Detección de mutaciones raras en CtDNA usando la siguiente secuencia de generación

El objetivo general de esta técnica es detectar mutaciones de baja frecuencia en el tumor circulante o en el ADNct para proporcionar a los médicos clínicos una herramienta poderosa para diagnosticar tumores y monitorear la dinámica tumoral en respuesta a la terapia. El método de prueba del ADNct puede ayudar a responder preguntas clave sobre qué tipos de mutaciones porta un paciente, como la variación de tipo nuclear único, la deleción por inserción, la variación del número de copias y la variación estructural. La principal ventaja de esta técnica es la alta sensibilidad y especificidad que permite la detección precisa de mutaciones de baja frecuencia en el ADNct.

Yuliang Yang, un técnico de mi laboratorio, demostrará los procedimientos. Para comenzar, extraiga 10 mililitros de sangre periférica en un tubo de recolección e invierta suavemente el tubo hacia arriba y hacia abajo de seis a ocho veces para mezclar el contenido. Almacene las muestras de sangre en los tubos de recolección a una temperatura de seis a 37 grados centígrados durante un máximo de 72 horas.

Centrifugar el tubo de recolección a 1.600 veces g a temperatura ambiente durante 10 minutos. A continuación, utilice una pipeta de eliminación para transferir el sobrenadante o el plasma del tubo a cuatro tubos centrífugos limpios de dos mililitros debidamente etiquetados sin alterar el pellet. Utilice una pipeta de eliminación limpia para transferir un mililitro de las células a un tubo de centrífuga de dos mililitros debidamente etiquetado.

Almacene las células a menos 20 grados Celsius o más frías antes del aislamiento genómico o de ADNg. A continuación, centrifuga el plasma a 1.600 veces g a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, transfiera el plasma a tubos de centrífuga limpios debidamente etiquetados como plasma, dejando aproximadamente 0,1 mililitros de volumen residual en el fondo para evitar la contaminación.

La capa leucocitaria debe evitarse del plasma durante el proceso de separación. De lo contrario, los fragmentos grandes de ADN extraídos de las células podrían diluir el ADNct y afectar a la sensibilidad de la prueba. Utilizando un kit disponible en el mercado, aísle el ADNcf de tres mililitros del plasma recolectado siguiendo las instrucciones del fabricante.

Luego, también con un kit, aísle el ADNg de 200 microlitros de glóbulos blancos siguiendo las instrucciones del fabricante. Para fragmentar la muestra de control de ADNg por sonicación, prepare un microgramo de muestra de ADNg en 100 microlitros de tampón Tris-EDTA en un tubo de sonicación limpio. Configure el programa de sonicación en 30 segundos encendido y 30 segundos apagado durante 12 ciclos para un total de 12 minutos.

Después de confirmar que el producto contiene de 200 a 250 fragmentos de pares de bases, transfiera todos los productos de fragmentación a un nuevo tubo de 1,5 mililitros que contenga 150 microlitros de perlas magnéticas e incube la muestra durante cinco minutos para seleccionar los fragmentos correctos. A continuación, coloque el tubo en una rejilla magnética durante 30 segundos y retire el sobrenadante. Luego, mientras mantiene el tubo en la rejilla, agregue 200 microlitros de etanol al 80% recién preparado para lavar las perlas.

Incubar las perlas durante 30 segundos antes de retirar el sobrenadante y repetir el lavado. Mantenga el tubo en la rejilla con la tapa abierta para secar las cuentas al aire. A continuación, eluir los fragmentos de ADN añadiendo 32 microlitros de Tris-HCL de 10 milimolares a las perlas.

Para llevar a cabo la reacción de preparación final siguiendo las instrucciones del fabricante, a un tubo estéril sin nucleasa, agregue siete microlitros de tampón de reacción, tres microlitros de la mezcla de enzimas, 30 nanogramos de cfDNA y agua doblemente destilada para un volumen total de 60 microlitros. En un tubo aparte, agregue los mismos componentes pero con un microgramo de ADNg en lugar de ADNcf. Incubar la mezcla en un termociclador a 20 grados centígrados durante 30 minutos, seguido de 65 grados centígrados durante 30 minutos sin calentar la tapa.

