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Introducción a la espectrometría de masas

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Introduction to Mass Spectrometry

3.10: Ion-Exchange Chromatography

3.15: Cyclic Voltammetry (CV)

111,801 Views

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13:45 min

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April 30, 2023

Overview

Fuente: Laboratorio del Dr. Khuloud Al-Jamal – College de Londres King

Espectrometría de masas es una técnica de química analítica que permite la identificación de compuestos desconocidos dentro de una muestra, la cuantificación de los materiales conocidos, la determinación de la estructura y propiedades químicas de moléculas diferentes.

Un espectrómetro de masas se compone de una fuente de ionización, un analizador y un detector. El proceso consiste en la ionización de compuestos químicos para generar iones. Cuando usando inductivo acoplado a plasma (ICP), las muestras que contienen elementos de interés se introducen en el plasma de argón como gotitas de aerosol. El plasma seca el aerosol, disocia las moléculas y luego remueve un electrón de los componentes para ser detectadas por el espectrómetro de masas. Otros métodos de ionización tal como ionización por electrospray (ESI) y de la matriz asistida de ionización desorción del laser (MALDI) se utilizan para analizar las muestras biológicas. Siguiendo el procedimiento de ionización, los iones se separan en el espectrómetro de masas según su relación masa / carga (m/z), y se mide la abundancia relativa de cada tipo de ion. Por último, el detector consiste comúnmente en un multiplicador de electrón donde la colisión de iones con un ánodo cargado conduce a una cascada de aumento de número de electrones, que puede ser detectado por un circuito eléctrico conectado a un ordenador.

En este video, se describirá el procedimiento de análisis de ICP-MS por la detección de ⁵⁶Fe como ejemplo.

Principles

ICP-MS combina una fuente de alta temperatura ICP (plasma acoplado inductivamente) con un espectrómetro de masas.

Las muestras deben ser en forma iónica antes de entrar en el analizador de masas con el fin de ser detectado. El proceso de digestión de muestras sólidas consiste en la incubación de muestras sólidas en ácido fuerte y oxidante a alta temperatura y durante un período prolongado de tiempo dependiendo de los analitos metálicos. La muestra se presenta como un aerosol en el plasma ICP (temperatura de 6.000 – 10.000 K) para ser convertidos en átomos gaseosos, que se ionizan.

El analizador de masas más utilizado es el filtro de masas cuadrupolo. Actúa como un filtro electrostático que sólo permite que los iones de una solo relación masa a carga (m/z) para alcanzar el detector en un momento dado. Se puede separar hasta 15.000 daltons (Da) por segundo y por lo tanto se considera que tiene propiedades de análisis simultáneo de múltiples elemental. ICP-MS es un método muy sensible que permite la detección de elementos con concentraciones por debajo de partículas por billón (ppb) y a continuación la partícula por trillón (ppt) para ciertos elementos.

Por último, el sistema detector convierte al número de iones pulso del detector en una señal eléctrica. Mediante el uso de estándares de calibración (muestras de concentración conocida de un determinado elemento), es posible evaluar la concentración de una muestra de uno o varios elementos de interés.

Procedure

1. limpieza de tubos de policarbonato

Utilizar tubos de policarbonato resistentes a soluciones ácidas para la digestión de la muestra. Con el fin de eliminar cualquier rastro de contaminante de hierro, se llenan todos los tubos 5 mL de 0.1 M HCl.
Coloque los tubos en un baño de agua durante 1 h a 50 ° C.
Lavar los tubos con 5 mL de agua Milli-Q y secar los tubos en una campana horno o químicos.

2. preparación y digestión de la muestra

Lugar 200 μL de muestra en 1,8 mL de ácido nítrico concentrado (65%).
Coloque los tubos en un baño de agua durante la noche a 50 ° C. Ajuste el protocolo mediante el aumento de la temperatura si es necesario una reducción del tiempo total de digestión.
Dejar que enfríen los tubos a temperatura ambiente.
Diluir las muestras mediante la adición de 8 mL de agua Milli-Q para obtener un fuelle de concentración final de ácido nítrico 20% (v/v).
Centrifugar los tubos a 3.000 x g durante 10 minutos para que sedimenten los restantes residuos macroscópicos.

