Name: Hidrogeles ultrafino Porated elástico como una membrana del sótano biomiméticos para doble cultura de la célula (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 34 s
Description: Aprende a crear membranas basales biomiméticas ultrafinas y porosas usando polietilenglicol y óxido de zinc para cultivos celulares duales. Este método permite ajustar propiedades mecánicas y bioquímicas para estudiar interacciones celulares en ingeniería de tejidos.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Los autores desean agradecer al Prof. Paul Van Tassel y Prof. Chinedum Osuji sus conversaciones reflexivas y conocimientos de la ciencia de los materiales. Fondos para este trabajo fue proporcionada por el nuevo premio de iniciativa Dubinsky e institutos nacionales de salud NIBIB BRPR01 EB16629-01A1.

Por favor, lea la hoja de datos de seguridad de Material (MSDS) de todos los materiales anteriores utilizar y las precauciones de seguridad en todos veces.
1. síntesis de agujas de óxido de Zinc
<ol>
	<li>Preparar 250 mL de 0,04 M Zn (NO3)2* solución de 6 H2O mediante la adición de 2,9749 g de nitrato de zinc a 250 mL de agua.</li>
	<li>Agregar 6 g de NaOH en 150 mL de agua para preparar 150 mL de 1 M NaOH.</li>
	<li>Instalar un baño de aceite mineral sobre una placa caliente con agitador y sumerja un matraz de fondo redondo de 500 mL en el baño del aceite a temperatura ambiente.</li>
	<li>Añadir 250 mL de Zn (NO3)2* 6 H2O al matraz y empiece el revolvimiento de la reacción.</li>
	<li>Agregar 150 mL de solución de NaOH (un precipitado blanco forma brevemente y luego desaparecen como continúan mezclando las dos soluciones). Revuelva durante 2 h descubierto.</li>
	<li>Calentar el matraz a 55-60 ° C y continuar la agitación por 24 h.</li>
	<li>Apagar el fuego y deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente mientras que revuelve.</li>
	<li>Filtrar la solución en un embudo Büchner con un tamaño de poro de 11 μm y deje que se seque durante la noche, al descubierto. Cuando el papel de filtro no está mojado de la solución vertida y un polvo blanco ha formado sobre los agujeros del embudo, las partículas se secan completamente.</li>
	<li>Recoger agujas de ZnO y prepararse para microscopía electrónica de barrido (SEM) para confirmar la morfología acicular. Brevemente, montaje de cinta de carbón sobre un trozo de perno y use una espátula de metal para manchar las agujas de ZnO en la cinta de carbón. Sputter coat con iridio de 8 mm a una densidad de 22,4 g/cm3 y adquirir imágenes en 10 kV.</li>
</ol>
2. adición de capa de Zinc de sacrificio en portaobjetos para HCl inducida por liberación de PEG
<ol>
	<li>Preparar solución de acetato de zinc disolviendo 1,756 g de acetato de zinc en 200 mL de metanol.</li>
	<li>Limpiar 3 "x 1" simple microscopio con etanol al 70% y una toallita desechable. Seque al aire durante 10 minutos.</li>
	<li>Coloque un vaso de 150 mm en una placa de Petri y precalentar a 150-160 ° C.</li>
	<li>Utilizando una pipeta de vidrio con un bulbo de la pipeta, sostener el portaobjetos con unas pinzas y capa diapositivas aplicando 5 gotas de acetato de zinc, formando una capa delgada dispersada en la diapositiva. Permite el exceso de solución gotee en la solución.</li>
	<li>Colocar el portaobjetos en la placa Petri precalentado (150-160 ° C) con el zinc acetato recubierto hacia arriba. Deja sobre la placa durante 15 minutos.</li>
	<li>Retire el portaobjetos con las pinzas y deje que se enfríe a temperatura ambiente. La diapositiva aparecerá a recubrir con vetas blancas.</li>
	<li>Quite cualquier exceso cinc que queda en las diapositivas usando una toallita desechable para quitar rayas blancas prominentes. La superficie debe ser uniforme.</li>
	<li>Exponer a la luz las diapositivas preparadas a los rayos UV en una campana de bioseguridad por al menos 1 h para garantizar la esterilidad. PRECAUCIÓN: La luz ultravioleta es dañina a los ojos y piel expuesta. Evitar la exposición directa a los ojos o la piel y apague el suministro eléctrico cuando no se usa.</li>
</ol>
3. preparación de aisladores eléctricos de silicona
<ol>
