Name: Posicionamiento adecuado y la contención de una rata de extremidades para la proyección de imagen enfocada de alta resolución del hueso utilizando la microarquitectura In Vivo Micro-tomografía computada (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 24 s
Description: Aprenda a posicionar y restringir la extremidad posterior de ratas para obtener imágenes de alta resolución de la microarquitectura ósea mediante microtomografía computarizada in vivo. Este protocolo estandarizado permite estudios longitudinales cuantitativos.

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Los autores reconocen investigación fondos de una subvención de descubrimiento de NSERC (#05573) y la Fundación de Canadá para la innovación (#222084) para la financiación del en vivo micro-CT. W.E. es una Cátedra de investigación de Canadá en el desarrollo de músculo y hueso.

Este estudio fue aprobado por el Animal cuidado Comité de Brock de la Universidad y realizado de conformidad con los lineamientos establecidos por el Consejo Canadiense sobre el cuidado Animal 21.
1. anestesia con isoflurano Gas
<ol><li>Pre-llene la cámara de incubación de vidrio acrílico con alta calidad O2 con un caudal continuo de aproximadamente 1-2 L/min de una máquina de anestesia (suplementario Figura 1).</li>
	<li>La rata de transferencia a la cola de la cámara de incubación primero y cerrar la tapa de la cámara de incubación para crear un sello hermético.</li>
	<li>Comience a llenar la cámara de incubación con isoflurano veterinaria-grado 3-4% v/v disuelto en O2 con un caudal continuo de 1-2 L/min (figura 1 complementaria). PRECAUCIÓN: Gases anestésicos de desecho pueden afectar negativamente los controladores. Un sistema de búsqueda (es decir, un filtro de carbón o escape directamente en una campana de humos) debe estar siempre en el lugar.</li>
	<li>Cuando la rata ya no es capaz de pararse, la rata de transferencia a una mascarilla o cono de nariz recibe isoflurano 1-3% disuelto en O2 con un caudal de 1-2 L/min ratas sobre todo respirar por su nariz y por lo tanto, siempre y cuando la nariz está cubierta por la máscara de la cara o la nariz cono, habrá suficiente suministro de anestesia.</li>
	<li>Lubricante oftálmico se aplica a las delicadas membranas de los ojos para protegerlos de cualquier gas isoflurano se escapó. Nota: Asegúrese de que el lubricante oftálmico es sin antibiótico, ya que esto puede afectar los resultados de una intervención.</li>
	<li>Medir palpebral (ojo parpadea en respuesta a la estimulación suave de la abertura palpebral) y pedal, reflejos (retiro de miembros posteriores en respuesta a pellizcos); con el aumento de profundidad de la anestesia, reflejo palpebral que se ausente antes pedal reflejos (suplementaria Figura 2).</li>
	<li>Cuando se alcanza un nivel adecuado de anestesia y la rata ha perdido los reflejos palpebrales y pedal, mantener la rata de 0.5-2% isoflurano disuelto en O2 con un caudal de 1-2 L/min.</li>
	<li>Monitorear el ritmo respiratorio de la rata durante el procedimiento, manteniendo una constante visual de la rata directamente con un sistema de control interno o a través del video live feed (suplementario Figura 3).</li>
</ol>2. colocación y sujeción de las extremidades de la rata
<ol><li>Colocar la rata en la posición supina en la cama del escáner de fibra de carbono (suplementario figura 4).</li>
	<li>Sujetar el pie derecho en un maleable, tubo de la espuma con los dedos del pie que se extiende por el extremo del tubo. Aplique la cera dental para mantener los pies firmemente en la espuma y cinta adhesiva el tubo cerrado. Asegúrese de que el diámetro del tubo que sostiene el pie es suficiente para caber firmemente en el tubo de plástico.</li>
	<li>Deslice el tubo de plástico en el cristal del escáner de rayos x (suplementario Figura 5).</li>
	<li>Extender las extremidades de la rata hasta que quede tenso. No extender demasiado la pierna que causa daño a la rata (suplementario Figura 5) como esto puede inducir movimientos involuntarios en las extremidades debido a la respiración forzada.</li>
	<li>Tire de la pierna izquierda (no escaneadas extremidades) junto con la cola hacia el torso y el análisis del campo de visión de la pierna extendida para que se analicen.</li>
	<li>Asegure la pata izquierda (extremidades no analizado) y la cola en posición con cinta de enmascarar. No use cualquier cosa más o menos pegajosa (por ejemplo, cinta adhesiva o cinta de pintor) ya que estos materiales tampoco dañará la rata cuando están quitados (cinta) o no proporcionan un asimiento bastante fuerte (cinta de pintor) (suplementario Figura 6).</li>
	<li>Fije el cuerpo de la rata en su posición en las caderas, hombros y cabeza con la cinta adhesiva. Fijar la mascarilla o el cono de la nariz a la rata (suplementario Figura 6). Nota: Borra el lado adhesivo de la cinta de enmascarar para eliminar su capacidad de adherirse a la piel de rata. No secar los extremos de la cinta adhesiva que puede fijarse firmemente a la cama de exploración.</li>
	<li>Envuelva la rata en vet-wrap para limitar la pérdida de calor (suplementario Figura 6). Nota: Cuando está bajo anestesia general, las ratas pierden calor rápidamente debido a su gran superficie corporal peso proporción 19,20.</li>