3. preparación del instrumento

Limpie la antorcha ICP mediante ultrasonidos en ácido nítrico al 5% para los conos de 15 minutos limpiar con ácido nítrico al 5%. Cambiar el tubo peristáltico. Compruebe el nivel de aceite de la bomba.
Encienda el argón y el refrigerador, empezar a plasma. Iniciar el flujo de líquido en plasma y esperar a que instrumento se estabilice, unos 20 minutos.
Optimizar la lente voltajes. Funcionan todos los días verificación de rendimiento mediante la medición de prueba de soluciones que contengan Mg, en y para confirmar la sensibilidad del instrumento ICP-MS. Medir la Ce y el Ba en forma de óxido e iones con carga doble deben permanecer por debajo del 3%. Verificar la masa en 8 y 220 Da para medir la señal de fondo.
El instrumento está listo para su uso.

4. selección del método de usuario y lista de muestra

Seleccione el elemento y los isótopos de interés.
Seleccione el modo de exploración como salto de pico.
Elegir un tiempo de 100 ms (mínimo 50) con 40 barridos (mínimo 15) por la lectura. Seleccione una lectura por repetición y 5 réplicas (mínimo 3). El tiempo de integración total es Sra. 4.000 si la cantidad de muestra es limitada, reducir el tiempo de permanencia, número de barridos y repeticiones manteniendo los valores superiores a los mínimos valores definidos anteriormente.
Utilizar un caudal de amoníaco (NH₃) en 0,7 mL/min para evitar la interferencia de ⁴⁰Ar¹⁶O en la determinación de ⁵⁶Fe.
Preparar curva de calibración para los elementos de elección.
Ejecutar los ejemplos.

Espectrometría de masas es una técnica analítica que permite la identificación y cuantificación de compuestos desconocidos dentro de una muestra y la determinación de su estructura.

En espectrometría de masas, se generan iones de la fase de gas de los átomos o moléculas en una muestra. Los iones entonces se separan en base a su relación masa / carga, simbolizada por m/z.

Esta separación permite la determinación de la información cuantitativa y cualitativa sobre una muestra, como su masa y su estructura.

Este video será introducir los conceptos básicos e instrumentación de espectrometría de masas y demostrar su uso en la cuantificación del elemento.

Un espectrómetro de masas se compone de una fuente de ionización, un analizador de masas y un detector. En la fuente de ionización, los compuestos se ionizan, generalmente a una sola carga positiva.

Los iones pueden generarse utilizando diversas técnicas, como el impacto con un haz de electrones, plasma o láser, cada uno dando por resultado una serie de fragmentaciones que ayuda en la determinación de estructura molecular. Estos métodos se agrupan libremente en ionización “duro” y “suave”.

Técnicas de ionización duro causan fragmentación extensa, dando por resultado más fragmentos de menor masa.

Técnicas de ionización suave provocar fragmentación menos o casi nada, con un rango de masa molecular alta.

Si la fragmentación es demasiada, puede perder información valiosa de la estructura. Si es demasiado poco, moléculas pequeñas no se se ioniza eficientemente. Por lo tanto, la selección de un método de ionización depende del analito de interés y el grado de fragmentación deseado.

Los iones entonces se aceleran en un campo eléctrico al entrar en el analizador de masas, donde se separaron.

El analizador de masas más básico es un sector magnético, que se compone de un imán curvo que produce un campo magnético homogéneo. La fuerza atractiva del imán, además de la fuerza centrífuga de los iones de aceleración hace que viajar en una trayectoria circular a través de la curva.

El radio de la trayectoria circular de los iones depende del voltaje de aceleración, el campo magnético aplicado y la relación masa / carga.