	<li>Hoja de silicona cortado en cuadrados de menos de 1 "x 1" (aisladores deben ser capaces de encajar en un plato de 6 pozos).</li>
	<li>Perfore agujeros de 8-12 mm en el centro de las plazas con un punzón de biopsia.</li>
	<li>Aisladores de silicona autoclave durante 20 min a 121,0 ° C y 1,12 kg/cm.</li>
</ol>
4. preparación de solución de PEG y PEG Gel de síntesis
Nota: Funcionalización y polimerización de PEG ha sido extensamente explorada y detallado previamente por nuestro laboratorio y otros. 8 , 10 , 11 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17
<ol>
	<li>Combinar el péptido adhesivo del celular RGD con acryloyl-PEG-NHS en bicarbonato de sodio 50 mM (pH 8,5) en una proporción molar 1:1 para permitir el funcionamiento de la terminal amino del péptido con la molécula de acrilato, una reacción bioquímica que ha sido previamente caracteriza por producir mayor que 85% de eficiencia. 17</li>
	<li>Preparar foto iniciador mezclando 2,2-dimetoxi-2-Fenilacetofenona con 1-Vinyl-2-pirrolidona en una concentración de 300 mg/mL.</li>
	<li>En separar los tubos de 1,5 mL, pesar las siguientes: 20 mg de ZnO agujas, 12,5 mg de PEG-DA y 2,5 mg de PEG-RGD.</li>
	<li>Suspender 20 mg de ZnO agujas en 270 μl de solución al 10% FBS/PBS; Vortex para mezclar (aproximadamente 15 s).</li>
	<li>Brevemente (&#60; 1 s) girar la solución en una centrifugadora mini de sobremesa para llevar cualquier ZnO agregados a la base del tubo.</li>
	<li>Recoger 250 μl de la parte superior de la solución de ZnO, para asegurar que los agregados en la parte inferior del tubo. Combinan con PEG-DA y PEG-RGD para crear una solución de PEG con aproximadamente 2,5 mM RGD. Vortex para mezclar (aproximadamente 15 s).</li>
	<li>Añadir 2 μl de acetofenona/n-vinyl pirrolidona foto iniciador y de vortex para mezclar (5 s).</li>
	<li>Añadir 20 μl de la solución del polímero a lo largo del centro de las diapositivas de ZnO cubierto.</li>
	<li>Lentamente baje una segunda diapositiva en la parte superior, con la cara de la capa de ZnO abajo (la solución de PEG debe ser entre dos capas de ZnO cubierto). Trate de evitar la formación de burbujas de aire. Mover las diapositivas lateralmente a lo largo del eje principal para permitir que las burbujas para escapar y para distribuir la solución a una capa delgada. Cubren la mayoría de lo portaobjetos con la solución de polímero. Crear una proyección leve con la diapositiva superior para asegurarse de que las diapositivas se pueden tirar en pasos posteriores.</li>
	<li>Reticulación las diapositivas bajo una lámpara de nm UV 365 (aproximadamente 10 mW/cm2) durante 15 minutos.</li>
</ol>
5. liberación de PEG geles de portaobjetos de vidrio
<ol>
	<li>Aplique presión en la Corredera colgante y manualmente tire que las dos diapositivas aparte a un ritmo lento en orden de evitar agrietar las diapositivas. Permita que los geles secos durante al menos 5 minutos o toda la noche.</li>
	<li>Coloque el portaobjetos en un vaso estéril 25 mm plato de Petri y verter suavemente la solución de ácido clorhídrico de 1 M en la diapositiva, usar sólo lo suficiente para cubrir el portaobjetos (aproximadamente 10-20 mL). Muévalo suavemente la caja Petri; el gel debe comenzar a levantar la diapositiva como el HCl disuelve el recubrimiento de zinc de sacrificio y agujas. Una vez que el gel está libre de la diapositiva, vierta el ácido clorhídrico en la solución.</li>
	<li>Enjuagar el gel vertiendo suavemente aproximadamente 25 mL de PBS 1 x en la caja Petri hasta el slide y el gel se sumergieron.</li></ol>Cuidadosamente vierta de PBS en un contenedor de residuos.
	<li>Suavemente vierta aproximadamente 25 mL de PBS 1 x en la caja Petri hasta que el gel esté flotando en la solución.</li>
	<li>Con unas pinzas, con cuidado deslice el aislador de silicona en gel y levantar el gel en la misma.</li>
	<li>Transferir el aislador y el gel en una placa de 6 pozos con estéril de 1 x PBS.</li>
	<li>Repita este proceso hasta que todos los geles se han quitado de las diapositivas y se remojo en PBS. Exponga los geles preparados a la luz UV en una campana de bioseguridad por al menos 1 h para garantizar la esterilidad.</li>

