS y la membrana en el lugar indicado en el recuadro. (C) la inmunofluorescencia reveló la presencia de la proteína de Unión estrecha Zonula Occludens-1, indicando que ensambladuras apretadas BBB-específicas entre las células dan lugar a la medida TEER. Reimpreso y adaptado con permiso de Elsevier. 16 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56334/56334fig3large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Esta publicación describe la fabricación de un dispositivo de órgano-en-viruta con electrodos integrados para la cuantificación directa de la resistencia eléctrica transendothelial (TEER). Para la validación, la barrera blood - brain fue imitada dentro de este dispositivo de microfluidos y supervisaron su función de barrera. Los métodos presentados para electrodo integración y cuantificación de TEER directa son generalmente aplicables.

Fabricación y validación de un sistema de órganos-en-viruta con electrodos integrados directamente cuantificar Transendothelial resistencia eléctrica

Organs-on-chips, in vitro models involving the culture of (human) tissues inside microfluidic devices, are rapidly emerging and promise to provide useful ...

El objetivo general de este video es mostrar cómo fabricar y usar chips microfluídicos con electrodos integrados para mediciones de resistencia eléctrica transendotelial o transepitelial, o mediciones TEER. Esto se demuestra utilizando una barrera hematoencefálica en el chip microfluídico. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los órganos en chips al permitir la medición directa de la función de barrera de, por ejemplo, el tejido de barrera hematoencefálica utilizando electrodos integrados.La principal ventaja de nuestra técnica es que los electrodos se integran fácilmente en los sistemas Organ-on-Chip y que los resultados de esto se pueden comparar entre los diferentes sistemas. Las implicaciones de esta tecnología se extienden hacia la comprensión de la función de la barrera hematoencefálica en la salud y la enfermedad, el descubrimiento de fármacos y la medicina personalizada. Aunque este método se puede utilizar para proporcionar información sobre la función de la barrera hematoencefálica, también se puede utilizar en el contexto de otros sistemas Organ-on-Chip como el Lung-on-Chip y el Gut-on-Chip.Para comenzar este procedimiento, mezcle bien 27 gramos de agente base PDMS y 2,7 gramos de agente de curado. A continuación, desgasifique la mezcla en un desecador durante aproximadamente 45 minutos para eliminar las burbujas de aire. Mientras tanto, prepare el molde para la mezcla líquida de PDMS pegando cinta transparente alrededor del molde o coloque el molde en un soporte de obleas adecuado.Vierta la mezcla de PDMS desgasificada en el molde. A continuación, cure la mezcla de PDMS en un horno a 60 grados centígrados durante cuatro horas y deje que se enfríe después. En una campana de flujo cruzado, extraiga el PDMS curado del molde.Corte la réplica del PDMS en partes de viruta superior e inferior separadas utilizando líneas de corte en el PDMS. A continuación, perfore cuatro agujeros en las partes superiores con un punzón de biopsia afilado de un milímetro de diámetro para formar entradas y salidas. Perfore de adentro hacia afuera para evitar que se acumulen residuos de PDMS en el chip.A continuación, cubra las piezas de la viruta con cinta adhesiva transparente para protegerlas contra el polvo. Posteriormente, corte las membranas de policarbonato de los insertos transwell en cuadrados de aproximadamente tres por tres milímetros cuadrados. Después de eso, ensamble una membrana porosa sin fugas entre dos partes de PDMS para ensamblar un dispositivo de dos capas interconectado con una membrana porosa.Para ello, prepare un mortero de tolueno PDMS utilizando 0,7 gramos de agente base PDMS, 07 gramos de agente de curado y 540 microlitros de tolueno. Agite el mortero a fondo, luego centrifuga 200 microlitros de mortero sobre un cubreobjetos de vidrio a 1500 rpm durante 60 segundos para adquirir una capa delgada y uniforme de mortero. A continuación, transfiera una fina capa de mortero desde el cubreobjetos a la parte inferior de la viruta con un rodillo de tinta.Coloque la parte inferior en una fuente apta para horno y luego transfiera el mortero a la parte superior de la viruta. Con un juego de pinzas, sumerja los bordes de una membrana en el mortero espinado y colóquelo con cuidado en el centro de la parte inferior. Después de eso, coloque con cuidado la parte superior en la parte inferior mientras presta atención a la alineación.Cubra las entradas de las virutas con cinta adhesiva transparente para evitar que el polvo entre en las virutas y hornéelas a 60 grados centígrados durante tres horas. Tener cuidado es muy importante en este paso. No ejerza presión sobre la viruta y no deslice la parte superior sobre la parte inferior, para evitar que el mortero ingrese a los canales y obstruya la membrana.Para integrar los electrodos en los canales laterales, corte un alambre de platino en trozos de dos centímetros de largo. A continuación, sumérgelos en acetona durante 30 minutos. Luego enjuáguelos con agua y etanol y déjelos secar.En una campana de flujo cruzado, coloque una viruta en un plato de plástico. Inserte cuatro alambres de platino en los canales de electrodos del chip con un par de pinzas y dóblelos hacia abajo sobre el plato de plástico para permitir la fijación al plato en el siguiente paso. Inserte los cables de 0,7 a un milímetro en el canal de cultivo más allá de la unión del canal