	<li>Monitorear el ritmo respiratorio de la rata durante el procedimiento, manteniendo una constante visual de la rata (ya sea directamente o a través de un video en vivo de la alimentación). Nota: Aquí configurar toma 5 min, adquisición de exploración es dependiente del valor de adquisición y tiempo de recuperación es de 60 minutos.</li>
	<li>Proceder a adquirir las imágenes µCT. Nota: Las especificaciones exactas para la adquisición de exploración son específicas de cada explorador tipo, sistema de software y la pregunta de investigación específica, sin embargo, existen varias publicaciones metodológicas a lo largo de la literatura 1,2 , 9.</li>
</ol>3. recuperación de la anestesia
<ol><li>Una vez finalizado en vivo µCT exploración, detener el flujo de isoflurano a la rata pero mantener un flujo de 1-2 L/min de O2.</li>
	<li>Cuando la rata recupera el control del motor (1-2 min), le quite el respirador y le permiten recuperar individualmente en una jaula que se coloca parcialmente en una plataforma de propósito general de calefacción a baja temperatura. Las ratas se saben que reducir su temperatura corporal en 1 ° C bajo anestesia general19. No descuide la rata hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. Nota: La evidencia anecdótica de nuestro grupo de investigación informa que inmediatamente después de la recuperación de la anestesia isoflurano, las ratas comienzan a comer y por ello es importante tener su alimento y agua a su disposición durante la recuperación. Aunque hemos observado este comportamiento, la anestesia general repetida no causa un aumento significativo en alimentos ingesta o cuerpo peso 1,9.</li>
</ol>

<ol><li>Longo, A. B., Sacco, S. M., Salmon, P. L., Ward, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Longitudinal+use+of+micro-computed+tomography+does+not+alter+microarchitecture+of+the+proximal+tibia+in+sham+or+ovariectomized+sprague-dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Calcif+Tissue+Int%22%5BJournal%5D)">Longitudinal use of micro-computed tomography does not alter microarchitecture of the proximal tibia in sham or ovariectomized sprague-dawley rats.</a> Calcif Tissue Int. 98 (6), 631-641 (2016).</li>
<li>Sacco, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repeated+irradiation+from+micro-computed+tomography+scanning+at+2%2C+4+and+6+months+of+age+does+not+induce+damage+to+tibial+bone+microstructure+in+male+and+female+CD-1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bonekey+Rep%22%5BJournal%5D)">Repeated irradiation from micro-computed tomography scanning at 2, 4 and 6 months of age does not induce damage to tibial bone microstructure in male and female CD-1 mice.</a> Bonekey Rep. 6, 855(2017).</li>
<li>Waarsing, J. H., Day, J. S., Verhaar, J. A., Ederveen, A. G., Weinans, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+loss+dynamics+result+in+trabecular+alignment+in+aging+and+ovariectomized+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Bone loss dynamics result in trabecular alignment in aging and ovariectomized rats.</a> J Orthop Res. 24 (5), 926-935 (2006).</li>
<li>Klinck, R. J., Campbell, G. M., Boyd, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+effects+on+bone+architecture+in+mice+and+rats+resulting+from+in+vivo+micro-computed+tomography+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Eng+Phys%22%5BJournal%5D)">Radiation effects on bone architecture in mice and rats resulting from in vivo micro-computed tomography scanning.</a> Med Eng Phys. 30 (7), 888-895 (2008).</li>
<li>Laperre, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+micro-CT+protocols+for+in+vivo+follow-up+of+mouse+bone+architecture+without+major+radiation+side+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Development of micro-CT protocols for in vivo follow-up of mouse bone architecture without major radiation side effects.</a> Bone. 49 (4), 613-622 (2011).</li>
<li>Brouwers, J. E., van Rietbergen, B., Huiskes, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+effects+of+in+vivo+micro-CT+radiation+on+structural+parameters+and+bone+marrow+cells+in+proximal+tibia+of+wistar+rats+detected+after+eight+weekly+scans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">No effects of in vivo micro-CT radiation on structural parameters and bone marrow cells in proximal tibia of wistar rats detected after eight weekly scans.</a> J Orthop Res. 25 (10), 1325-1332 (2007).</li>
<li>Francisco, J. I., Yu, Y., Oliver, R. A., Walsh, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationship+between+age%2C+skeletal+site%2C+and+time+post-ovariectomy+on+bone+mineral+and+trabecular+microarchitecture+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Relationship between age, skeletal site, and time post-ovariectomy on bone mineral and trabecular microarchitecture in rats.</a> J Orthop Res. 29 (2), 189-196 (2011).</li>
<li>Altman, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+skeletal+growth%2C+modeling%2C+and+remodeling+by+in+vivo+micro+computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Quantification of skeletal growth, modeling, and remodeling by in vivo micro computed tomography.</a> Bone. 81, 370-379 (2015).</li>