6. siembra de células de bicapas
<ol>
	<li>Preparar las células A549 para la siembra. Brevemente, enjuagar un matraz de2 75 cm con 5 mL de PBS 1 x, agregue 3 mL de 0.25% tripsina-EDTA y dejar reposar 2-3 min a 37 ° C.<ol>
		<li>Mecánicamente agitar el frasco, calmar la reacción con medio de Eagle modificado de 3 mL Dulbecco con 10% fetal bovino suero y 1% penicilina-estreptomicina y recoger en un matraz cónico de 15 mL. Enjuague con un adicional 4 mL de completa de Dulbecco modificado Eagle Media y recoger en el mismo cónico. Girar las células a 475 x g durante 6 minutos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mientras que las células están girando hacia abajo, agregar una pequeña gota de medio de Eagle modificado de Dulbecco completa en cada pocillo de una placa de 6 pozos. Utilice unas pinzas para trasvasar los aisladores de silicona con los geles de la nueva placa de la pozo de 6, tales que el gel esté apoyado en la caída de los medios de comunicación. Ahora que los geles se extienden en una capa delgada, asegurarse de que no hay ningunos agujeros grandes visibles al ojo. Esto debe hacerse inmediatamente antes de la siembra de células para evitar la sequedad y el agrietamiento de los geles.</li>
	<li>Resuspender las células en medio de Eagle modificado de Dulbecco con 10% fetal bovino suero y 1% penicilina-estreptomicina en una concentración de 6 x 105 células/mL. Agregar la gota de suspensión de célula sabio al centro del gel, tratando de mantener un menisco en la zona perforado hacia fuera de la membrana de silicona. Permitir que las células se adhieran durante 4 horas.</li>
	<li>Después de 4 h, Añadir 0,5 mL de medio de Dulbecco modificado Eagle completo al pozo e incubar durante una noche a 37 ° C para permitir la completa adherencia.</li>
	<li>Al día siguiente, preparar HUVECs para la siembra de la célula.<ol>
		<li>Enjuagar un matraz de2 75 cm con 5 mL de 1 X PBS, añadir 3 mL de 0.25% tripsina-EDTA y dejar reposar 2-3 min a 37 ° C.</li>
		<li>Mecánicamente agitar el frasco, calmar la reacción con 3 mL de medio M199 con suplemento para crecimiento de 1%, 20% suero bovino fetal y 1% penicilina-estreptomicina y recoger en un cónico de 15 mL.</li>
		<li>Enjuague con 4 mL de medio completo M199 y recoger en el mismo cónico. Girar las células a 475 x g durante 6 minutos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Mientras que las células están girando hacia abajo, agregar una pequeña gota de medio completo 199 a cada pocillo de una placa de 6 pozos nuevos. Colocar un aislador de silicona nueva en el pozo con la caída de los medios de comunicación en el centro de la silicona.</li>
	<li>Cuidadosamente con unas pinzas, voltear el aislador de silicona el gel de PEG con células A549 en el aislador de apoyo en la nueva placa de la pozo 6.</li>
	<li>Suspender HUVECs en una concentración de 6 x 105 células/mL y añadir la suspensión de células en el centro de la gota del gel volteado sabio, tratando de mantener un menisco en el gel de dentro del área de perforado hacia fuera de la membrana de silicona. Permitir que las células se adhieran por 2 h.</li>
	<li>Después de 2 h, suavemente Agregue 2 mL de medio completo M199 a cada pocillo.</li>
</ol>
7. inmunofluorescencia
<ol>
	<li>Con cuidado retire los medios de comunicación de geles con una pipeta manual y agregar aproximadamente 500 μl de paraformaldehído al 4% (PFA) para el centro del gel donde se siembran las células. Deje reposar durante 30 min a temperatura ambiente. PRECAUCIÓN: PFA es un químico tóxico; Use protección y garantizar el manejo se realiza en un gabinete de seguridad biológica.</li>
	<li>Cuidadosamente Quite la PFA y añadir aproximadamente 500 μl de BSA 2% en PBS a cada gel. Deje reposar por 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Retire con cuidado la BSA. Preparar anticuerpos primarios a una dilución de 1: 100 en 2% de BSA en PBS y agregar 500 μl de cada gel. Deje reposar por 1 h a temperatura ambiente. Enjuagar suavemente con 500 μl de PBS 1 x.<ol>
		<li>Repetir el mismo proceso con los anticuerpos secundarios. Utilizar los siguientes anticuerpos: 1) humana CD144 (VE-cadherina) clon 16B1; 2) humana CD324 clon (E-Cadherin) 6714; 3) anti-humanos CD31 (PECAM-1) clon C-20; 4) anti-549; 5) anti-ratón FITC; 6) contra cabra Alexa Fluor 647. Para visualizar la F-actina, agregar 500 μl de Phalloidin (10 μg/mL en PBS) durante 20 minutos.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cuidadosamente retire los anticuerpos secundarios o phalloidin y agregar 500 μl de DAPI (0.1 μg/mL) durante 20 minutos Retire con cuidado la solución DAPI y suavemente añadir 1,5 mL de 1 x PBS a cada pocillo para que los geles están en suspensión.<ol>
		<li>Mediante aisladores de silicona y pinzas, transferir un gel a un portaobjetos de vidrio. Hacer esto para cada gel inmediatamente antes de la proyección de imagen y sustituir los geles en solución de PBS después de la proyección de imagen.</li>
		<li>Alternativamente, Monte geles utilizando un medio de montaje de DAPI. Sellar bien las muestras con esmalte de uñas, adquisición de imágenes dentro de 2 días para prevenir la sequedad y el agrietamiento del gel. Consulte la tabla 1 para solución de problemas.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Domogatskaya, A., Rodin, S., Tryggvason, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+diversity+of+laminins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Functional diversity of laminins.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 28, 523-553 (2012).</li>
<li>Howat, W. J., Holmes, J. A., Holgate, S. T., Lackie, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+pores+in+human+bronchial+epithelium%3A+a+conduit+for+infiltrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Basement membrane pores in human bronchial epithelium: a conduit for infiltrating cells.</a> Am J Pathol. 158, 673-680 (2001).</li>
<li>Lauridsen, H. M., Pober, J. S., Gonzalez, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+composite+model+of+the+human+postcapillary+venule+for+investigation+of+microvascular+leukocyte+recruitment%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">A composite model of the human postcapillary venule for investigation of microvascular leukocyte recruitment.</a> FASEB J. 28, 1166-1180 (2014).</li>
<li>Mul, F. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+migration+of+neutrophils+across+monolayers+of+endothelial+and+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">Sequential migration of neutrophils across monolayers of endothelial and epithelial cells.</a> J Leukoc Biol. 68, 529-537 (2000).</li>
<li>Hermanns, M. I., Unger, R. E., Kehe, K., Peters, K., Kirkpatrick, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+epithelial+cell+lines+in+coculture+with+human+pulmonary+microvascular+endothelial+cells%3A+development+of+an+alveolo-capillary+barrier+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Lung epithelial cell lines in coculture with human pulmonary microvascular endothelial cells: development of an alveolo-capillary barrier in vitro.</a> Lab Invest. 84, 736-752 (2004).</li>