El voltaje y campo magnético pueden entonces seleccionarse solamente permitir que ciertas especies de relación de la masa de la carga a través de la trayectoria curva. Otros iones choquen contra los lados de la vía magnética y se pierden. Mediante la exploración de la fuerza del campo magnético, iones deseados alcanzan el detector en diferentes momentos, tal modo identificar cada especie precisamente.

Otro tipo de analizador de masas es el filtro de masas cuadrupolo. El cuadrupolo consta de dos pares de barras de metal paralelas, con cada par de barras rivales conectados eléctricamente.

Un voltaje de corriente directa se aplica a los pares de la barra, y sus potenciales alternan continuamente por lo que los pares son siempre fuera de fase con la otra.

La viga de ion se dirige entonces a través del centro de las cuatro barras. Los iones viajan en una ruta de sacacorchos-como, debido a la constante atracción y repulsión de las varillas. Dependiendo de la relación masa a carga de iones, la voluntad de ion viajar la ruta completa del cuadrupolo y alcanzar el detector o se estrellará en las varillas.

Ahora que se han descrito los fundamentos del espectrómetro de masas, permite echar un vistazo a su uso en el laboratorio.

El espectrómetro de masas utilizado en este experimento es un plasma acoplado inductivamente, o ICP, ionizador, con un filtro cuadrupolo. El instrumento se utilizará para detectar y cuantificar un componente metálico en una muestra.

Para comenzar el experimento, llene todos los tubos de polipropileno con 5 mL de ácido clorhídrico de 0,1 M con el fin de eliminar cualquier rastro de contaminación de hierro. Colocar los tubos en un baño de agua durante 1 h a 50 ° C.

Después de la incubación, lavar los tubos con 5 mL de agua desionizada y secar los tubos en una campana horno o químicos.

En los tubos limpios, agregue 1.8 mL de ácido nítrico concentrado y 200 μL de la muestra que contiene el isótopo de interés.

Precauciones de seguridad cuando se utiliza ácido concentrado.

Colocar los tubos en un baño de agua durante la noche. La temperatura se puede aumentar para reducir el tiempo de digestión, si es necesario.

Después de que la muestra ha sido digerida, deje que el frío de los tubos a temperatura ambiente.

A continuación, agregue 8 mL de agua desionizada para diluir las muestras y para obtener una concentración de ácido nítrico por debajo del 20%. La dilución final de la muestra es 1/50. La concentración ideal para ICP está en el rango de partes por mil millones. Centrifugar los tubos para los restantes residuos macroscópicos de la pelotilla.

ICP es un método de ionización dura que utiliza junto a unos 10.000 ° C que es eléctricamente conductor para ionizar las moléculas de la muestra de plasma argón.

Comenzar el instrumento creado por inspección de la antorcha ICP para que esté limpio.

Luego, inspeccione los conos sampler y skimmer para asegurarse de que también estén limpios. Estos conos permiten el muestreo de sólo la parte interior de la viga de ion generada por la antorcha ICP y actuar como una barrera para el alto vacío del espectrómetro de masas.

Compruebe la presión de argón y empezar el enfriador. Iniciar el plasma y el flujo de líquido en el sistema. Esperar 20 min para el sistema se caliente completamente.

A continuación, aspirar una solución de estándar de la prueba, que contiene diversas normas elementales conocidas. La solución de ensayo debe seleccionarse para cubrir el rango esperado de la masa de la solución del analito.

Cuando se establece el flujo de la solución, inicializar y probar el instrumento según las instrucciones del fabricante.

Para ejecutar el instrumento, primero seleccione los elementos e isótopos de interés. Luego ajuste el modo de exploración al pico de la lupulización.

Seleccione cinco repeticiones por medición. Set de cada repetición para contener 40 medida barridos, cada barrido con un tiempo de permanencia de 50 Sra. el tiempo de integración total es de 2.000 MS. por repetición.

Preparar una curva de calibración para los elementos de elección midiendo soluciones estándar preparadas.

Finalmente, ejecutar el ejemplo, en este caso, las nanopartículas de óxido de hierro. Determinar la concentración de hierro utilizando la curva de calibración de hierro.