<li>Longo, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifelong+intake+of+flaxseed+or+menhaden+oil+to+provide+varying+n-6+to+n-3+PUFA+ratios+modulate+bone+microarchitecture+during+growth%2C+but+not+after+OVX+in+Sprague-Dawley+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Nutr+Food+Res%22%5BJournal%5D)">Lifelong intake of flaxseed or menhaden oil to provide varying n-6 to n-3 PUFA ratios modulate bone microarchitecture during growth, but not after OVX in Sprague-Dawley rats.</a> Mol Nutr Food Res. 61 (8), (2017).</li>
<li>Sacco, S. M., Saint, C., LeBlanc, P. J., Ward, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+consumption+of+hesperidin+and+naringin+flavanones+exerts+transient+effects+to+tibia+bone+structure+in+female+CD-1+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Nutrients%22%5BJournal%5D)">Maternal consumption of hesperidin and naringin flavanones exerts transient effects to tibia bone structure in female CD-1 offspring.</a> Nutrients. 9 (3), 250(2017).</li>
<li>Campbell, G. M., Buie, H. R., Boyd, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signs+of+irreversible+architectural+changes+occur+early+in+the+development+of+experimental+osteoporosis+as+assessed+by+in+vivo+micro-CT%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporos+Int%22%5BJournal%5D)">Signs of irreversible architectural changes occur early in the development of experimental osteoporosis as assessed by in vivo micro-CT.</a> Osteoporos Int. 19 (10), 1409-1419 (2008).</li>
<li>De Schaepdrijver, L., Delille, P., Geys, H., Boehringer-Shahidi, C., Vanhove, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+longitudinal+micro-CT+study+of+bent+long+limb+bones+in+rat+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Reprod+Toxicol%22%5BJournal%5D)">In vivo longitudinal micro-CT study of bent long limb bones in rat offspring.</a> Reprod Toxicol. 46, 91-97 (2014).</li>
<li>Perilli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+early+bone+changes+using+in+vivo+micro-CT+in+ovariectomized%2C+zoledronic+acid-treated%2C+and+sham-operated+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoporos+Int%22%5BJournal%5D)">Detecting early bone changes using in vivo micro-CT in ovariectomized, zoledronic acid-treated, and sham-operated rats.</a> Osteoporos Int. 21 (8), 1371-1382 (2010).</li>
<li>Bouxsein, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+assessment+of+bone+microstructure+in+rodents+using+micro-computed+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bone+Miner+Res%22%5BJournal%5D)">Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography.</a> J Bone Miner Res. 25 (7), 1468-1486 (2010).</li>
<li>Li, H., Zhang, H., Tang, Z., Hu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-computed+tomography+for+small+animal+imaging%3A+Technological+details%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Natural+Science%22%5BJournal%5D)">Micro-computed tomography for small animal imaging: Technological details.</a> Progress in Natural Science. 18 (5), 513-521 (2008).</li>
<li>Campbell, G. M., Sophocleous, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+bone+and+soft+tissue+by+micro-computed+tomography%3A+applications+to+ex+vivo+and+in+vivo+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Bonekey+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of bone and soft tissue by micro-computed tomography: applications to ex vivo and in vivo studies.</a> Bonekey Rep. 3, 564(2014).</li>
<li>Meganck, J. A., Kozloff, K. M., Thornton, M. M., Broski, S. M., Goldstein, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beam+hardening+artifacts+in+micro-computed+tomography+scanning+can+be+reduced+by+X-ray+beam+filtration+and+the+resulting+images+can+be+used+to+accurately+measure+BMD%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Beam hardening artifacts in micro-computed tomography scanning can be reduced by X-ray beam filtration and the resulting images can be used to accurately measure BMD.</a> Bone. 45 (6), 1104-1116 (2009).</li>
<li>Vazquez, C. M., Molina, M. T., Ilundain, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+rat+large+intestine+in+reducing+diarrhea+after+50%25+or+80%25+distal+small+bowel+resection%5BTitle%5D)+AND+%22Dig+Dis+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of rat large intestine in reducing diarrhea after 50% or 80% distal small bowel resection.</a> Dig Dis Sci. 34 (11), 1713-1719 (1989).</li>
<li>Albrecht, M., Henke, J., Tacke, S., Markert, M., Guth, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+isoflurane%2C+ketamine-xylazine+and+a+combination+of+medetomidine%2C+midazolam+and+fentanyl+on+physiological+variables+continuously+measured+by+telemetry+in+Wistar+rats%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Vet+Res%22%5BJournal%5D)">Effects of isoflurane, ketamine-xylazine and a combination of medetomidine, midazolam and fentanyl on physiological variables continuously measured by telemetry in Wistar rats.</a> BMC Vet Res. 10, 198(2014).</li>
<li>Schmitz, S., Tacke, S., Guth, B., Henke, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+physiological+parameters+and+anaesthesia+specific+observations+during+isoflurane%2C+ketamine-xylazine+or+medetomidine-midazolam-fentanyl+anaesthesia+in+male+guinea+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparison of physiological parameters and anaesthesia specific observations during isoflurane, ketamine-xylazine or medetomidine-midazolam-fentanyl anaesthesia in male guinea pigs.</a> PLoS One. 11 (9), e0161258(2016).</li>