<li>Birkness, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+tissue+culture+bilayer+model+to+examine+early+events+in+Mycobacterium+tuberculosis+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">An in vitro tissue culture bilayer model to examine early events in Mycobacterium tuberculosis infection.</a> Infect Immun. 67, 653-658 (1999).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+alveolar+epithelial+cells+attenuate+pulmonary+microvascular+endothelial+cell+permeability+under+septic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Human alveolar epithelial cells attenuate pulmonary microvascular endothelial cell permeability under septic conditions.</a> PLoS One. 8, 55311(2013).</li>
<li>Pellowe, A. S., Gonzalez, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+matrix+biomimicry+for+the+creation+of+investigational+and+therapeutic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdiscip+Rev+Nanomed+Nanobiotechnol%22%5BJournal%5D)">Extracellular matrix biomimicry for the creation of investigational and therapeutic devices.</a> Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 8, 5-22 (2016).</li>
<li>Peyton, S. R., Raub, C. B., Keschrumrus, V. P., Putnam, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+poly%28ethylene+glycol%29+hydrogels+to+investigate+the+impact+of+ECM+chemistry+and+mechanics+on+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The use of poly(ethylene glycol) hydrogels to investigate the impact of ECM chemistry and mechanics on smooth muscle cells.</a> Biomaterials. 27, 4881-4893 (2006).</li>
<li>West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-patterned+hydrogels%3A+Customized+cell+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Protein-patterned hydrogels: Customized cell microenvironments.</a> Nat Mater. 10, 727-729 (2011).</li>
<li>DeLong, S. A., Gobin, A. S., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+immobilization+of+RGDS+on+hydrogel+surfaces+to+direct+cell+alignment+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Covalent immobilization of RGDS on hydrogel surfaces to direct cell alignment and migration.</a> J Control Release. 109, 139-148 (2005).</li>
<li>Engler, A. J., Sen, S., Sweeney, H. L., Discher, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+elasticity+directs+stem+cell+lineage+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Matrix elasticity directs stem cell lineage specification.</a> Cell. 126, 677-689 (2006).</li>
<li>Taite, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioactive+hydrogel+substrates%3A+probing+leukocyte+receptor-ligand+interactions+in+parallel+plate+flow+chamber+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Bioactive hydrogel substrates: probing leukocyte receptor-ligand interactions in parallel plate flow chamber studies.</a> Ann Biomed Eng. 34, 1705-1711 (2006).</li>
<li>Lauridsen, H. M., Walker, B. J., Gonzalez, A. L. <a target="_blank" href="http://www.worldscientific.com/doi/abs/10.1142/S2339547814500113">Chemically- and mechanically-tunable porated polyethylene glycol gels for leukocyte integrin independent and dependent chemotaxis.</a> Technology. 02, 133-143 (2014).</li>
<li>DeLong, S. A., Moon, J. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+immobilized+gradients+of+bFGF+on+hydrogel+scaffolds+for+directed+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Covalently immobilized gradients of bFGF on hydrogel scaffolds for directed cell migration.</a> Biomaterials. 26, 3227-3234 (2005).</li>
<li>Lauridsen, H. M., Gonzalez, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic%2C+ultrathin+and+elastic+hydrogels+regulate+human+neutrophil+extravasation+across+endothelial-pericyte+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+one%22%5BJournal%5D)">Biomimetic, ultrathin and elastic hydrogels regulate human neutrophil extravasation across endothelial-pericyte bilayers.</a> PLOS one. 12, 0171386-0171405 (2017).</li>
<li>Peters, E. B., Christoforou, N., Leong, K. W., Truskey, G. A., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Poly%28Ethylene+Glycol+Hydrogel+Scaffolds+Containing+Cell-Adhesive+and+Protease-Sensitive+Peptides+Support+Microvessel+Formation+by+Endothelial+Progenitor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Poly(Ethylene Glycol Hydrogel Scaffolds Containing Cell-Adhesive and Protease-Sensitive Peptides Support Microvessel Formation by Endothelial Progenitor Cells.</a> Cellular and Molecular Bioengineering. 9, 38-54 (2016).</li>
<li>Schwartz, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+strategy+for+mimicking+the+extracellular+matrix+provides+new+insight+about+tumor+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Integr+Biol+%28Camb%29%22%5BJournal%5D)">A synthetic strategy for mimicking the extracellular matrix provides new insight about tumor cell migration.</a> Integr Biol (Camb). 2, 32-40 (2010).</li>
<li>Booth, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acellular+normal+and+fibrotic+human+lung+matrices+as+a+culture+system+for+in+vitro+investigation%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Respir+Crit+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Acellular normal and fibrotic human lung matrices as a culture system for in vitro investigation.</a> Am J Respir Crit Care Med. 186, 866-876 (2012).</li>
<li>Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membranes%3A+structure%2C+assembly+and+role+in+tumour+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Basement membranes: structure, assembly and role in tumour angiogenesis.</a> Nat Rev Cancer. 3, 422-433 (2003).</li>
<li>Roudsari, L. C., Keffs, S. E., Witt, A. S., Gill, B. J., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+3D+Poly%28ethylene+glycol%29-based+Tumor+Angiogenesis+Model+to+Study+the+Influence+of+Vascular+Cells+on+Lung+Tumor+Cell+Behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A 3D Poly(ethylene glycol)-based Tumor Angiogenesis Model to Study the Influence of Vascular Cells on Lung Tumor Cell Behavior.</a> Scientific Reports. 6, 1-15 (2016).</li>
<li>Bermudez, L. E., Sangari, F. J., Kolonoski, P., Petrofsky, M., Goodman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+efficiency+of+the+translocation+of+Mycobacterium+tuberculosis+across+a+bilayer+of+epithelial+and+endothelial+cells+as+a+model+of+the+alveolar+wall+is+a+consequence+of+transport+within+mononuclear+phagocytes+and+invasion+of+alveolar+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Infect+Immun%22%5BJournal%5D)">The efficiency of the translocation of Mycobacterium tuberculosis across a bilayer of epithelial and endothelial cells as a model of the alveolar wall is a consequence of transport within mononuclear phagocytes and invasion of alveolar epithelial cells.</a> Infect Immun. 70, 140-146 (2002).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo detallado aquí nos ha permitido crear un armonioso hidrogel de PEG para servir como un andamio biomiméticos BM. En concreto, de diferentes pesos moleculares de PEG, péptido verbal estrategias y estructuras microcristalinas de óxido de zinc o concentraciones, el módulo de elasticidad, propiedades bioquímicas y la estructura porosa de los hidrogeles pueden ser modificados, respectivamente. El andamio de PEG ultrafino cuenta con una mayor densidad de poro y un menor diámetro de poro más mimético de las caracter...