Espectrometría de masas se utiliza en una amplia gama de aplicaciones que utilizan diversas técnicas de análisis de la masa e ionización.

En este ejemplo, un tipo de espectrometría de masas de ionización suave, llamado matriz asistida por láser desorción de ionización tiempo de vuelo o MALDI-TOF, se utilizó para analizar las proteínas de alto peso molecular. Con MALDI, se estabilizan las moléculas con una matriz, para disminuir el fraccionamiento cuando se ionizan las moléculas grandes.

La matriz y la solución de proteína fueron avistados en la placa MALDI limpia y seca. La placa MALDI fue insertada en el instrumento, y la muestra analizada.

El análisis de compuestos volátiles y oxidación sensibles se midió usando espectrometría de ionización del electrón, una técnica de ionización dura.

En primer lugar, se diseñó un sistema con llave de tubo para permitir la completa evacuación del tubo, seguido de la carga de la muestra en refrigeración por nitrógeno líquido.

El tubo de muestra fue conectado con el puerto de entrada, y la muestra cargada en el instrumento. El espectro de masas de la muestra en este caso tris(trifluoromethyl) fosfato, luego se analizó.

Un espectrómetro de masas de haces moleculares juntado con radiación de sincrotrón fue utilizado para explorar la estructura electrónica de moléculas de la fase de gas y de racimos.

Los haces moleculares, integrado con radiación de sincrotrón, proporcionan un método de ionización selectiva para sonda moléculas en la fase gaseosa.

La muestra se carga en la boquilla, la boquilla vuelve a cargar en el instrumento, y el haz de fotones permite para entrar en la cámara.

El espectro de masas fue recogido y Comparado con datos de eficiencia de fotoionización con el fin de determinar la estructura electrónica de moléculas.

Sólo ha visto introducción de Zeus a espectrometría de masas. Ahora debería entender la instrumentación básica de espectrometría de masas y cómo realizar un análisis basado en la espectrometría de masa básico.

¡Gracias por ver!

Results

A continuación se muestra el análisis de ICP-MS de las muestras que contienen nanopartículas de óxido de hierro. Una curva estándar se llevó a cabo utilizando una concentración conocida de ⁵⁶Fe (figura 1). El coeficiente de correlación es cercano a 1 (R² = 0.999989) demostró la buena relación lineal entre las concentraciones de la muestra y la intensidad medida por el detector. Muestras de intereses mostraron valores dentro del intervalo de calibración (figura 2). Las concentraciones calculadas por el software entonces fueron ajustados según la dilución realizada durante el protocolo. El presente Protocolo describe una dilución de 1/50 tras la dilución en ácido (1/10) y en la Mili-Q agua (1/5). Por ejemplo, se midió una concentración de 51.427 μg/L para el número 51 (figura 2). La concentración de la muestra original era 50 x mayor correspondiente a 2,57 mg/L.

Figura 1. Curva de calibración para ⁵⁶medidas Fe. Cuatro puntos estándar (0.01, 0.1, 1 y 10 μg/mL) muestran un coeficiente de correlación (R²) de 0.999989. Esto confirma la buena relación lineal entre la intensidad de la señal detectada y las concentraciones de referencia.

Figura 2. Resultados representativos siguiendo medidas de ICP-MS en muestras de nanopartículas de óxido de hierro. La concentración de cada muestra diluida se calcula automáticamente según la curva de calibración definidas.

Applications and Summary

Los campos ambientales y geológicos representan el primer uso para ICP-MS por ejemplo medir los contaminantes presentes en el agua, en el suelo o en la atmósfera. La presencia de contaminantes en altas concentraciones en agua como Fe, Cu o Al puede controlarse utilizando ICP-MS.

Los campos de la ciencia médica y forense también utilizan detección de ICP-MS. En caso de sospecha de un envenenamiento de metales como arsénico, muestras tales como sangre y orina pueden ser analizadas utilizando ICP-MS. Esta técnica también puede proporcionar información valiosa en caso de patología que implica problemas de hepatológicos resultante en la excreción pobre de ciertos elementos o problemas metabólicos.