<li>Canadian Council on Animal Care. Guide to the care and use of experimental animals. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Experimental_Animals_Vol1.pdf">http://www.ccac.ca/Documents/Standards/Guidelines/Experimental_Animals_Vol1.pdf</a> (1993).</li>
<li>Stevens, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+toxicities+of+halothane%2C+isoflurane%2C+and+diethyl+ether+at+subanesthetic+concentrations+in+laboratory+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Anesthesiology%22%5BJournal%5D)">Comparative toxicities of halothane, isoflurane, and diethyl ether at subanesthetic concentrations in laboratory animals.</a> Anesthesiology. 42 (4), 408-419 (1975).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo proporciona los espectadores con la primera pauta detallada para la anestesia adecuada, colocación y sujeción de la rata durante en vivo µCT la exploración de las extremidades. Estas directrices permiten a los usuarios en vivo µCT análisis de sistemas para obtener alta resolución, imágenes de alta calidad de la tibia que puede ser procesado para la cuantificación de la microarquitectura ósea 3-dimensional. Pasos críticos en el protocolo necesario para asegurar la correcta colocación y sujeción implican la anestesia apropiada de la rata, así como extender las extremidades de todas otras estructuras críticas hasta que quede tenso, pero no en una posición antinatural. Para óptimos resultados de imagen, es imprescindible que la rata de anestesiar a un nivel de completa relajación y desaparecen los reflejos palpebrales y pedal. Además, debería extenderse la pierna exploración y todo pie y el tobillo deben ser refrenados en espuma. Los métodos descritos anteriormente para lograr un posicionamiento óptimo de la etapa de exploración aseguran de que: 1) extremidades traseras de ratas en un estudio siempre se orientan en la misma dirección, permitiendo así el haz de rayos x al pasar a través de la misma zona de cada pierna rota alrededor de la muestra; 2) no se produzca movimiento tanto voluntario e involuntario de las extremidades, minimizando así el potencial para los artefactos de movimiento que interfieren con la calidad de las imágenes adquiridas; 3) se evitan obstrucciones de los objetos (es decir, la cola), minimizando así el potencial para los efectos de volumen parcial producir mediciones inexactas de la DMO y los TTM. Estas pautas pueden ser modificadas para cada rata individual, como la tasa de metabolismo de isoflurano y colocación puede variar dependiendo de la tensión y el cuerpo tamaño 22. La más común en vivo análisis máquinas está diseñadas para modelos animales pequeños (es decir, ratones, ratas, conejos, conejillos de Indias) y tendrá etapas animales intercambiables para permitir la exploración de diferentes tamaños de animales. Por lo tanto, puede acomodar una amplia gama de pesos corporales.
Aunque en vivo µCT análisis permisos para la rata ser colocado de nuevo y vuelve a analizar si las imágenes de la exploración inicial están mala calidad, repetida exploración expondrá la rata a dosis adicionales de radiación y el isoflurane anestesia para un período prolongado de tiempo. Mensual exposición a la radiación repetida de 600 mGy enfocado a la tibia de la rata más de cuatro meses no causa efectos adversos a en comparación con las extremidades contralaterales 1la microarquitectura del hueso, pero esto no comprobar la seguridad de dos exploraciones repetidas en sucesión inmediata. Otras limitaciones de la técnica descrita incluyen la necesidad de extender las extremidades tensas con las fuerzas aplicadas a lo que le sigue, que pueden invocar algunos cambios en la estructura ósea. Mientras que la severidad de la restricción de las extremidades durante la exploración dependerá de cada objetivo de investigación, investigaciones anteriores de nuestro laboratorio que mensuales repetidos en vivo µCT proyección de imagen de una extremidades dio lugar a una diferencia en la cortical parámetro micro-arquitectónicos, excentricidad, en comparación con las extremidades contralaterales que no experimentaron extensión repetida, estabilización y análisis 1. Excentricidad es una medida de la forma elíptica de la cortical ósea y cambios en respuesta a alterado la carga. Por lo tanto, al utilizar este método de posicionamiento y restricción de las extremidades para repetir en vivo µCT proyección de imagen, consideración debe hacerse al evaluar e interpretar cambios en carga parámetros micro-arquitectónicos.
Mientras que los lineamientos anteriores se han proporcionado para la proyección de imagen y análisis de tejido óseo, deben hacerse pequeños ajustes en el protocolo cuando imágenes de tejidos blandos de las extremidades. Específicamente, la forma en que las extremidades es extendido desde el torso y refrenado debe tenerse en cuenta, como el actual procedimiento de misshapes la orientación del tejido blando (músculo, tejido adiposo) en posición anormal para la duración de la exploración. Por lo tanto, al extrapolar este modelo para el uso en proyección de imagen de los tejidos blandos de las extremidades, algunos ajustes deben hacerse a la técnica de moderación para reducir o eliminar los cambios en el posicionamiento de los tejidos en lo referente a uno otro.
