División de célula mamífera en Matrices 3D mediante microscopia de reflexión Confocal cuantitativa

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la división celular de los mamíferos y las interacciones de la matriz celular en un entorno 3D fisiológicamente relevante. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un enfoque eficiente y general para estudiar la división celular de los mamíferos y las interacciones entre las matrices celulares. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología celular, como las bases moleculares del desarrollo de tejido normal y enfermo.

Un día antes de la transfección, coloque cinco millones de células T HEK-293 en una placa de cultivo celular de 100 mililitros en 10 mililitros de medio de cultivo celular normal. Incubar estas células a 37 grados centígrados durante 24 horas en una incubadora humidificada con un 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, justo antes de comenzar las transfecciones, retire un vial del reactivo de transfección a cuatro grados centígrados y déjelo afuera para que alcance la temperatura ambiente.

Luego, para comenzar, agregue un mililitro de medio sérico reducido a un tubo de microfuga estéril. A esto, agregue cantidades especificadas de plásmidos vectores lentivirales utilizados para la transfección y mezcle mediante pipeteo. Incuba el tubo a temperatura ambiente durante cinco minutos.

Después de cinco minutos, agregue 48 microlitros del reactivo de transfección en este tubo y mezcle suavemente mediante pipeteo. Posteriormente, incubar esta mezcla a temperatura ambiente durante al menos 15 minutos. Una vez completada la incubación, retire la placa con células T HEK-293 de la incubadora.

Agregue la mezcla de reactivo de transfección de ADN preparada gota a gota sobre las células y agite suavemente la placa para asegurar una distribución uniforme en la placa. Vuelva a colocar la placa en la incubadora. Aproximadamente seis horas después de la transfección, retire la placa y aspire el medio.

Agregue 10 mililitros de medio de cultivo fresco y transfiera la placa nuevamente a la incubadora. En varios puntos de tiempo, 24, 48 y 72 horas después de la transfección, coseche el medio de cultivo que contiene las partículas lentivirales en tubos separados. A continuación, filtre el medio de cultivo cosechado a través de un filtro estéril de 0,45 micras para eliminar los restos celulares.

Reemplace con medio de cultivo fresco después de cada cosecha. El filtrado que contiene las partículas lentivirales se puede utilizar para la transducción de inmediato o se puede almacenar a menos 80 grados centígrados. Placa de células de carcinoma de mama humano MDA-MB-231 en una placa de cultivo de 35 milímetros en medio de cultivo normal.

Incubar estas células a 37 grados centígrados durante 24 horas en una incubadora humidificada con un 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, aspire el medio de cultivo de la placa y agregue un mililitro de las partículas lentivirales junto con un mililitro de medio de cultivo fresco. Incuba las células en la incubadora durante unas 16 horas.

Una vez completada la incubación con partículas virales, retire la placa para aspirar el medio. Luego agregue dos mililitros de medio fresco y transfiéralo nuevamente a la incubadora durante 24 a 72 horas. Comprobar la expresión de H2B-mCherry en estas células transducidas utilizando un microscopio de epifluorescencia.

Para iniciar los experimentos de sincronización, primero se colocaron las células MDA-MB-231 que expresan H2B-mCherry con una confluencia del 50 al 60% en una placa de 24 pocillos. Incubar el cultivo a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante 24 horas. Al día siguiente, reemplace el medio de cultivo con 0,5 mililitros de medio que contenga dos milimolares de timidina.

Deje la placa en la incubadora durante 24 horas. Una vez completada la incubación, lavar las células tres veces con PBS para liberarlas del tratamiento con timidina. A continuación, deje las células en 0,5 mililitros de medio de cultivo normal durante cinco horas en la incubadora.

Después de esto, para bloquear estas células en la mitosis, agregue Nocodazol al medio de cultivo. Deje las células en la incubadora durante 12 horas. Una vez finalizado el tratamiento con nocodazol, saque la placa y, con un agitador orbital, agite las células durante 45 segundos a un minuto para liberar las células mitóticas.