Inmediatamente después de la incubación, agregue 30 microlitros de la mezcla maestra de ligadura, un microlitro del potenciador de ligadura y cuatro microlitros del adaptador de secuenciación único al tubo. Incubar la reacción en el termociclador a 20 grados centígrados durante 15 minutos sin calentar la tapa. Vórtice para volver a suspender las cuentas magnéticas y dejar las cuentas a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos.

A continuación, añada 87 microlitros de las perlas magnéticas resuspendidas a la reacción de ligadura. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo y luego incube la muestra a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de lavar y secar al aire las perlas, eluya el objetivo de ADN de las perlas agregando 20 microlitros de Tris-HCL de 10 milimolares.

Añadir 20 microlitros de fragmentos de ADN ligados adaptadores, cinco microlitros de cebador índice i7, 25 microlitros de mezcla maestra de amplificación de biblioteca y agua doblemente destilada hasta un volumen total de 50 microlitros. La PCR amplifica el adaptador ligado cfDNA o gDNA. A continuación, añada 45 microlitros de perlas magnéticas suspendidas al ADN enriquecido con PCR.

Mezclar la muestra pipeteando hacia arriba y hacia abajo e incubarla durante cinco minutos. Después de eliminar el sobrenadante y lavar las perlas, use 30 microlitros de Tris-HCL de 10 milimolares para eluir los fragmentos de ADN con adaptadores. Para llevar a cabo la captura de ADN dirigido, en un tubo estéril, bloquee la muestra añadiendo 1,5 microgramos de bibliotecas de agrupación, ocho microlitros de cada bloque P5 100P y bloque P7 100P, y cinco microlitros de un microgramo por microlitro de ADN.

Seque el contenido del tubo con un concentrador de vacío ajustado a 60 grados centígrados. Hibride las sondas de captura de ADN con la biblioteca añadiendo 8,5 microlitros de tampón de hibridación 2X, 2,7 microlitros de potenciador de hibridación y 1,8 microlitros de agua doblemente destilada sin nucleasas. Mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo e incubar en el mezclador térmico a 95 grados centígrados durante 10 minutos.

A continuación, añada inmediatamente cuatro microlitros de la sonda personalizada. Incubar las muestras en un mezclador térmico a 65 grados centígrados con la tapa calentada a 75 grados centígrados durante cuatro horas. Incubar el ADN objetivo hibridado con perlas de estreptavidina y luego lavar las perlas para eliminar el ADN no unido.

Use el kit comercial de acuerdo con las instrucciones del fabricante para obtener 20 microlitros finales de perlas resuspendidas con fragmentos de ADN capturados. El paso de lavado del ADN no unido de las perlas de estreptavidina debe ser rápido. De lo contrario, la eficiencia de captura del ADN objetivo podría verse afectada.

Amplifique los fragmentos de ADN capturados mediante PCR utilizando un kit comercial con dos oligonucleótidos de la columna vertebral micromolar de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Por último, añadir 45 microlitros de perlas suspendidas directamente al producto de PCR y enriquecer los fragmentos de ADN diana amplificados unidos a las perlas por elución con 30 microlitros de Tris-HCL de 10 milimolares. Cuantificar los fragmentos y realizar la secuenciación y análisis de datos según el protocolo de texto.

Esta tabla describe cómo ER-seq mejora la profundidad de cobertura en un 23% en comparación con el método tradicional. Esto se debe a su eficiente recuperación de moléculas de ADNcf, lo que mejora en gran medida el análisis de mutaciones raras. También está claro que los adaptadores de secuenciación únicos utilizados en ER-seq permiten una fácil diferenciación de las duplicaciones naturales e inducidas por PCR.

Como se detalla en esta tabla sobre los resultados de las llamadas, el análisis basado en ER-seq fue 100% consistente para la detección de EGFR pL858R y la frecuencia de detección fue un poco más alta en comparación con un análisis tradicional. Es importante destacar que el análisis ER-seq permitió la detección de otras mutaciones de frecuencia relativamente baja, incluida EGFR pT790M, que no fue reconocida por el análisis tradicional debido al alto ruido de fondo. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en 48 horas si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar evitar la pérdida de una cantidad muy baja de ADNcf durante la extracción, la preparación de la biblioteca y el lavado de perlas después de la hibridación. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo se recopiló, preparó y seleccionó el ADNct del paciente en función de la identificación única para la secuenciación. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la biopsia líquida exploraran mejores prácticas en la toma de decisiones clínicas.