Un método de cultura alternativa para mantener la hipometilación genómica de células madre embrionarias del ratón usando MEK inhibidor PD0325901 y vitamina C

Describimos en detalle dos protocolos basados en químicos para el cultivo de células madre embrionarias de ratón. Este nuevo método utiliza mecanismos sinérgicos de promover oxidación mediada por Tet (vitamina C) y reprimiendo la síntesis de novo de la 5-METILCITOSINA (por PD0325901) para mantener el hypomethylation de la DNA y pluripotencia de células madre embrionarias de ratón.

El objetivo general de este protocolo es utilizar los compuestos de moléculas pequeñas PD0325901 y la vitamina C para mantener un estado hipometilado y pluripotente en células madre embrionarias de ratón. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las células madre embrionarias de ratón cultivadas con FBS, como la heterogeneridad en la morfología y la deshipermetilación. Por lo tanto, la principal ventaja de esta técnica es que las células madre embrionarias de ratón son capaces de mantener una excelente morfología y el estado hipometilado e indiferenciado.

Después de preparar las placas y los tampones, de acuerdo con el protocolo de texto, precaliente las células madre embrionarias de ratón, el medio de cultivo, la tripsina y el PBS en un baño de agua a 37 grados centígrados. Para pasar las células, aspire el medio de la placa y use dos mililitros de PBS para enjuagar las células dos veces. A continuación, retire el PBS y añada 0,3 mililitros de tripsón EDTA a las células e incline rápidamente el plato para cubrir las células de la solución.

Retire inmediatamente la tripsina e incube la placa a 37 grados centígrados durante un minuto para separar las células. Agregue dos mililitros de medio sérico precalentado para inactivar la tripsina y use una pipeta de cinco mililitros para volver a suspender las colonias celulares 10 veces en una suspensión de una sola célula. Coloque 150 microlitros de la solución celular en un nuevo plato de seis centímetros recubierto de gelatina y complemente con tres mililitros de VCPD0325901 medio recién hecho.

Cultive las células a 37 grados centígrados y cinco por ciento de CO2. Debido a la inestabilidad de Vc, cada 24 horas durante la incubación, retire el medio de cultivo viejo y agregue tres mililitros de medio Vcpd0325901 fresco. Después de alcanzar el 70 al 80 por ciento de confluencia, pase las células y continúe cultivándolas como se acaba de demostrar.

Para llevar a cabo la extracción de ADN, recoja las células con tripsina como se demostró anteriormente y use un kit de purificación de ADN genómico siguiendo las instrucciones del fabricante. Agregue 100 microlitros de agua ultrapura al tubo de ADN y disuelva el ADN pipeteando aproximadamente 15 veces. Luego, use un espectrofotómetro para medir la proporción Od260 a 280 para determinar la concentración y la calidad del ADN.

La concentración de ADN debe ser de unos 500 nonogramas por microlitro. A continuación, digiere cinco microgramos de ADN combinándolo con cinco microlitros de 100 milimolares de clorhidrato de tris PH7,6, dos unidades de fosfatasa intestinal de ternero, una unidad de Dnasa uno y 0,005 unidades de veneno de serpiente, fosfodiesterasa uno. Luego, use agua ultra pura para aumentar el volumen a 50 microlitros.

Incuba la reacción a 37 grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, recoja la muestra por centrifugación a 1.000 x g a temperatura ambiente durante un minuto. A continuación, transfiera la solución a tubos de ultrafiltración y centrifuga las muestras a 13.000xg y 4 grados centígrados durante 30 minutos para eliminar las enzimas de digestión.

Para preparar las muestras para el análisis de 5HMC, transfiera 36 microlitros del filtrado a un nuevo tubo de un mililitro y agregue cuatro microlitros de D35HMC para una concentración final de tres nanomolares. Para el análisis de 5MC, pipete 196 microlitros de agua ultrapura en un nuevo tubo de centrífuga y agrega cuatro microlitros de filtrado debido a la alta densidad de 5MC en el ADN genómico. Transfiera 36 microlitros de la solución diluida de 5MC a un nuevo tubo de centrífuga y agregue cuatro microlitros de D35MC para una concentración final de 50 nanomolares.