ICP-MS permite la cuantificación de metales en cualquier material. En la figura 3, la concentración de Fe se midió en nanopartículas y relacionados con sus propiedades de la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI). ICP-MS proporciona una cuantificación fiable de la Fe de diferentes nanopartículas para discriminar que nanopartículas son los más eficientes para la aplicación de la proyección de imagen.

Otra aplicación es el estudio de la biodistribución de nanopartículas de metales. Figura 4 presenta la biodistribución de órgano de nanopartículas que contienen óxido de hierro en ratones después de la inyección intravenosa. A las 24 h, cada órgano fue recogido y digiere en ácido nítrico concentrado hasta digestión completa del órgano. ⁵⁶concentración de Fe se cuantificó por ICP-MS. resultados Mostrar una concentración más alta de ⁵⁶Fe en hígado y bazo de ratones inyectados con nanopartículas que en órganos de animales ingenuos. Por lo tanto, se concluyó que las nanopartículas se acumulan sobre todo en órganos hígado y bazo.

Figura 3. Resonancia magnética medida (MRI) de la función de nanopartículas de su concentración de Fe. Cinco concentraciones de hierro fueron utilizadas (0.25, 0.5, 0.75, 1 y 1,25 mM) que fue fotografiada por sus propiedades de MRI (tasa de relajación, R₂*).

Figura 4. Biodistribución de nanopartículas de óxido de hierro después de la inyección intravenosa en ratones. Ingenuos demuestran el nivel de órgano básico de hierro en ratones no tratados. Después de la inyección de nanopartículas que contienen óxido de hierro, la cantidad de hierro en ciertos aumentos de órgano que se asocia a la acumulación de las nanopartículas.

Transcript

Mass spectrometry is an analytical technique that enables the identification and quantification of unknown compounds within a sample, and the determination of their structure.

In mass spectrometry, gas phase ions are generated from the atoms or molecules in a sample. The ions are then separated based on their mass-to-charge ratio, symbolized by m/z.

This separation enables the determination of quantitative and qualitative information about a sample, such as their mass and structure.

This video will introduce the basic concepts and instrumentation of mass spectrometry, and demonstrate its use in element quantification.

A mass spectrometer is composed of an ionization source, a mass analyzer, and a detector. At the ionization source, the compounds are ionized, usually to a single positive charge.

Ions can be generated using various techniques, such as impact with an electron beam, plasma, or lasers, each resulting in a range of fragmentations that aid in the determination of molecular structure. These methods are loosely grouped into “hard” and “soft” ionization.

Hard ionization techniques cause extensive fragmentation, resulting in more fragments of lower mass.

Soft ionization techniques result in less, or almost no, fragmentation with a high molecular mass range.

If the fragmentation is too great, valuable structure information can be lost. If it’s too little, small molecules will not be efficiently ionized. Thus, the selection of an ionization method depends on the analyte of interest and the desired degree of fragmentation.

The ions are then accelerated in an electric field as they enter the mass analyzer, where they will be separated.

The most basic mass analyzer is a magnetic sector, which is composed of a curved magnet that produces a homogeneous magnetic field. The attractive force of the magnet, plus the centrifugal force of the accelerating ions causes them to travel in a circular path through the curve.

The radius of the ions circular path depends on the accelerating voltage, the applied magnetic field, and the mass-to-charge ratio.

The voltage and magnetic field can then be selected to only allow certain mass-to-charge ratio species through the curved path. Other ions crash into the sides of the magnetic pathway and are lost. By scanning the magnetic field strength, desired ions reach the detector at different times, thereby identifying each species precisely.

Another type of mass analyzer is the quadrupole mass filter. The quadrupole consists of two pairs of parallel metal rods, with each pair of opposing rods electrically connected.

A direct current voltage is applied to the rod pairs, and their potentials continuously alternated so the pairs are always out of phase with the other.

The ion beam is then directed through the center of the four rods. Ions travel in a corkscrew-like path, due to the constant attraction and repulsion from the rods. Depending on the ions mass-to-charge ratio, the ion will either travel the full path of the quadrupole and reach the detector, or will crash into the rods.