Matrices extracelulares (ECM) son los andamios de la proteína que soporte accesorio de la célula y sirven como barreras entre tipos celulares distintos y son un componente esencial de los órganos y tejidos complejos. En contraste con el tejido conectivo intersticial, la membrana basal (BM) es un tipo especializado de ECM que actúa como una barrera para dividir compartimentos de tejido uno del otro. BMs son aproximadamente 100 μm de espesor y por lo tanto permiten la comunicación directa e indirecta entre las células a cada lado. Dos ejemplos comunes de BMs son vasculares BMs, encontradas en la pared microvascular entre los pericitos y las células endoteliales y BMs en las vías respiratorias que se encuentran entre las células endoteliales y epiteliales. BMs sirven un papel importante en la regulación de la función de la célula, tales como migración y polaridad celular, en salud y enfermedad. 1 la composición, rigidez, arquitectura y porosidad de BMs varía según los sistemas del órgano para facilitar distintas funciones fisiológicas. Por ejemplo, los poros BM son críticos para mantener la comunicación célula-célula, difusión de la molécula soluble y para la migración de células inmunes durante la inflamación o las bacterias durante una infección. En las vías respiratorias, poros abarcan todo el espesor del BM, con diámetros que van desde 0.75 3.86 μm.2
La naturaleza fina de la BM asegura que aunque los tipos de la célula están separados físicamente uno del otro, comunicación intercelular a través de señalización paracrina y contacto mediado se conserva. Por lo tanto, para estudiar enfermedades humanas in vitro, los investigadores han confiado en insertos de apoyo permeable poroso a bicapas celulares cultura. 3 estos modelos han sido críticos para la comprensión de la comunicación celular que desempeña un papel en la salud y la enfermedad. 3 , 4 , 5 , 6 , 7 apoyo permeable insertos satisfacen los requisitos básicos para la comprensión de cómo la señalización de la célula regula procesos fisiológicos, tales como reclutamiento de leucocitos e infiltración bacteriana; sin embargo, los insertos tienen limitaciones importantes y dejar de imitar a un humano soporte BM Permeable insertos carecen de afinabilidad mecánico y bioquímico, y la estructura porosa simplista no imitan la estructura fibrosa que crea los poros irregulares típico de BMs. Por lo tanto, hay una creciente necesidad de sistemas ajustables que pueden recrear las propiedades nativas de BM que influyen en los procesos celulares.
Sustratos a base de polímero son candidatos ideales para el desarrollo de biomimetic BMs para estudiar celulares bicapas en un contexto que imita más de cerca el ambiente en vivo . 8 , 9 , 10 , 11 , 12 polímeros son mecánicamente ajustables y pueden ser modificados químicamente para incorporar fragmentos de péptido biomimético. 11 , 12 , 13 el bioinert polímero polietileno glicol (PEG) se puede utilizar para construir biomiméticos BMs y el trabajo reciente ha detallado la síntesis de geles de ácido arginina-glicina-aspártico (RGD) PEG mecánicamente ajustables con redes porosas que apoyen el crecimiento de la célula y Quimiotaxis de células inflamatorias. 14 aunque publicado basada en PEG sustratos proporcionan un modelo más realista de un ECM humano que soportes permeables, muchos de estos modelos son extremadamente gruesos, con una profundidad de aproximadamente 775 μm que limita la capacidad de crear culturas bicapa con célula contactos. 14
Aquí, presentamos un protocolo para la creación de un imitador de BM clavija del polímero que supera muchas de las limitaciones de las tecnologías actuales de la cultura de la bicapa del celular. Hemos desarrollado un método de las plantillas que incorpora el óxido de zinc, un material ampliamente utilizado para la fabricación de producción microcristalina, en el polímero durante la síntesis y el entrecruzamiento, que se retira posteriormente y de forma selectiva de la polímero resultante en a granel. Este proceso genera una red porosa al azar, mímico la red de poros interconectados y tortuoso de BMs humanas. Además, la porosidad puede modificarse cambiando el tamaño y la forma de los microcristales de óxido de zinc a través de la modificación de la estequiometría de la reacción durante la producción de aguja. La técnica desarrollada aquí crea un hidrogel ultrafino que imita el grueso del BM humanos por último, la mecánica, la porosidad, y la composición bioquímica de estas construcciones BM-como se puede modificar fácilmente para generar un microambiente que es la más similar a ése visto en vivo.