Además, las directrices se han escrito específicamente basado en las experiencias de nuestro grupo de investigación, sin embargo, puede ser modificados para dar cabida a otros escáneres disponibles comercialmente en vivo µCT. Otros métodos sugeridos para colocar y sujetar las extremidades pueden estar disponibles por el fabricante de la µCT en vivo sistema de escaneo. Más comercialmente disponibles en vivo µCT las unidades lista de poliestireno expandido, polipropileno, y tubos plásticos con cera dental para mantener una que sobresale del pie como materiales aceptables y métodos para restringir la exploración de la pierna. Sin embargo, el método presentado en el presente Protocolo proporcionará más controlada y constante de posicionamiento y sujeción de la pierna explorada y constantemente produce imágenes de alta calidad. Las pautas presentadas en el presente método requieren equipo especializado necesario para la anestesia de la rata, por ejemplo un vaporizador, tubos, máscaras, cámaras de inducción y el oxígeno. Aunque el equipo está asociado con un costo algo mayor en comparación con los anestésicos inyectables, permite a los investigadores la capacidad de rápidamente y precisamente inducir anestesia a profundidades específicas de la conciencia, que proporciona una ventaja sobre la alternativa métodos.
Utilizando las directrices descritas en el presente método video, investigadores, utilización de tecnologías de alta resolución en vivo µCT para investigar su intervención de interés serán capaz de correctamente y constantemente Oriente y frenar una rata extremidades para alta imágenes de rayos x de calidad. Esto proporcionará un continuo en el campo de la adquisición de imágenes en vivo µCT y servir como un paso hacia la optimización de la consistencia y la precisión en los estudios y permiten comparaciones a través de estudios en la literatura. Del mismo modo, se pueden ampliar estos protocolos y métodos para el uso en otras especies de roedores, como ratones, aunque algunos cambios será obligatorio 2,10. Por ejemplo, la sujeción del pie en el tubo de espuma puede incluir el tobillo para reducir al mínimo la posibilidad de movimiento de las piernas durante la exploración. Además, el pie completo caben en el soporte de espuma. Así, los dedos del pie no se extienden fuera del extremo del porta como lo hacen al fijar el pie de una rata. Además, el cuerpo del ratón no requiere el mismo sistema de seguridad con cinta como la rata. Un cono de nariz más pequeño puede utilizarse para el mantenimiento de anestesia en ratones durante la exploración. Si no hay un cono de nariz más pequeño, uno puede asegurar un guante de nitrilo sobre el cono de nariz disponible y haga una pequeña incisión en el guante para proporcionar un espacio que puede caber la nariz del ratón para proporcionar anestesia manteniendo un sello alrededor de la nariz.
Mientras que la tibia proximal es el principal sitio de investigación de los cambios en la microestructura en la rata del hueso, directrices para la colocación adecuada y consecuente de otros sitios esqueléticos como el fémur y vértebras lumbares deben investigar y establecidas para consistencia en la literatura. Sin embargo, al emprender investigaciones futuras con la proyección de imagen de las vértebras lumbares, consideraciones deben hacerse como proyección de imagen de la columna vertebral proporciona la exposición a la radiación a los órganos circundantes y tejidos.

El uso de en vivo la tomografía micro computada (µCT) es una poderosa herramienta que consiste en la proyección de imagen no destructivo de estructuras internas en alta resolución utilizando modelos de roedores. La naturaleza no destructiva en vivo µCT permite repetir la proyección de imagen del mismo roedor con el tiempo. Esta función no sólo reduce el número total de roedores en un diseño experimental y así reduce la variación entre sujeta que puede surgir, pero también permite a los investigadores a entender las respuestas a largo plazo a una intervención. Con el uso de repetidas en vivo µCT, experimentos en ratones y ratas han aclarado cambios de desarrollo para la micro arquitectura del hueso y hueso densidad mineral (DMO) a lo largo de períodos de vida útil de 1,2,3 ,4,5,6,7,8 , así como la respuesta de salud ósea a intervenciones como la dieta 9,10, ovariectomía 7,11 y agentes farmacológicos 8,12,13. DMO y microarquitectura ósea en los sitios esqueléticos específicos, a saber, la tibia proximal, fémur y vértebras lumbares, son indicativos de salud ósea en general y el riesgo de sufrir una fractura y las medidas primarias al cuantificar las respuestas a un intervención.