en forma de T.A continuación, aplique una gota de pegamento curable por UV en la entrada del canal del electrodo y deje que el pegamento llene el canal por fuerzas capilares. A continuación, encienda los rayos UV y cure el pegamento cuando llegue al final del canal del electrodo. Fijación de los cuatro electrodos integrados a la placa de plástico con un adhesivo epoxi de dos componentes.Después de esto, cubra las papas fritas con cinta adhesiva transparente y hornee a 60 grados centígrados durante dos horas. Deje que se enfríen y guárdelos sin polvo hasta su uso. Para recubrir los chips y promover la adhesión de las células, primero llene ambos canales con PBS antes de introducir los reactivos.Revise bajo un microscopio si hay burbujas de aire en los canales. Si es así, elimínelos enjuagándolos con PBS adicional. A continuación, llene ambos canales con 30 microlitros de 20 microgramos por mililitro de fibronectina humana en PBS.Incubarlos a 37 grados centígrados durante tres horas. A continuación, enjuague las virutas con medio de crecimiento endotelial e incubelas a 37 grados centígrados durante dos horas. Después, mida el TEER de las virutas en blanco para asegurarse de que todos los electrodos estén en contacto directo con el fluido de los canales.Para ello, tome un chip de la incubadora y deje que alcance la temperatura ambiente durante al menos diez minutos. Retire cualquier líquido de la placa de plástico alrededor de los electrodos para evitar la formación de puentes eléctricos fuera del chip. A continuación, tome el espectro de impedancia de 200 hercios a un megahercio por cada combinación de dos electrodos, lo que da como resultado seis espectros de impedancia por chip en cinco a diez minutos, a partir de los cuales se puede determinar directamente el TEER.Compruebe si los espectros de impedancia tienen las magnitudes y formas esperadas para validar la medición de TEER. Ahora, prepare una suspensión celular para que se asiente en el canal superior retirando el medio de cultivo de un matraz de cultivo con monocapa confluente de células hcMEC/D3. Después de eso, lave las células con PBS.Retire el PBS y luego agregue dos mililitros de EDTA de tripsina al 05 por ciento e incube a 37 grados centígrados durante dos a cinco minutos hasta que las células se hayan desprendido del matraz de cultivo. A continuación, desactive la tripsina con un medio de cultivo suplementado con un 20 por ciento de FBS. Cuente las celdas y calcule su número total en suspensión.Mientras tanto, centrifuga las células hcMEC/D3 a 390 veces g durante cinco minutos. Luego, retire el sobrenadante y vuelva a suspender la pelletización de células en el volumen adecuado del medio de crecimiento endotelial para dar como resultado una concentración de cinco millones de células por mililitro correspondiente a una densidad de siembra de 200 mil células por centímetro cuadrado en el chip. A continuación, pipetee lentamente 30 microlitros de la suspensión celular bien mezclada en el canal superior y retire la pipeta de la entrada con un movimiento fluido sin dejar de ejercer presión.Verifique la densidad de siembra bajo un microscopio. Se debe lograr una distribución uniforme de las células en todo el canal superior. A continuación, incube los chips a 37 grados centígrados y al cinco por ciento de dióxido de carbono durante al menos una hora.Después, enjuague las células no adheridas con un medio de cultivo endotelial. Tenga en cuenta que TEER se monitorea durante el período de cultivo. Este es el espectro de impedancia esquemático típico que muestra la magnitud de la impedancia y el desplazamiento de fase frente a la frecuencia para la espectroscopia de impedancia eléctrica en chips sin celdas y con celdas.Hay cuatro regiones principales que están dominadas por la capacitancia de doble capa en los electrodos, la resistencia del medio de cultivo, la resistencia de la barrera celular o la capacitancia de la membrana celular. La región de interés indica dónde se puede cuantificar la contribución de la capa celular. Y esta es la fórmula para calcular TEER a partir de las resistencias medidas entre las seis combinaciones de cuatro electrodos.Aquí se muestra el TEER promedio de cuatro BBB en chips durante el período de cultivo de tres días, alcanzando una meseta de 22 más o menos 1,3 ohmios centímetro cuadrado. Para la comparación, se incluyen datos de chips en blanco, que muestran la variación marginal y la desviación de cero ohmios centímetros cuadrados en el mismo período en comparación con la variación en el valor de TEER de los chips con celdas. La microcopia de fluorescencia de los núcleos teñidos reveló una monocapa continua de endotelio tanto en el PDMS como en la membrana en la ubicación indicada en el recuadro.La inmunofluorescencia reveló la presencia de la proteína de unión estrecha zonula occludens, lo que indica que las uniones estrechas específicas de BBB entre las células dan lugar al TEER medido. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de la fabricación y el uso de chips con electrodos integrados para mediciones de TEER en Organs-on-Chips. Esta técnica se puede utilizar en el campo de la investigación de la barrera hematoencefálica para estudiar la administración directa y las características de la enfermedad en, por ejemplo, la enfermedad de Alzheimer.Siguiendo este procedimiento, la función de barrera del endotelio cerebral diferenciada de las células madre pluripotentes inducidas de origen humano también se puede monitorear para aplicaciones en medicina personalizada.