<table><tbody><tr><td>Cloruro de hidrogel 1M (HCl)</td><td>EMD</td><td>HX0603-75 2.5L</td><td>Estéril. Úselo en campana extractora con protección para los ojos y guantes.</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>14040-133 500 mL</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Nitrato de Zinc Hexahidratado (Zn(NO3)2&bull; 6H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228737-500g</td><td>Úselo con protección para los ojos y guantes.</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio (NaOH)</td><td>Macron Chemicals</td><td>278408-500g</td><td>Úselo con protección para los ojos y guantes.</td></tr><tr><td>Acetato de zinc dihidratado ((CH3O2)2Zn2+&bull; 2H2O)</td><td>Fisher Scientific AC45180010</td><td>1 kg</td><td>Úselo con protección para los ojos y guantes.</td></tr><tr><td>Metanol (CH3OH)</td><td>J.T. Baker</td><td>9070-05 4L</td><td>Uso en campana extractora con protección ocular y guantes.</td></tr><tr><td>VWR Life Science Seradigm Premium Grade FBS</td><td>VWR</td><td>97068-085</td><td>Filtro estéril. 5 mL FBS en 45 mL PBS</td></tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>CVS&nbsp;</td><td>PLD-B280B</td><td>Ninguno</td></tr><tr><td>Matraz de fondo redondo</td><td>ChemGlass</td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>Termómetro</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>Barra</td><td></td><td></td> agitadora <td>N/A</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio prelimpios lisos de 3"x1"x1" mm de espesor</td><td>Thermo Scientific</td><td>420-004T</td><td>Rocíe con etanol y deje secar antes de usar.</td></tr><tr>Pipetas <td></td><td></td><td>pasteur de vidrio</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Bombillas de goma de 1 mL</td><td>N/A</td>Placas <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td> de<td>Petri de plástico de 100 mm</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Pinzas</td><td></td><td></td> estériles <td>N/</td></tr><tr><td>A Aisladores</td><td></td><td></td> de silicona de <td>0,8 mm de espesor</td></tr><tr><td>Punzones de</td><td></td><td></td> polidimetilsiloxano (PDMS) <td>N/</td></tr><tr><td>A Frascos de vidrio</td><td></td><td></td><td>N/A</td></tr><tr><td>Placas de 6 pocillos</td><td>Cellstar</td><td>657 160</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Papel de filtro</td><td>Whatman</td><td>8519</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Placa calefactora de agitador</td><td>VWR Dya-Dual</td><td>12620-970</td><td>Úselo con protección para los ojos y guantes.</td></tr><tr><td>2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenona (C6H5COC(OCH3)2C6H5</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>24650-42-8</td><td>Úselo con protección para los ojos y guantes.</td></tr><tr><td>1-Vinil-2-pirrolidona (C6H9NO)</td><td>Aldrich</td><td></td><td>Úselo con protección para los ojos y guantes.</td></tr><tr><td>Polietilenglicol 10.000 (H(OCH2CH2)10.000OH)</td><td>Fluka</td><td>81280-1kg</td><td>Úselo con protección ocular y guantes.</td></tr><tr><td>RGDS</td><td>Life Tein</td><td>180190</td><td>Úselo con protección para los ojos y guantes.</td></tr><tr><td>Lámpara UV de onda larga Blak-Ray</td><td>UVP</td><td>Modelo B 100AP</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf USA</td><td>Scientific</td><td>1615-5500</td><td>N/A</td></tr></tbody></table>