Adquisición de imágenes en vivo µCT implica dos dimensiones proyecciones de rayos x está adquiridas en múltiples ángulos, como la fuente de rayos x y el detector giran alrededor del animal bajo investigación 14,15. La calidad de la imagen resultante es dependiente en muchos factores incluyendo pero no limitado a: seleccionar parámetros de adquisición (es decir, resolución espacial, rayos x voltaje, amperaje, paso de rotación, filtro aplicado, tiempo de exposición), limitaciones de la µCT escáner (es decir, artefactos basados en explorador tales como artefactos de anillo o polvo que causan efectos de volumen parcial o manchas) y la colocación apropiada y sujeción del animal. El ex dos de estos factores pueden ser manipulados hasta cierto punto por el usuario, dependiendo de la máquina de exploración específica, objetivos del estudio y las correcciones que se necesitan para optimizan la función del escáner o el procesamiento de imágenes adquiridas. El último de estos factores, el posicionamiento correcto de los roedores antes de la exploración, se logra independientemente de las limitaciones basadas en explorador o los parámetros de adquisición que se seleccionan para lograr un objetivo de estudio específico. Mientras que muchas publicaciones con imágenes en vivo han sido publicados en la literatura 14,15,16,17, estilo clásico manuscrito es tal que detallado "cómo" información no puede ser incluido. Por lo tanto, el objetivo de este artículo y video guía debe llenar este vacío. Aquí nuestro objetivo es instruir a los usuarios de escáneres de µCT en vivo cómo anestesiar una rata y colocar y sujetar las extremidades para producir imágenes de alta calidad que pueden ser analizadas para cuantificar con mayor precisión los resultados de la microarquitectura del hueso.
Evitar obstrucciones de la haz de rayos x a través de objetos que no sean de las extremidades son imprescindibles para cuantificar la DMO más preciso y valores de la microarquitectura del hueso. Como los rayos x pasan a través de objetos y tejidos de diferentes espesores y densidades, algunos de los rayos x son absorbidos (es decir atenuada) por los materiales que pasan a través. Puesto que la densidad de masa medida de una muestra es afectada por su grosor y la presencia y espesor de los tejidos circundantes, es imperativo que los fantasmas de calibración para determinar la DMO se analizan de la misma manera. Por lo tanto, si el haz de rayos x debe pasar a través de objetos (es decir, la cola) antes o después de pasar por la región de interés, esos objetos absorberán algunas de las energías de rayos x y va a interferir con la imagen de transmisión adquirida. Además, estas exploraciones serían muy difíciles de simular al analizar los fantasmas que deben se asemejan muestra exploraciones. Como resultado, estas diferencias de atenuación conducen a la inexactitud en la evaluación de las mediciones de la DMO del hueso. Así, para mayor facilidad y exactitud, es mejor limitar el número de obstrucciones entre la fuente de rayos x, región de interés y rayos x detector de.
Evaluación longitudinal de la estructura ósea de una intervención en modelos preclínicos incluyen la anestesia repetida del animal para limitar sus movimientos durante la exploración de protocolos. Existen varios métodos de anestesia general con el fin de someter a los animales sometidos a una exploración de la µCT, incluyendo anestesia inyectable e inhalantes 1,2,4,5,6, 12. a diferencia de los inhalantes anestésicos como isoflurano, repetida anestesia general con anestésicos inyectables causan una reducción en peso corporal, tolerancia quirúrgica y cambios importantes en otros parámetros fisiológicos en roedores, específicamente las ratas y conejillos de Indias, sugiriendo importantes contraindicaciones para repetir uso 18,19,20. Mientras que el isoflurano es altamente volátil y permite la rápida inducción y recuperación, agentes anestésicos inyectables producen diferentes niveles de anestesia y tiempo bajo anestesia depende de la cepa, sexo, composición corporal, estado ayunado y ciclo circadiano de la animal. Anestésicos inyectables también presentan barreras adicionales para su uso como que muy están reguladas por órganos de gobierno nacionales. Anestesia inhalatoria sin embargo, implica la entrega directa en el sistema respiratorio; Este método permite para una más rápida inducción y recuperación de tiempo y mejor controlan sobre la longitud y la profundidad de anestesia19,20. Limitaciones en el método de anestesia de inhalación implican su requisito para equipos de vaporización especializados y algunos cambios de ritmo cardíaco y la presión arterial durante la inducción, mantenimiento y recuperación 18,19.

