Name: Flujo de trabajo basado en la combinación de trazador isotópico experimentos para investigar el metabolismo microbiano de múltiples fuentes de nutrientes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Aprende a investigar el metabolismo microbiano de múltiples fuentes de nutrientes mediante experimentos con trazadores isotópicos. Este método permite determinar el destino de los nutrientes consumidos y el origen metabólico de los compuestos sintetizados por levaduras.

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Agradecemos a Jean-Roch Mouret, Sylvie Dequin y Jean-Marie Sabalyrolles para contribuir a la concepción del sistema de fermentación asistida por Martine Pradal, Nicolas Bouvier y Pascale Brial para su soporte técnico. La financiación para este proyecto fue proporcionado por el Ministère de l ' Education Nationale, de la Recherche et de la Technologie.

<ol><li>Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifteen+years+of+large+scale+metabolic+modeling+of+yeast%3A+developments+and+impacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts.</a> Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).</li>
<li>Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+identification+and+flux+quantification+in+the+central+metabolism+of+Saccharomyces+cerevisiae+under+different+conditions+of+glucose+repression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression.</a> J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).</li>
<li>Wiechert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">13C metabolic flux analysis.</a> Metab Eng. 3, 195-206 (2001).</li>
<li>Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+metabolic+flux+analysis+based+on+gas+chromatography-mass+spectrometry+derived+13C+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints.</a> Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).</li>
<li>Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analytic+and+systematic+framework+for+estimating+metabolic+flux+ratios+from+13C+tracer+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments.</a> BMC Bioinformatics. 9, 266(2008).</li>
<li>Zamboni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C+metabolic+flux+analysis+in+complex+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">13C metabolic flux analysis in complex systems.</a> Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).</li>
<li>Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+plant+metabolic+networks+from+steady-state+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis.</a> Biochimie. 91, 697-702 (2009).</li>
<li>Quek, L. -E., Dietmair, S., Krömer, J. O., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+flux+analysis+in+mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">Metabolic flux analysis in mammalian cell culture.</a> Metab Eng. 12, 161-171 (2010).</li>
<li>Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/279893606_Uptake_of_amino_acids_during_beer_production_The_concept_of_a_critical_time_value">Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value.</a> J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).</li>
<li>Magasanik, B., Kaiser, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+regulation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene. 290, 1-18 (2002).</li>
<li>Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+amino+acid%2C+nucleotide%2C+and+phosphate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190, 885-929 (2012).</li>
<li>Cooper, T. G. Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCooper%2C+TG+%22The+molecular+biology+of+the+yeast+Saccharomyces%3A+Metabolism+and+gene+expression%22">The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression</a>. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 39-99 (1982).</li>
<li>Jones, E. W., Fink, G. R. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJones%2C+EW+%22The+molecular+biology+of+the+yeast+Saccharomyces%3A+Metabolism+and+gene+expression%22">The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression</a>. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 182-299 (1982).</li>
<li>Hazelwood, L. A., Daran, J. -M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ehrlich+pathway+for+fusel+alcohol+production%3A+a+century+of+research+on+Saccharomyces+cerevisiae+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism.</a> Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).</li>
<li>Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0922338X90900574">Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions.</a> J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).</li>
<li>Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+reconstruction+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+metabolic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network.</a> Genome Res. 13, 244-253 (2003).</li>
<li>Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IsoCor%3A+correcting+MS+data+in+isotope+labeling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments.</a> Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).</li>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Cuantificación de la partición de los compuestos a través de redes metabólicas experimentos de trazador isotópico es un enfoque prometedor para entender el funcionamiento del metabolismo microbiano. Esta metodología, mientras que aplica con éxito con uno o dos sustratos etiquetados, no puede ser implementada actualmente para estudiar el metabolismo de varias fuentes usando múltiples etiquetados isótopos elementales (es decir, más de dos substratos). De hecho, las técnicas analíticas disponibles permiten la deter...