hidrogeles ultrafino porated elástico como una membrana del sótano biomiméticos para doble cultura de la célula

Ultrathin Porated Elastic Hydrogels As a Biomimetic Basement Membrane for Dual Cell Culture

La membrana basal es un componente crítico de bicapas celulares que puede variar en rigidez, composición, arquitectura y porosidad. Estudios in vitro de bicapas endotelial epitelial han dependido tradicionalmente de modelos de apoyo permeables que permitan la cultura de la bicapa, pero soportes permeables son limitados en su capacidad para replicar la diversidad de humanos las membranas del sótano. En cambio, modelos de hidrogel que requieren síntesis química son altamente armoniosas y permitan la modificación de la rigidez del material y la composición bioquímica mediante la incorporación de proteínas o péptidos biomiméticos. Sin embargo, modelos de hidrogel tradicional están limitados funcionalidad porque carecen de poros para contactos célula-célula y funcional en vitro estudios de migración. Además, debido al grueso de los hidrogeles tradicionales, ha sido difícil incorporación de los poros que abarcan todo el espesor de los hidrogeles. En el presente estudio, utilizamos hidrogeles poly-(ethylene-glycol) (PEG) y un método de plantillas nuevo óxido de zinc para abordar las deficiencias anteriores de hidrogeles biomiméticos. Como resultado, presentamos un hidrogel ultrafino, similar a la membrana basal que permite la cultura de bicapas celulares confluentes en un andamio personalizable con arquitecturas de poro variable, propiedades mecánicas y composición bioquímica.

PEG-RGD hidrogeles se formaron colocando la solución de polímero entre dos capas de óxido de zinc de sacrificio y creando plantillas de poro con agujas de óxido de zinc. Entonces fueron quitados componentes sacrificio óxido de cinc con ácido clorhídrico, generando ultrafinos hidrogeles de PEG con poros continuos (figura 1). La morfología de las agujas de óxido de zinc fue confirmada por microscopía electrónica de barrido (SEM), y el promedio de la longitud y ...

Modelos de cultura bicapa actuales no permiten estudios funcionales en vitro que imitan en vivo microambientes. Uso de glicol de polietileno y un método de plantillas de óxido de zinc, este protocolo describe el desarrollo de una membrana del sótano biomiméticos ultrafino con rigidez sintonizable, porosidad y composición bioquímica que imita muy de cerca en vivo matrices extracelulares.

Hidrogeles ultrafino Porated elástico como una membrana del sótano biomiméticos para doble cultura de la célula

The basement membrane is a critical component of cellular bilayers that can vary in stiffness, composition, architecture, and porosity. In vitro studies ...

El objetivo general de este protocolo es describir un método de plantillas de polietilenglicol y óxido de zinc para crear una membrana basal biomimética porosa y ultradelgada que admita el cultivo celular dual y tenga propiedades mecánicas y químicas ajustables. La principal ventaja de esta técnica es que podemos crear hidrogeles ultrafinos, porosos, ajustables mecánica y bioquímicamente. Permiten el apoyo al cultivo de células simples o dobles.Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ingeniería de tejidos, incluida la forma en que los cultivos celulares duales reaccionan e interactúan con microambientes que imitan las membranas basales humanas. Las implicaciones de esta técnica se extienden a una amplia variedad de sistemas biológicos y tejidos, lo que en última instancia permite una mayor investigación biomimética con una mejor traducción para las enfermedades humanas. Agregue 250 mililitros de nitrato de zinc a un matraz y comience a agitar la reacción.Luego, agregue 150 mililitros de solución de hidróxido de sodio. Se formará brevemente un precipitado blanco y luego desaparecerá a medida que las dos soluciones continúen mezclándose. Revuelve la mez

ultrathin-porated-elastic-hydrogels-as-biomimetic-basement-membrane

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

En este protocolo, se demuestra la fabricación de una amplia microactuator de mensajes desplazadas verticalmente en que se basa la tecnología, y cómo esta tecnología de base pueden ser modificados para llevar a cabo de alto rendimiento de cultivo de células mecánica dinámica, tanto en la cultura de dos dimensiones y tres dimensiones paradigmas.

