Protocolo de un solo paso para la evaluación del modo de muerte celular inducida por radiación de la Clonogenic por microscopía de fluorescencia
23 de octubre de 2017
Investigación sobre radiación ionizante (IR)-muerte de las células clonogenic inducido es importante para comprender los efectos de IR en tumores malignos y los tejidos normales. Aquí, describimos un análisis de un solo paso para la evaluación de los modos principales de la muerte celular inducida por IR clonogenic basado en morfología de 4', diclorhidrato 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)-tinción de núcleos visualizados por microscopía de fluorescencia.
El objetivo general de este ensayo es evaluar los principales modos de muerte celular clonogénica inducida por radiación ionizante en función de las morfologías características de los núcleos teñidos con DAPI. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología de la radiación. La principal ventaja de esta técnica rápida y rentable es que se pueden evaluar simultáneamente los principales modos de muerte celular clonógena inducida por la radiación ionizante.
Por lo general, las personas nuevas en la biología de la radiación tendrán dificultades para evaluar la muerte celular clonógena inducida por radiación porque se requieren diferentes ensayos para evaluar cada modo de muerte celular. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando realizamos un cribado a gran escala de la muerte celular clonogénica inducida por la radiación utilizando múltiples líneas celulares y dosis de radiación. Aunque este método puede proporcionar información sobre la biología de la radiación, también se puede aplicar a otros sistemas, como la quimioterapia para el cáncer.
Demostrando el procedimiento estará nuestro colaborador, Atsushi Shibata. Comience esterilizando un bisturí con toallas de papel humedecidas con etanol al 70%. A continuación, utilice el bisturí para colocar un cubreobjetos en una placa de cultivo celular de 35 milímetros.
A la placa de cultivo con el cubreobjetos, agregue un mililitro de medio de cultivo. Ahora sujete suavemente el centro del cubreobjetos con pinzas estériles y aspire completamente el medio de cultivo de la placa. A continuación, prepare una suspensión celular de tres mililitros en medio de cultivo en un tubo de 15 mililitros.
Agregue la suspensión celular a la placa de cultivo. E incubarlo durante la noche a 37 grados centígrados y 5% de CO2. Asegúrese de que las células estén adheridas al cubreobjetos y estén vivas examinándolas con un microscopio de contraste de fase invertida.
Ahora irradie el plato con radiación de rayos X de seis grises. Después de la irradiación, incubar las células en una incubadora durante 72 horas a 37 grados centígrados y 5% de CO2. Ahora tome las células de la incubadora y aspire el medio de cultivo de la placa de cultivo.
Corta la punta de una micropipeta de 1.000 microlitros a unos cinco milímetros del extremo con unas tijeras. Y úselo para agregar un mililitro de solución de fijación a la placa de cultivo. Aplique la solución de fijación a lo largo de las paredes de la placa de cultivo para minimizar el daño a las células.
A continuación, transfiera esta placa de cultivo a una placa de cultivo cuadrada y agítela suavemente para distribuir uniformemente la solución de fijación sobre el cubreobjetos. Después de eso, incuba el plato durante 10 minutos a temperatura ambiente. Aspire la solución de fijación del plato.
Ahora agregue dos mililitros de PBS a lo largo de las paredes del plato. Y luego aspirar el PBS. Para prepararse para la tinción con DAPI, agregue cinco microlitros de reactivo de tinción para DAPI en un portaobjetos de vidrio.
A continuación, retire la tapa del plato con un bisturí. Y escurra el exceso de PBS en el cubreobjetos tocando el borde del cubreobjetos con una toalla de papel. Ahora monte el cubreobjetos boca abajo sobre la gota de reactivo de tinción DAPI en el portaobjetos de vidrio para que las células queden expuestas al reactivo de tinción DAPI.
Finalmente, examine las células teñidas bajo un microscopio de fluorescencia equipado con un filtro DAPI. Se muestran las morfologías nucleares en cada uno de los tres modos de muerte celular. Se observa que las células apoptóticas tienen núcleos condensados.
Se observan múltiples lóbulos en los núcleos de las células que sufren una catástrofe mitótica. Se observa que las células que experimentan senescencia muestran focos característicos de heterocromatina asociados a la senescencia. Se muestra una observación comparativa de núcleos irradiados simulados y núcleos irradiados con rayos X de seis grises.
Los círculos indican núcleos en apoptosis, y las flechas indican núcleos en proceso de catástrofe mitótica. Se muestra la evaluación de unos 300 núcleos sometidos a irradiación en comparación con el simulacro. Se ha observado que la irradiación de rayos X de seis grises causa una catástrofe mitótica con mayor frecuencia en aproximadamente el 25%, seguida de la apoptosis en aproximadamente el 5% y eventos de senescencia muy raros.
Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una hora si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no debe dañar las células aplicando soluciones directamente a los cubreobjetos. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el análisis de citometría de flujo o las proteínas marcadoras de muerte celular, así como la tinción de beta-galactosidasa asociada a la senescencia para evaluar la senescencia para comprender mejor cada modo de muerte celular clonogénica.