Now that the basics of the mass spectrometer have been described, lets take a look at its use in the laboratory.

The mass spectrometer used in this experiment is an inductively coupled plasma, or ICP, ionizer, with a quadrupole filter. The instrument will be used to detect and quantify a metal component in a sample.

To begin the experiment, fill all polypropylene tubes with 5 mL of 0.1 M hydrochloric acid in order to remove any contaminating trace of iron. Place the tubes in a water bath for 1 h at 50 °C.

After incubation, wash the tubes with 5 mL of deionized water, and dry the tubes in an oven or chemical hood.

In the clean tubes, add 1.8 mL of concentrated nitric acid and 200 μL of sample containing the isotope of interest.

Follow safety precautions when using concentrated acid.

Place the tubes in a water bath overnight. The temperature can be increased to shorten digestion time, if necessary.

After the sample has been digested, let the tubes cool to room temperature.

Next, add 8 mL of deionized water to dilute the samples, and to obtain a nitric acid concentration below 20%. The final dilution of the sample is 1/50. The ideal concentration for ICP is in the parts-per-billion range. Centrifuge the tubes to pellet any remaining macroscopic residues.

ICP is a method of hard ionization that uses coupled argon plasma at about 10,000 °C that is electrically conductive to ionize the sample molecules.

Begin the instrument set up by inspecting the ICP torch to ensure that it is clean.

Then, inspect the sampler and skimmer cones to ensure they are also clean. These cones enable the sampling of only the inner portion of the ion beam generated by the ICP torch and act as a barrier to the high vacuum of the mass spectrometer.

Check the argon pressure and start the chiller. Start the plasma and liquid flow into the system. Wait 20 min for the system to warm up fully.

Next, aspirate a standard test solution, which contains various known elemental standards. The test solution should be selected to cover the expected mass range of the analyte solution.

When the solution flow is established, initialize and test the instrument according to the manufacturer’s guidelines.

To run the instrument, first select the elements and isotopes of interest. Then set the scan mode to peak hopping.

Select five replicates per measurement. Set each replicate to contain 40 measurement sweeps, each sweep with a dwell time of 50 ms. The total integration time is 2,000 ms per replicate.

Prepare a calibration curve for the elements of choice by measuring pre-prepared standard solutions.

Finally, run the sample, in this case, iron-oxide nanoparticles. Determine the concentration of iron using the iron calibration curve.

Mass spectrometry is used in a wide range of applications using various ionization and mass analysis techniques.

In this example, a type of soft ionization mass spectrometry, called matrix assisted laser desorption ionization time-of-flight, or MALDI-TOF, was used to analyze high molecular weight proteins. With MALDI, molecules are stabilized with a matrix, to decrease fractionation when the large molecules are ionized.

The protein solution and matrix were both spotted on the clean MALDI plate, and dried. The MALDI plate was inserted into the instrument, and the sample analyzed.

The analysis of volatile and oxidation sensitive compounds was measured using electron ionization mass spectrometry, a hard ionization technique.

First, a lockable tube system was designed in order to enable full evacuation of the tube, followed by loading of the sample under cooling by liquid nitrogen.

The sample tube was connected to the inlet port, and the sample loaded into the instrument. The mass spectrum of the sample in this case tris(trifluoromethyl) phosphate, was then analyzed.

A molecular beam mass spectrometer coupled with synchrotron radiation was used to explore the electronic structure of gas phase molecules and clusters.

The molecular beam, integrated with synchrotron radiation, provided a selective ionization method to probe molecules in the gas phase.

The sample was loaded into the nozzle, the nozzle reloaded into the instrument, and the photon beam allowed to enter the chamber.

The mass spectrum was then collected and compared to photoionization efficiency data in order to determine the electronic structure of molecules.

You’ve just watched JoVE’s introduction to mass spectrometry. You should now understand the basic instrumentation of mass spectrometry, and how to run a basic mass-spectrometry-based analysis.

Thanks for watching!