Entender cómo funciona el metabolismo microbiano es una cuestión clave para el diseño de estrategias eficientes para mejorar los procesos de fermentación y modulan la producción de compuestos fermentativos. Avances en genómica y genómica funcional en estas dos últimas décadas contribuidas en gran medida a ampliar los conocimientos de la topología de redes metabólicas en muchos microorganismos. Acceso a esta información condujo al desarrollo de enfoques que buscan un panorama completo de la función celular1. Estas metodologías dependen a menudo de una interpretación basada en modelos de parámetros mensurables. Estos datos experimentales incluyen, por un lado, las tasas de captación y producción de metabolitos y, por otro lado, experimentos cuantitativo información intracelular que se obtiene del trazalíneas de isótopos. Estos datos proporcionan información esencial para la deducción de la actividad en vivo de las diferentes vías en una red metabólica definida2,3,4. Actualmente, las técnicas analíticas disponibles sólo permiten la detección precisa de etiquetado patrones de moléculas cuando se utiliza un solo elemento isótopo y posiblemente al conjunto de etiquetado con dos elementos isotópicos. Por otra parte, en la mayoría de las condiciones de crecimiento, la fuente de carbono sólo se compone de uno o dos compuestos. En consecuencia, los enfoques basados en marcadores isotópicos de C 13de substratos de carbón ampliamente y con éxito se aplicaron para desarrollar una comprensión completa de carbono red metabólica operaciones5,6,7 ,8.
Por el contrario, en muchos ambientes naturales e industriales, el recurso de nitrógeno disponible que apoya crecimiento microbiano se compone a menudo de una amplia gama de moléculas. Por ejemplo, durante la fermentación del vino o la cerveza, nitrógeno se presenta como una mezcla de 18 aminoácidos y amonio en concentraciones variables9. Este conjunto de compuestos de N que son accesibles para el anabolismo hace estas condiciones medios complejos considerablemente diferentes de las utilizadas para estudios fisiológicos, como este último se logra mediante una fuente única de nitrógeno, por lo general amonio.
En general, internalizado nitrógeno compuestos pueden ser incorporados en las proteínas directamente o catabolizados. La estructura de la red del metabolismo de nitrógeno en muchos microorganismos, incluyendo la levadura Saccharomyces cerevisiae, es muy compleja según la diversidad de sustratos. Esquemáticamente, este sistema se basa en la combinación del núcleo central del metabolismo de nitrógeno que cataliza la interconversión de glutamina, glutamato y el α-cetoglutarato10,11, con las aminotransferasas y Desaminasas. A través de esta red, se reúnen grupos de Amina de amonio o de otros aminoácidos y α-ceto ácidos liberados. Estos productos intermedios son también sintetizado a carbón central metabolismo (CCM)12,13. Este gran número de reacciones ramificadas y productos intermedios, involucrados en el catabolismo de las fuentes de nitrógeno exógeno y el anabolismo de aminoácidos proteinogenic, cumple con los requisitos anabólicos de las células. También resultados de la actividad a través de estas diferentes rutas interconectadas en la excreción de metabolitos. En particular, α-ceto ácidos pueden ser redirigidos a través de la vía de Ehrlich a producir alcoholes superiores y sus derivados de éster de acetato de14, que son contribuidores esenciales a los perfiles sensoriales de los productos. Posteriormente, cómo funciona el metabolismo del nitrógeno juega un papel clave en la producción de biomasa y la formación de moléculas volátiles (aroma).