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La barrera hematoencefálica (BBB) es una unidad neurovascular multicelular que regula estrechamente la homeostasis cerebral. Mediante la combinación de iPSC shumanos y tecnologías de órgano en chip, hemos generado un chip BBB personalizado, adecuado para el modelado de enfermedades y predicciones de penetrabilidad de fármacos del SNC. Se describe un protocolo detallado para la generación y el funcionamiento del chip BBB.

Generación de un chip de barrera hematoencefálica basada en iPSC humana

Este protocolo describe las técnicas de microfabricación necesarias para construir un dispositivo de electroporación microfluídica de laboratorio en un chip. La configuración experimental realiza transfecciones controladas a nivel de una sola célula en un flujo continuo y se puede extender a rendimientos más altos con control basado en la población. Se proporciona un análisis que muestra la capacidad de monitorear eléctricamente el grado de permeabilización de la membrana celular en tiempo real.

La fabricación y operación de un sistema de microelectroporación de flujo continuo con detección de permeabilización

Los organoides intestinales derivados de biopsias y las tecnologías de organ-on-a-chips se combinan en una plataforma microfisiológica para recapitular la funcionalidad intestinal específica de la región.

Combinación de organoides humanos y tecnología organ-on-a-chip para modelar la funcionalidad específica de la región intestinal

La integración de organoides intestinales caninos y un sistema microfluídico Gut-on-a-Chip ofrece modelos traslacionales relevantes para las enfermedades intestinales humanas. Los protocolos presentados permiten la morfogénesis en 3D y el modelado dinámico in vitro del intestino, lo que ayuda en el desarrollo de tratamientos efectivos para enfermedades intestinales en perros y humanos con One Health.

Morfogénesis tridimensional en el intestino canino en un chip utilizando organoides intestinales derivados de pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal

Este estudio describe un protocolo para generar monocapas 2D de organoides porcinos derivados del intestino delgado y grueso. El crecimiento de estas monocapas se caracteriza por el aumento de los valores de TEER, lo que indica una sólida integridad epitelial. Además, estas monocapas exhiben respuestas secretoras fisiológicas en experimentos en cámara de Ussing después de la aplicación de forskolina.

Organoides intestinales porcinos bidimensionales que reflejan las propiedades fisiológicas del intestino nativo

Aquí, presentamos un protocolo para fabricar un dispositivo microfluídico único de dos capas para estudiar la regulación electromecánica de la homeostasis del tejido epitelial. El dispositivo aplica corrientes eléctricas fisiológicas estáticas perpendiculares al plano tisular, lo que afecta la adhesión, proliferación y extrusión célula-célula. Las imágenes de células vivas y las mediciones de estrés mecánico revelan mecanismos de estos procesos.

Revelando el control electromecánico de la homeostasis tisular mediante un dispositivo microfluídico de dos capas

Aprende a fabricar un sistema de órganos-en-viruta con electrodos integrados para medir directamente la resistencia eléctrica transendotelial en modelos de barrera hematoencefálica.

Fabricación y validación de un sistema de órganos-en-viruta con electrodos integrados directamente cuantificar Transendothelial resistencia eléctrica (Video) | JoVE Journal

Fabricación y validación de un sistema de órganos-en-viruta con electrodos integrados directamente cuantificar Transendothelial resistencia eléctrica

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