<table><tbody><tr><td>Isoflurano</td><td>Fresenius Kabi Vaporizador</td><td>de 108737</td><td></td>para la Salud</tr><tr><td>Animal</td><td>Dispomed</td><td>990-1091-3SINEWA</td><td></td></tr><tr><td>Eliminadores/Filtros de Carbón</td><td>Dispomed</td><td>985-1005-000</td><td></td></tr><tr><td>Micro-CT Scanner</td><td>Bruker microCT</td><td>SkyScan 1176</td><td></td></tr><tr><td>Cera dental</td><td>Kerr Dental Laboratory</td><td>623</td><td></td></tr><tr><td>Foam (Backer Caña)</td><td>Rona</td><td>CF12086</td><td>1" x10'</td></tr><tr><td>Tubo de plástico</td><td>Bruker microCT</td><td>SP-3010</td><td></td></tr><tr><td>Cama de fibra de carbono</td><td>Bruker microCT</td><td>SP-3002</td><td></td></tr><tr><td>Venda Veterinaria</td><td>Dura-Tech</td><td>17473</td><td></td></tr><tr><td>Gel oftálmico</td><td>OptixCare</td><td>006CLC-4256</td> Sin <td>antibióticos</td></tr><tr><td>Almohadilla térmica</td><td>Sunbeam</td><td>000731-500-000</td><td></td></tr></tbody></table>

posicionamiento adecuado y la contención de una rata de extremidades para la proyección de imagen enfocada de alta resolución del hueso utilizando la microarquitectura in vivo micro-tomografía computada

Proper Positioning and Restraint of a Rat Hind Limb for Focused High Resolution Imaging of Bone Micro-architecture Using In Vivo Micro-computed Tomography

El uso de en vivo la tomografía micro computada (µCT) es una poderosa herramienta que consiste en la proyección de imagen no destructivo de estructuras internas en alta resolución en modelos animales vivos. Esto permite la proyección de imagen repetida del mismo roedor con el tiempo. Esta función no sólo reduce el número total de roedores en un diseño experimental y así reduce la variación entre sujeta que puede surgir, pero también permite a los investigadores evaluar respuestas longitudinales o toda la vida a una intervención. Para obtener imágenes de alta calidad que pueden ser procesadas y analizadas para cuantificar con mayor precisión los resultados de la microarquitectura del hueso, los usuarios de escáneres de µCT en vivo deben correctamente anestesiar la rata y posición y sujetar las extremidades. Para ello, es imperativo que la rata de anestesiar a un nivel de completa relajación y desaparecen los reflejos pedal. Estas pautas pueden ser modificadas para cada rata individual, como la tasa de metabolismo de isoflurano puede variar dependiendo del tamaño del cuerpo y tensión. La técnica adecuada para la adquisición de imágenes en vivo µCT permite una medición precisa y consistente de la microarquitectura del hueso dentro y a través de estudios.

Este método de anestesia para la rata y posicionamiento y sujeción de las extremidades para en vivo µCT la proyección de imagen facilita la adquisición de alta calidad imágenes apropiadas para el análisis de la micro arquitectura de la tibia. La colocación apropiada de la extremidades de rata implica la pata está completamente extendida y todo pie y del tobillo de espuma (figura 1A) dando por resultado una imagen adquirida de calidad suficiente para el análisis de la (microarquitectura trabecular y cortical Figura 1B). Insuficiente colocación y sujeción de las extremidades (figura 1) pueden resultar en imágenes con artefactos de movimiento (figura 1), mientras que una cola que no se quita completamente desde el análisis de campo de vista (Figura 1E) interferirá con la radiografía atenuación de las muestras escaneadas (Figura 1F) y alterar las mediciones de densidad mineral (TMD) BMD y el tejido. Cualquiera de estos errores de colocación se traducirá en un scan de mala calidad que no debería analizarse más. Lograr imágenes de mala calidad que alterará la cuantificación de la red trabecular fineza y estructura cortical de las extremidades y producen inadecuado o poco concluyentes datos14.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56346/56346fig1.jpg"> Figura 1. Imágenes representativas de la colocación de las extremidades de rata y correspondientes imágenes adquiridas de la tibia proximal en sección transversal. (A) la colocación correcta de las extremidades de rata con el tobillo totalmente restringido en espuma, piernas extendidas y cola tirada lejos de la tibia ofrece suficiente calidad de imagen en sección transversal (B) de la tibia y trabecular y cortical micro-arquitectura. (C) colocación inadecuada de las extremidades de rata con la pierna no completamente extendido y tobillo no refrenado en espuma puede dar lugar a artefactos de movimiento (D), como rayas de sección. Objetos (E) interferir en el campo de visión, tales como la cola no tirada de la tibia (F) interfiere con la atenuación de la radiografía de la tibia y puede resultar en alteración DMO y TMD mediciones, aunque no es visualmente evidente. La esquina inferior izquierda de panel F muestra una porción de la cola en el campo de visión, que interfiere con el haz de rayos x que posteriormente pasó a través de la tibia. Líneas rojas punteadas en los paneles de la izquierda indican la sección presentada en el panel derecho. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/56346fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Suplementario Figura 1. Isoflurane anestésico unidad. Isoflurane anestésica unidad creada para dar 3-4% de isoflurano disuelto en O2 con un caudal continuo de 1-2 L/min para la inducción de la anestesia general. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_1.jpg">Haga clic aquí para descargar esta figura.</a>
Suplementario Figura 2. Garantizar la profundidad de la anestesia. Reflejos pedal medida por pellizcar los dedos de la rata recibiendo continua inhalación anestésico a través de una mascarilla o un cono de nariz. La respuesta al dolor es más evidente cuando la pierna se extiende ligeramente. Pinches muy fuerte o el uso de fórceps o pinzas puede inducir daño tisular y por lo tanto no debe ser utilizado. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_2.jpg">Haga clic aquí para descargar esta figura.</a>
Suplementario Figura 3. Pantalla de captura de la vista de cámara monitoreo fisiológico alimento vivo. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_3.jpg">Haga clic aquí para descargar esta figura.</a>
Suplementario figura 4. Rata en la posición supina en la cama del escáner de fibra de carbono. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_4.jpg">Haga clic aquí para descargar esta figura.</a>
Suplementario Figura 5. Justo a pie de la rata de un tubo de espuma maleable. Pie derecho de la rata se refrena en un tubo de espuma maleable con los dedos del pie que se extiende del tubo (no mostrado aquí). El tubo de espuma se refrena en un soporte de plástico (véase Tabla de materiales/equipo específico para obtener información más detallada). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_5.jpg">Haga clic aquí para descargar esta figura.</a>
Suplementario Figura 6. Rata asegurada en posición con la pierna derecha extendida hacia. El pie izquierdo y cola es grabado de la pierna derecha (hacia el torso), están aseguradas las caderas y el torso de la rata se envuelve en vet-wrap (azul) para limitar la pérdida de calor. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56346/Suppl_Fig_6.jpg">Haga clic aquí para descargar esta figura.</a>

Este documento indica a los usuarios de escáneres de tomografía micro computada (µCT) en vivo cómo anestesiar, correctamente la posición y sujetar las extremidades de una rata para el mínimo movimiento durante la proyección de imagen de alta resolución de la tibia. El resultado es imágenes de alta calidad que pueden ser procesados para cuantificar con precisión la microarquitectura ósea.