Las reacciones, las enzimas y genes implicados en el metabolismo del nitrógeno son ampliamente descritos en la literatura. Sin embargo, la cuestión de la distribución de múltiples fuentes de nitrógeno a través de una red metabólica ha no aún abordada. Hay dos razones principales que explican esta falta de información. En primer lugar, dada la importante complejidad de la red de metabolismo del nitrógeno, una gran cantidad de datos cuantitativos se requiere para una comprensión completa de su funcionamiento que no estaba disponible hasta ahora. Segundo, muchas limitaciones experimentales y limitaciones de los métodos analíticos impidieron la aplicación de métodos que fueron utilizados previamente para la aclaración de la función CCM.
Para superar estos problemas, decidimos desarrollar un enfoque de nivel de sistema que se basa en la reconciliación de los datos de una serie de experimentos de trazador isotópico. El flujo de trabajo incluye: -Una serie de fermentaciones realizadas bajo las mismas condiciones ambientales, mientras que otra fuente nutrientes seleccionada (sustrato) se etiqueta cada vez. -Una combinación de procedimientos analíticos (HPLC, GC-MS) para una determinación precisa, en diferentes etapas de la fermentación, de la concentración residual de sustrato marcado y la concentración y el enriquecimiento isotópico de compuestos que se derivan de el catabolismo de la molécula marcada, incluida la derivada de la biomasa. -Un cálculo del equilibrio isotópico y masa para cada uno consume molécula marcada y un posterior análisis integrado del conjunto de datos para obtener una visión global de la gestión de múltiples fuentes de nutrientes por los microorganismos a través de la determinación de coeficientes de flujo .
Para aplicar esta metodología, debe prestarse atención al comportamiento reproducible del microorganismo y la tensión entre culturas. Además, deben tomarse muestras de diferentes culturas durante el progreso mismo de fermentación bien definidos. En el trabajo experimental en este manuscrito, un sistema de robótica se utiliza para el monitoreo en línea de las fermentaciones para tener en cuenta estas limitaciones.
Además, es esencial elegir un conjunto de sustratos marcados (compuesto, naturaleza y posición de las etiquetas) que es apropiado para abordar el problema científico del estudio. Aquí, arginina, glutamina y 15marcado con el N amonio fueron seleccionados como las tres fuentes de nitrógeno más importantes encontradas en el jugo de uva. Esto permitió evaluar el patrón de redistribución del nitrógeno de compuestos consumidos a los aminoácidos proteinogenic. También se intentó investigar el destino de la columna vertebral de carbono de los aminoácidos consumidos y su contribución a la producción de moléculas volátiles. Para cumplir con este objetivo, uniformemente leucina marcada con C 13, isoleucina, treonina y valina fueron incluidos en el estudio como aminoácidos que se derivan de importantes intermediarios de la vía de los Ehrlich.
En general, exploramos cuantitativamente cómo levadura gestiona un recurso complejo nitrógeno por redistribución de fuentes exógenas de nitrógeno para cumplir con sus requerimientos anabólicos a través Fermentación mientras que además quita el exceso de precursores de carbono como moléculas volátiles. El procedimiento experimental reportado en este trabajo puede aplicarse para investigar otras múltiples fuentes de nutrientes utilizadas por cualquier otro microorganismo. Parece ser un enfoque apropiado para el análisis del impacto de la genética o las condiciones ambientales en el comportamiento metabólico de los microorganismos.