Posteriormente, transfiera el medio que contiene las células mitóticas extraídas a un nuevo tubo de centrífuga. A continuación, añada 0,5 mililitros de medio fresco a cada pocillo. Después, repita la agitación y extracción de las células dos veces más.

Agrupe el medio total recolectado y luego centrifurícelo para pellet las células mitóticas. Después del centrifugado, vuelva a suspender el pellet celular en 0,25 mililitros de medio de cultivo celular fresco. Con un hemocitómetro, cuente el número de células.

Al comienzo de este paso, prepare 50 mililitros de solución DMEM 10x y esterilícela con filtro. A continuación, determine los volúmenes de todos los componentes que se utilizarán para hacer la matriz de colágeno 3D como se especifica en el protocolo de texto. Enfriar previamente todos estos componentes en hielo para ralentizar la gelificación del colágeno.

Ahora, a un tubo de centrífuga preenfriado de 1,5 mililitros, agregue el número requerido de celdas en medio y luego 10x DMEM, FBS, agua desionizada, colágeno y finalmente hidróxido de sodio. Mezclar cuidadosamente con una pipeta de un mililitro. Una vez que la solución esté bien mezclada, agregue 500 microlitros de la mezcla en cada pocillo de la placa de 24 pocillos.

Coloque la placa de 24 pocillos en una incubadora a 37 grados centígrados. Después de 30 minutos, saque la placa y agregue 500 microlitros de medio de cultivo precalentado encima del gel. Antes de la toma de imágenes, encienda las unidades de células vivas de los microscopios confocales y de contraste de fase.

Para capturar las células en división, coloque la placa de 24 pocillos que contiene las células incrustadas en matrices de colágeno en la unidad de células vivas del microscopio de fluorescencia. Usando el objetivo 10X, encuentre la parte inferior de la placa y luego muévala hacia arriba hasta que el microscopio enfoque a unos 500 micrómetros de la parte inferior de la placa. Mueva la platina para encontrar células en diferentes etapas de la mitosis y seleccione varias posiciones para la obtención de imágenes.

Configura el experimento de timelapse con intervalos de dos minutos. A continuación, para obtener imágenes de la red de colágeno, configure el microscopio confocal para capturar solo la luz reflejada del láser de 488 nanómetros. A continuación, coloque la placa que contiene las células en matrices de colágeno en la unidad de células vivas de este microscopio.

Encuentre la parte inferior de la placa y luego mueva la lente del objetivo hacia arriba hasta que enfoque a unos 100 micrómetros de la parte inferior de la placa. Mueva la platina para buscar celdas y seleccionar varias posiciones para la obtención de imágenes. Configura el experimento de timelapse con intervalos de cinco minutos.

Aquí se muestran imágenes fluorescentes de una célula de MDA-MB-231 que expresa H2B-mCherry en división incrustada en la matriz de colágeno. Las diferentes fases de la mitosis se observan fácilmente como se esperaba. La distribución de las fibras de colágeno en blanco visualizada simultáneamente mediante microscopía de reflexión confocal cambia muy poco durante el curso de la mitosis.

La fase G2-M sincronizada con células e incrustada en una matriz de colágeno completa la división celular en las dos primeras horas, mientras que las células asíncronas de control se dividen aleatoriamente. La cuantificación de la distribución de las fibras de colágeno durante las fases de interfase y mitóticas sugiere que la deformación de la matriz es mínima durante la división celular y mayor en las células de interfase. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en siete días, desde la generación de la línea celular estable hasta el análisis de la división celular de video en una matriz 3D.

Después de ver este video, es de esperar que tenga una buena comprensión de cómo sincronizar y monitorear la división de células de mamíferos en matrices 3D utilizando imágenes de células vivas y cómo determinar la deformación de la matriz usando técnicas de análisis de imágenes cuantitativas y microscopía de reflexión confocal.