Utilice D35HMC y D35MC como estándares internos para calibrar 5HMC y 5MC respectivamente. Después de configurar los parámetros para analizar 5MC y 5HMC en el software UHPLCMS, de acuerdo con el protocolo de texto, establezca los parámetros para QQQMSMS haciendo clic en MS QQQ. En Tiempo de parada, elija No limit/As Pump.

Para la fuente de iones, elija ESI. Para el filtrado de tiempo, marque Ancho de pico y escriba 0,07 minutos. Para configurar los segmentos de tiempo, en Hora de inicio, elija cero.

Para establecer el modo de exploración en MRM para analizar la alusión de la columna, en Tipo de exploración, elija MRM. En Div Value, elija To MS. Para Delta EMV plus, escriba 200 y para Delta EMV menos, ingrese cero. Cree los parámetros para supervisar las transiciones haciendo clic primero en MSQQQ una adquisición.

Para establecer segmentos de exploración, en Permanencia, escriba 90. Para establecer los voltajes de fragmento para el Fragmentor, ingrese 90. En Energía de colisión, introduzca cinco.

Para el voltaje del acelerador de celdas, ingrese cuatro. Para establecer el modo de iones positivos, en Polaridad, elija positivo. Para llevar a cabo la separación UHPLC de mononucleósidos, prepare las soluciones a y b para la alusión de 5MC y citosina mezclando 500 mililitros de agua ultrapura con 500 microlitros de ácido fórmico para la solución a.

Luego mida 500 mililitros de metanol al 100 por ciento y la solución b. Mezcle la solución a y la solución b en una relación de volumen a volumen de 95 a cinco como la fase móvil para eluir 5MC y C. Luego ajuste el caudal a 0.25 mililitros por minuto. Separe 5HMC utilizando una alusión de gradiente optimizada.

A continuación, ajuste el caudal a 0,25 mililitros por minuto. Supervise las transiciones para 5MC, D35MC, DC, 5HMC y D35HMC. Ajuste los voltajes capilares a 3, 500 voltios.

A continuación, ajuste el volumen de inyección a 5 microlitros y analice cada muestra tres veces. Emplee las curvas estándar correspondientes para evaluar la cantidad de 5MC y 5HMC de acuerdo con el protocolo de texto. Como se ha visto en este análisis del ADN genómico en células madre embrionarias de ratón mediante UHPLC MSMS, el tratamiento con VcPD0325901 dio lugar a una disminución más rápida de la metilación del ADN y alcanzó cinco niveles estables de MC después de cinco días, mientras que el tratamiento con Vc 2i dio lugar a un nivel comparable en el día 11.

Este gráfico muestra que el tratamiento con Vc aumentó drásticamente la frecuencia de 5HMC después de un día y, a partir de entonces, los niveles de 5HMC disminuyeron gradualmente debido a una reducción progresiva en el sustrato de 5MC. El análisis de Western blot mostró que Prdm14 estaba significativamente elevado, mientras que Dnmt3b y su cofactor, Dnmt3l, estaban considerablemente regulados a la baja cuando las células se retiraban con PD0325901, lo que indica la acción de PD0325901 en la eliminación de 5MC. En este ensayo de fosfatasa alcalina, todas las células madre embrionarias de ratón se tiñeron de púrpura con una morfología en forma de bola cuando se cultivaron durante 26 días en VcPD032590, lo que indica un estado indiferenciado.

Por el contrario, las células cultivadas en medio que contenía solo FBS parecían de color claro con una dispersión parcial que indicaba una diferenciación parcial. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que el FBS debe ser preseleccionado.

Además, evite pipetear en exceso las células a través del conducto y cambiar el medio de cultivo VcPDO325901 a diario. Tras este desarrollo, esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo del cultivo in vitro de células madre embrionarias de ratón exploren el desarrollo y los procesos de los embriones in vitro y las células generadas de relevancia médica para la medicina regenerativa. Después de ver este video, debería tener una mayor comprensión de cómo mantener la morfología del crecimiento y el estado hipermetilado y potente plural para las células madre embrionarias de ratón mediante el uso de dos pequeños componentes moleculares, el inhibidor de MEK, PD0325901.

No olvide que trabajar con Trisol, DMS o PMS y el DTT puede ser extremadamente peligroso y las precauciones como el uso de guantes, una mascarilla y las gafas siempre deben tomarse mientras se realiza este procedimiento.