<table><tbody><tr><td>D-Glucosa</td><td>PanReac</td><td>141341.0416</td><td></td></tr><tr><td>D-Fructosa</td><td>PanReac</td><td>142728.0416</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ácido málico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0875</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico monohidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7129</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0772</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4514</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de manganeso monohidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de zinc heptahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de cobre (II) pentahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7631</td><td></td></tr><tr><td>Yodo potásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4286</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de cobalto (II) hexahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3169</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>Heptamolibdato de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7302</td><td></td></tr><tr><td>Mioinositol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>Ácido D-pantoténico sal hemicálcica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>21210</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina, clorhidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4625</td><td></td></tr><tr><td>Ácido nicotínico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4126</td><td></td></tr><tr><td>Piridoxina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5669</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Ergost&eacute; rol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6510</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>VWR Chemicals</td><td>101074F</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de hierro (III) hexahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-aspártico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-glutámico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Lisina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-Fenilalanina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>L-Prolina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-Serina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-treonina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-triptófano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-tirosina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-valina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>13C5-L-valina</td><td>Eurisotop</td><td>CLM-2249-H-0.25</td><td></td></tr><tr><td>13C6-L-Leucina</td><td>Eurisotop</td><td>CLM-2262-H-0.25</td><td></td></tr><tr><td>15N-Cloruro de amonio</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-467-1</td><td></td></tr><tr><td>ALPHA-15N-L-Glutamina</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-1016-1</td><td></td></tr><tr><td>U-15N4-L-Arginina</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-396-PK</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>270989</tr><tr><td>Propanaato de etilo</td><td>Sigma Aldrich 112305</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-metilpropanoato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>246085</td><td></td></tr><tr><td>Butanoato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E15701</td><td></td></tr><tr><td>2-metilbutanoato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>306886</td><td></td></tr><tr><td>3-metilbutanoato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8.08541.0250</td><td></td></tr><tr><td>Hexanoato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>148962</td><td></td></tr><tr><td>Octanoato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244910</td><td></td></tr><tr><td>Decanoato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W243205</td><td></td></tr><tr><td>Dodecanoato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244112</td><td></td></tr><tr><td>Lactato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244015</td><td></td></tr><tr><td>Succinato de dietilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>W237701</tr><tr><td>Acetato de 2-metilpropilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W217514</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de 2-metilbutilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W364401</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de 3-metilbutilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>287725</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de 2-feniletil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>290580</td><td></td></tr><tr><td>2-metilpropanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>294829</td><td></td></tr><tr><td>2- metilbutanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>133051</td><td></td></tr><tr><td>3-metilbutanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>309435</td><td></td></tr><tr><td>Hexanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>128570</td><td></td></tr><tr><td>2-feniletanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77861</td><td></td></tr><tr><td>Ácido propanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94425</td><td></td></tr><tr><td>Ácido butanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>19215</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 2-metilpropanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>58360</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 2-metilbutanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>193070</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 3-metilbutanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W310212</td><td></td></tr><tr><td>Ácido hexanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>153745</td><td></td></tr><tr><td>Ácido octanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W279900</td><td></td></tr><tr><td>Ácido decanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W236403</td><td></td></tr><tr><td>Ácido dodecanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L556</td><td></td></tr><tr><td>Fermentador 1L</td><td>Legallais</td><td>AT1357</td><td>Fermentador