Posicionamiento adecuado y la contención de una rata de extremidades para la proyección de imagen enfocada de alta resolución del hueso utilizando la microarquitectura In Vivo Micro-tomografía computada

The use of in vivo micro-computed tomography (&#181;CT) is a powerful tool which involves the non-destructive imaging of internal structures at high ...

El objetivo general de este procedimiento es posicionar y sujetar correctamente una extremidad trasera de rata para la adquisición de imágenes enfocadas de alta resolución de la microarquitectura ósea de la tibia proximal y el fémur distal mediante tomografía microcomputarizada in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la adquisición de imágenes in vivo por micro TC y proporciona orientación para el posicionamiento y la sujeción adecuados de la extremidad posterior. La principal ventaja de este procedimiento es que se pueden adquirir imágenes altamente consistentes y luego usarlas para cuantificar los cambios en la microarquitectura ósea que ocurren durante los estudios longitudinales.Coloque a la rata en posición supina sobre una cama de escáner de fibra de carbono. Después de confirmar el nivel adecuado de sedación por falta de respuesta al pinzamiento de los dedos del pie, aplique lubricación oftálmica en los ojos del animal. Sujete el pie en un tubo de espuma maleable con los dedos que se extienden fuera de un extremo y aplique cera dental para sujetar el pie firmemente dentro de la espuma, teniendo cuidado de que la espuma no se extienda sobre la región de interés.Selle herméticamente el tubo con cinta adhesiva e inserte la espuma en el tubo. Confirme un ajuste hermético entre la espuma y el tubo y deslice el tubo en el lecho del escáner de rayos X. Extiende la extremidad trasera hasta que la pata esté tensa.Confirmando la falta de sobreextensión palpando la posición de la articulación de la rodilla y tirando de la extremidad trasera opuesta y la cola hacia el torso. Extender la extremidad trasera lejos del torso hasta que la pierna esté tensa asegura que la radiografía pase a través de todas las regiones del hueso en un patrón lo más similar posible. A continuación, seque el lado adhesivo de varios trozos de cinta adhesiva y utilice la cinta modificada para asegurar la extremidad trasera y la cola no extendidas, de modo que permanezcan fuera del campo de visión de escaneo.A continuación, fije las caderas, los hombros, la cabeza y el cono de la nariz a la cama de exploración. Envuelva al animal en una envoltura veterinaria para limitar la pérdida de calor y obtenga imágenes del animal mediante microtomografía computarizada utilizando los parámetros experimentales apropiados de acuerdo con los protocolos estándar. Cuando se hayan obtenido todas las imágenes, permita que el animal se recupere en una jaula individual parcialmente calentada con monitoreo hasta que esté completamente recostado.La posición adecuada de la extremidad trasera de la rata implica que la pata esté completamente extendida y que todo el pie y el tobillo estén sujetos con espuma, lo que da como resultado una imagen adquirida de calidad suficiente para el análisis de la microarquitectura trabecular y cortical. La colocación y restricción insuficientes de la extremidad posterior pueden dar lugar a imágenes con artefactos de movimiento, mientras que una cola que no se elimina completamente del campo de visión de exploración interferirá con la atenuación de los rayos X por las muestras de exploración y alterará las mediciones de la densidad mineral de la médula ósea y los tejidos. Una vez dominado, este procedimiento se puede realizar correctamente en 5-10 minutos.Al realizar este procedimiento, es importante estar siempre consciente de la frecuencia respiratoria, el nivel de sedación y la cantidad de exposición a la radiación de la rata. Este procedimiento puede modificarse y utilizarse para evaluar otros sitios esqueléticos, como el fémur distal y las vértebras de la madera. Además, este procedimiento puede modificarse y utilizarse para otras especies de roedores como los ratones.Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo posicionar y sujetar correctamente la extremidad trasera de la rata, para obtener imágenes enfocadas y consistentes de alta resolución de la microarquitectura ósea de la tibia proximal.

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