Plataformas microfabricated para el cultivo celular mecánico dinámico

Técnicas sencillas se describen para la producción rápida de microfabricated sistemas de cultivo neuronal mediante un dispositivo digital de microespejos para la litografía de proyección dinámica máscara regular de los sustratos de cultivo celular. Estos sistemas de cultivo pueden ser más representativos de la arquitectura biológica natural, y las técnicas descritas podrían ser adaptados para numerosas aplicaciones.

Fabricación de hidrogeles micropatterned para sistemas de cultivo neuronal usando fotolitografía dinámica de proyección Máscara

Este protocolo se centra en la utilización de la capacidad inherente de las células madre para tomar el ejemplo de su matriz extracelular circundante y ser inducidas a diferenciarse en múltiples fenotipos. Este manuscrito métodos extiende nuestra descripción y caracterización de un modelo utilizando un hidrogel bicapa, compuesto de PEG-fibrina y colágeno, a la vez co-diferenciar derivadas de tejido adiposo células...

Ingeniería de un hidrogel de dos capas para el control de la diferenciación ASC

Describimos la fabricación de láminas de hidrogel microestampadas utilizando un proceso simple, que se puede ensamblar y manipular de forma independiente. Utilizando estas láminas modulares de hidrogel, se puede generar un sencillo sistema de cultivo celular en 3D a macroescala con un microambiente celular controlado.

Construcción de Hojas modular de hidrogel para la arquitectura celular 3D a escala macro micropatterned

Este artículo presenta un enfoque simple para proporcionar cepas estática gradiente discontinua en un hidrogel celular cargado concéntrico regular alineación de celda para ingeniería de tejidos.

Gradiente de tensión Chip para estimulantes comportamientos celulares en hidrogel cargadas de celulares

La ingeniería y el análisis de tejidos portadores de carga con poblaciones celulares heterogéneas siguen siendo un desafío. Aquí, describimos un método para crear discos de hidrogel de alginato de dos capas como plataforma para el cocultivo de diversas poblaciones celulares dentro de una construcción.

Las construcciones en capas de alginato: Una plataforma para el co-cultivo de poblaciones celulares heterogéneas

Este es un método para crear un andamio de cultivo celular de 3 dimensiones de la matriz extracelular pulmonar. pulmonar intacta se procesa en hidrogeles que pueden apoyar el crecimiento de células en tres dimensiones.

Los hidrogeles sintonizable de la matriz extracelular pulmonar por la 3D de Cultivos Celulares

Hidrogeles de ingeniería de la proteína recombinantes son ventajosos para el cultivo celular 3D ya que permiten completa afinabilidad de la espina dorsal del polímero y por lo tanto, el microambiente de la célula. Aquí, describimos el proceso de purificación de proteína recombinante como elastina y su aplicación en la encapsulación de la célula de hidrogel 3D.

Producción de la proteína elastina como hidrogeles para encapsulación y el Immunostaining de células en 3D

Los insertos de cultivo de tejidos con membranas de plástico son el estándar de oro en los laboratorios de cultivo celular como soportes permeables para establecer capas celulares y modelos de tejidos de barrera. En este artículo, presentamos un método simple para reemplazar la membrana de plástico con una membrana biológicamente más relevante hecha de una proteína de seda de araña funcionalizada recombinante.

Membrana basal nanofibrilar imitadora hecha de seda de araña funcionalizada recombinante en insertos de cultivo de tejidos hechos a medida

Cultivo de células normales en sus tres dimensiones contexto representa un método alternativo para estudiar los primeros eventos necesarios para la transformación celular y tumorigénesis. Este método se utiliza para producir los ovarios normales y las células del oviducto para estudiar los eventos tempranos en la formación de cáncer de ovario.

Los hidrogeles de alginato para la cultura del órgano en tres dimensiones de los ovarios y oviductos

Aprende a crear membranas basales biomiméticas ultrafinas y porosas usando polietilenglicol y óxido de zinc para cultivos celulares duales. Este método permite ajustar propiedades mecánicas y bioquímicas para estudiar interacciones celulares en ingeniería de tejidos.

Hidrogeles ultrafino Porated elástico como una membrana del sótano biomiméticos para doble cultura de la célula

Explorar más videos