hecho a mano para la fermentación</td></tr><tr><td>Sistema de filtración al vacío desechable</td><td>Dominique Deutscher</td><td>029311</td><td></td></tr><tr><td>Fermentadores (250 ml)</td><td>Legallais</td><td>AT1352</td><td>Fermentador hecho a mano para la fermentación</td></tr><tr><td>Tubos estériles</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Cerraduras de fermentación</td><td>Legallais</td><td>AT1356</td><td>Cerraduras de fermetación hechas a mano para la fermentación Extracto de</td></tr> levadura <tr><td>BactoYeast</td><td>Becton, Dickinson and Company 212750</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BactoPeptone</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de incubadora</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contador de partículas</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605697</td><td>Multisizer 3</td></tr><tr><td>Contracentrífuga</td><td>Jouan</td><td></td><td>GR412</td></tr><tr><td>Plate Butler Sistema robótico</td><td>Servicios de laboratorio BV</td><td>PF0X-MA</td><td>Placa de instrumentos automáticos</td></tr><tr><td>Software Butler Servicios</td><td>de laboratorio BV</td><td></td><td>Software de monitor de robot</td></tr><tr><td>RobView</td><td></td><td></td><td>Software de cálculo de desarrollo propio</td></tr><tr><td>My SQL</td><td></td><td></td><td>Base de datos de fuentes internacionales</td></tr><tr><td>Cimarec i Telesystem Agitadores multipunto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50088009</td><td>String Drive 60</td></tr><tr><td>BenchBlotter balancín de plataforma</td><td>Dutscher</td><td>60903</td><td></td></tr><tr><td>Kit enzimático de amoníaco</td><td>R-Biopharm AG</td><td>5390</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas de espectrofotómetro</td><td>VWR</td><td>634-0678</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UviLine 9400</td><td>Secomam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos patrones fisiológicos - ácidos y neutros</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6407</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos patrones fisiológicos - básicos</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6282</td><td></td></tr><tr><td>Tampones de litio de citrato - Reactivo de ultra ninhidrina</td><td>Biochrom</td><td>BC80-6000-06</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfosalicílico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2130</td><td></td></tr><tr><td>Norleucina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N1398</td><td></td></tr><tr><td>Biochrom 30 AAA</td><td>Biochrom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZChrom Elite</td><td>Biochrom</td><td></td><td>Software de control de instrumentos y análisis de datos</td></tr><tr><td>Resina Ultropac 8 Litio</td><td>Biochrom</td><td>BC80-6002-47</td><td>Litio Filtro de columna fisiológico de alta resolución</td></tr><tr><td>Millex GV</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGVX13NL</td><td>Millex GV 13mm (tamaño de poro 0,22 y micro; m)</td></tr> <tr><td>Filtro de membrana PALL</td><td>VWR</td><td>514-4157</td><td>Supor-450 47mm 0.45&micro; m</td></tr><tr><td>Bomba de vacío Millivac Mini</td><td>Millipore</td><td>XF5423050</td><td></td></tr><tr><td>Plato de pesaje liso de aluminio 70mm</td><td>VWR</td><td>611-1380</td><td></td></tr><tr><td>Balanza de precisión</td><td>Mettler</td><td></td><td>Especificaciones AE163</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido secado</td><td>Merck</td><td>1029310161</td><td>(máx. 0,025% H2O) SeccoSolv</td></tr><tr><td>Horno de combustión</td><td>Legallais</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas Pierce BCA</td><td>Interchim UP40840A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Fluka</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico fumante 37% Emsure</td><td>Merck</td><td>1003171000</td><td>grado ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Tampón de acetato de litio</td><td>Biochrom</td><td>80-2038-10</td><td></td></tr><tr><td>Solución comercial de aminoácidos hidrolizados</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AAS18</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina sulfona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0876</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-cisteico monohidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30170</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultivo de vidrio Pyrex</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z653586</td><td></td></tr><tr><td>Piridina</td><td>Acros Organics</td><td>131780500</td><td>99% Etilo</td></tr><tr><td>Cloroformiato</td> Extrapuro <td>Sigma Aldrich</td><td>23131</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32222</td><td></td></tr><tr><td>Viales Sigma</td><td>Aldrich</td><td>854165</td><td></td></tr><tr><td>Microinsertos para viales de 1,5 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SU860066</td><td></td></tr><tr><td>GC/MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>5890 GC/5973 MS</td><td></td></tr><tr><td>Chemstation</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Software de control de instrumentos y análisis de datos</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td>Chromasolv, para HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td>ChromasolvPlus, para HPLC</td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformamida dimetilacetal</td><td>Sigma Aldrich 394963</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSTFA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>33024</td><td></td></tr><tr><td>DB-17MS columna</td><td>Agilent Technologies</td><td>122-4731</td><td>30m * 0.25mm * 0.15&micro; m</td></tr><tr><td>Sulfato de sodio, anhidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238597</td><td></td></tr><tr><td>Nitrógeno técnico</td><td>Productos del aire</td><td>14629</td><td></td></tr><tr><td>Zebron ZB-WAX columna</td><td>Phenomenex</td><td>7HG-G007-11</td><td>30m * 0.25mm * 0.25&micro; m</td></tr><tr><td>Helio BIP</td><td>Air products</td><td>26699</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio Pipetas Pasteur</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td></td></tr></tbody></table>