Descripción general
Este artículo presenta un ensayo de un solo paso para evaluar los principales modos de muerte celular clonogénica inducida por radiación ionizante (IR). El método utiliza la tinción con DAPI para visualizar las morfologías nucleares, aportando información sobre la biología de la radiación.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología de la radiación
- Mecanismos de muerte celular
- Microscopía de fluorescencia
Antecedentes
- Comprender la muerte celular clonogénica inducida por radiación es fundamental para la investigación del cáncer.
- Por lo general, se requieren diferentes ensayos para evaluar cada modo de muerte celular.
- Este método permite la evaluación simultánea de múltiples modos.
- También puede aplicarse a estudios de quimioterapia.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un ensayo rápido y rentable para evaluar la muerte celular inducida por radiación ionizante.
- Facilitar la comprensión de los efectos de la radiación en tumores malignos y tejidos normales.
- Proporcionar un método accesible para quienes son nuevos en biología de la radiación.
Métodos Utilizados
- Preparación de cultivos celulares e irradiación con rayos X.
- Fijación y tinción con DAPI de núcleos.
- Visualización de células teñidas mediante microscopía de fluorescencia.
- Evaluación de las morfologías nucleares para identificar los modos de muerte celular.
Resultados principales
- Identificación de células apoptóticas con núcleos condensados.
- Observación de catástrofe mitótica mediante núcleos lobulados.
- Caracterización de células senescentes con focos de heterocromatina.
- Análisis cuantitativo que muestra tasas más altas de catástrofe mitótica en comparación con la apoptosis.
Conclusiones
- El ensayo proporciona un enfoque sencillo para estudiar la muerte celular clonogénica.
- Mejora la comprensión de la respuesta celular a la radiación ionizante.
- Las aplicaciones futuras podrían extenderse a otras modalidades terapéuticas como la quimioterapia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La evaluación rápida y simultánea de los modos de muerte celular clonogénica inducida por radiación es fundamental para reducir riesgos en las fases iniciales del descubrimiento oncológico y optimizar estrategias terapéuticas. Este protocolo de microscopía de fluorescencia en un solo paso permite la evaluación cuantitativa de alto rendimiento de la apoptosis, la catástrofe mitótica y la senescencia, lo que fortalece la confianza predictiva en el análisis de dianas y vías. El enfoque simplifica los estudios mecanicistas y orienta las decisiones de selección de carteras en radiobiología y modalidades terapéuticas relacionadas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la visualización directa y la cuantificación de mecanismos distintos de muerte celular tras la irradiación.
- Apoya la reducción de riesgos mecanicistas al distinguir entre apoptosis, catástrofe mitótica y senescencia en un único flujo de trabajo.
- Facilita la prueba rápida de hipótesis sobre la interacción con el blanco y la modulación de vías en modelos de oncología.
- Proporciona datos accionables para priorizar blancos y perfeccionar las hipótesis terapéuticas.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona un ensayo estandarizado y reproducible para evaluar fenotipos de muerte celular en múltiples líneas celulares y condiciones.
- Genera resultados cuantitativos adecuados para el cribado de bibliotecas de compuestos o respuestas a dosis de radiación.
- Reduce la complejidad del ensayo al consolidar múltiples lecturas en un único protocolo basado en imágenes.
- Permite un cribado escalable y rentable para puntos finales funcionales de muerte celular.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Correlaciona los fenotipos de muerte celular in vitro con biomarcadores traslacionales relevantes para la respuesta a la radioterapia.
- Facilita la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir la comparación cruzada de modalidades de tratamiento.
- Informa decisiones de avance ajustadas al riesgo mediante la cuantificación de resultados mecanicistas de muerte celular.
- Proporciona una plataforma para integrar ensayos biomarcadores o funcionales adicionales según sea necesario.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo se sitúa en la intersección entre el descubrimiento temprano, la identificación de compuestos activos y los estudios mecanicistas preclínicos, lo que permite su integración fluida en las líneas de desarrollo e investigación de oncología.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis nulas y la aclaración de vías al medir directamente los modos de muerte celular tras la irradiación.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles para comparar condiciones de tratamiento y optimizar los parámetros del ensayo.
- Análisis: Permite el análisis estadístico de las frecuencias de muerte celular, posibilitando comparaciones sólidas entre diferentes grupos experimentales.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos mecanicistas in vitro con estrategias de biomarcadores preclínicos cuando se alinea con ensayos posteriores.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una plataforma reutilizable y adaptable para diversas líneas celulares, tratamientos y estudios mecanicistas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en el análisis de las vías de muerte celular.
- Valor operativo: Optimiza los flujos de trabajo mediante la estandarización, reproducibilidad y escalabilidad de ensayos.
- Valor estratégico: Permite tomar decisiones informadas de avance o interrupción del desarrollo y una gestión eficiente del portafolio al aclarar los mecanismos de muerte celular.
- Impacto en el portafolio: Apoya la priorización y el avance ajustados al riesgo de activos en oncología basándose en datos mecanicistas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía de fluorescencia e interpretación de la morfología nuclear.
- Necesita acceso a equipos de irradiación e infraestructura de imagen compatible con DAPI.
- Exige estandarización entre equipos para una puntuación consistente de los fenotipos de muerte celular.
- Adaptable a diversas líneas celulares y regímenes de tratamiento mediante la optimización del protocolo.
- Puede requerir ensayos complementarios para una validación mecanicista o de biomarcadores más profunda.