flujo de trabajo basado en la combinación de trazador isotópico experimentos para investigar el metabolismo microbiano de múltiples fuentes de nutrientes

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

Estudios en el campo de la microbiología se basan en la aplicación de una amplia gama de metodologías. En particular, el desarrollo de métodos adecuados substancialmente contribuye a proporcionar amplios conocimientos sobre el metabolismo de los microorganismos crecen en medios químicamente definidos que contiene fuentes de carbono y nitrógeno único. En cambio, la gestión a través de múltiples fuentes de nutrientes, a pesar de su amplia presencia en ambientes naturales o industriales, permanece prácticamente inexplorada. Esta situación se debe principalmente a la falta de metodologías adecuadas, que dificulta las investigaciones.
Divulgamos una estrategia experimental cuantitativa y comprensivo explorar cómo metabolismo funciona cuando un alimento se suministra como una mezcla de diferentes moléculas, es decir, un recurso complejo. Aquí, Describimos su aplicación para la evaluación de la partición de múltiples fuentes de nitrógeno a través de la red metabólica de la levadura. El flujo de trabajo combina la información obtenida durante experimentos de trazalíneas de isótopos estables usando las 13C - o sustratos marcados con N 15. Primero consiste en fermentaciones paralelas y reproducibles en el mismo medio, que incluye una mezcla de moléculas que contiene N; sin embargo, una fuente de nitrógeno seleccionado se etiqueta cada vez. Se implementa una combinación de procedimientos analíticos (HPLC, GC-MS) para evaluar los patrones Etiquetadoras de compuestos específicos y cuantificar el consumo y la recuperación de sustratos en otros metabolitos. Un análisis integrado del conjunto completo de datos proporciona una visión general del destino de sustratos consumidos dentro de las células. Este enfoque requiere un protocolo preciso para la recolección de las muestras – facilitado por un sistema asistido por robot para monitoreo en línea de fermentaciones- y la realización de numerosos análisis desperdiciador de tiempo. A pesar de estas limitaciones, permitió entender por primera vez, la partición de múltiples fuentes de nitrógeno a través de la red metabólica de la levadura. Había aclarada la redistribución del nitrógeno de las fuentes más abundantes hacia otros compuestos de N y determinar el origen metabólico de proteinogenic aminoácidos y moléculas volátiles.

Figura 3 presenta un diagrama esquemático del flujo de trabajo que llevó a cabo para investigar la gestión de las múltiples fuentes de nitrógeno que se encuentran durante la fermentación la levadura. Para diferentes puntos de muestreo, las características de los parámetros biológicos, crecimiento, patrones de consumo de nitrógeno y el perfil de aminoácidos proteinogenic-muestran una alta reproducibilidad entre las fermentaciones (figur...

Este protocolo describe un procedimiento experimental cuantitativa y comprensivo investigar el metabolismo de múltiples fuentes de nutrientes. Este flujo de trabajo, basado en una combinación de experimentos de trazador isotópico y de un procedimiento analítico permite el destino de los nutrientes consumidos y el origen metabólico de moléculas sintetizado por microorganismos a determinar.

Flujo de trabajo basado en la combinación de trazador isotópico experimentos para investigar el metabolismo microbiano de múltiples fuentes de nutrientes

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...

El objetivo general de este procedimiento es investigar cuantitativamente el metabolismo de múltiples fuentes de nutrientes utilizando sustratos marcados. Este flujo de trabajo permite determinar el destino de los nutrientes consumidos y el origen metabólico de los compuestos sintetizados por las levaduras. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del metabolismo microbiano, como cómo funciona todo el metabolismo en función de las condiciones ambientales.La principal ventaja de esta técnica es que permite la elucidación y cuantificación de la proteína de distribución de nutrientes a partir de múltiples fuentes. Este método se utilizó para investigar el metabolismo del nitrógeno de la levadura, pero también se puede aplicar a otros metabolismos y microorganismos. La clave del éxito de este experimento reside en la reproducibilidad de las fermentaciones.Los usuarios deben prestar especial atención a recoger las células en la misma etapa fisiológica definida. La demostración del procedimiento estará a cargo de Christian Picou, de nuestro equipo técnico, Pauline Seguinot, estudiante de doctorado del laboratorio, y Stephanie Rollero, becaria postdoctoral. En un a

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Perfiles de isótopos estables de análisis de cromatografía de gases espectrometría de masa de flujo de intermediario metabólico se describe en el...

Perfiles de isótopos estables de flujo intermediarios metabólicos en fase de desarrollo y de Adultos Caenorhabditis elegans</em

13 C-etiquetado de isótopos es una técnica útil para determinar el metabolismo de la célula central para varios tipos de microorganismos. Después las células han sido cultivadas con un sustrato marcado, GC-MS medición puede revelar las vías metabólicas funcional basada en los patrones de etiquetado único en proteinogenic aminoácidos.

Confirmación vía metabólica y el descubrimiento a través de 13 C-etiquetado de proteinogenic Aminoácidos

La comunidad bacteriana activo asociado con el intestino de Spodoptera littoralis, se determinó por isótopos estables-palpador (SIP) acoplado a la pirosecuenciación. Utilizando esta metodología, se realizó la identificación de las especies de bacterias metabólicamente activas dentro de la comunidad con alta resolución y precisión.

La identificación de bacterias metabólicamente activas en el intestino de la Generalista<em&gt; Spodoptera littoralis</em&gt; Vía ADN isótopos estables Uso<sup&gt; 13</sup&gt; C-glucosa

materia orgánica disuelta proporciona una fuente importante de energía y nutrientes de flujo de los ecosistemas. Aquí se demuestra un método basado en el campo de manipular la piscina ambiente de la materia orgánica disuelta en situ a través de impulsos de nutrientes fácilmente reproducibles.

La comprensión de materia orgánica disuelta Biogeoquímica través<em&gt; In Situ</em&gt; Nutrientes Las manipulaciones en la corriente de los ecosistemas

Este artículo describe un método para estudiar el metabolismo celular en comunidades complejas de múltiples tipos de células, utilizando una combinación de rastreo de isótopos estables, clasificación de células para aislar tipos específicos de células y espectrometría de masas.

Un método para medir el metabolismo en muestras ordenadas subpoblaciones de Comunidades celulares complejas utilizando isótopos estables de Búsquedas

Este artículo describe protocolos detallados para la fabricación de ecosistema de dispositivos (EcoFABs) que permiten a los estudios de las plantas y las interacciones planta-microorganismo en condiciones muy controladas de laboratorio.

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Aquí se presenta un protocolo para una técnica monocelular basada en microscopía de epifluorescencia para cuantificar las tasas de pastoreo en eucariotas depredadores acuáticos con alta precisión y resolución taxonómica.

Bacterias etiquetadas fluorescentes como un rastreador para revelar nuevos caminos de flujo de carbono orgánico en ecosistemas acuáticos

Se demuestra un nuevo método de preparación de muestras para el análisis de macrocolonias bacterianas basadas en agar mediante espectrometría de masas de imágenes de ionización / desorción láser asistida por matriz.

Investigación de la cooperación microbiana a través del análisis de espectrometría de masas de imágenes de colonias bacterianas cultivadas en agar y en tejidos durante la infección

Aquí, presentamos un protocolo que utiliza la hibridación óptica fototérmica de fluorescencia infrarroja in situ (OPTIR-FISH), también conocida como FOL fototérmico de infrarrojo medio (MIP-FISH), para identificar células individuales y comprender su metabolismo. Esta metodología se puede aplicar ampliamente para diversas aplicaciones, incluido el mapeo del metabolismo celular con resolución de una sola célula.

Hibridación óptica fototérmica de fluorescencia infrarroja in situ (OPTIR-FISH)

Aprende a investigar el metabolismo microbiano de múltiples fuentes de nutrientes mediante experimentos con trazadores isotópicos. Este método permite determinar el destino de los nutrientes consumidos y el origen metabólico de los compuestos sintetizados por levaduras.

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