Flujo de trabajo basado en la combinación de trazador isotópico experimentos para investigar el metabolismo microbiano de múltiples fuentes de nutrientes

El objetivo general de este procedimiento es investigar cuantitativamente el metabolismo de múltiples fuentes de nutrientes utilizando sustratos marcados. Este flujo de trabajo permite determinar el destino de los nutrientes consumidos y el origen metabólico de los compuestos sintetizados por las levaduras. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del metabolismo microbiano, como cómo funciona todo el metabolismo en función de las condiciones ambientales.

La principal ventaja de esta técnica es que permite la elucidación y cuantificación de la proteína de distribución de nutrientes a partir de múltiples fuentes. Este método se utilizó para investigar el metabolismo del nitrógeno de la levadura, pero también se puede aplicar a otros metabolismos y microorganismos. La clave del éxito de este experimento reside en la reproducibilidad de las fermentaciones.

Los usuarios deben prestar especial atención a recoger las células en la misma etapa fisiológica definida. La demostración del procedimiento estará a cargo de Christian Picou, de nuestro equipo técnico, Pauline Seguinot, estudiante de doctorado del laboratorio, y Stephanie Rollero, becaria postdoctoral. En un autoclave, pasteurice cada medio sintético preparado para cada fuente de nitrógeno en un matraz de un litro que contenga una barra agitadora magnética.

Disuelva la cantidad adecuada de molécula marcada para alcanzar la concentración final deseada en el medio. Esterilice el medio utilizando un sistema de filtración al vacío desechable. Utilizando un cilindro de medición estéril, divida el medio entre dos fermentadores preesterilizados que contengan una barra de agitación magnética y estén equipados con bloqueos de fermentación para evitar la entrada de oxígeno pero permitir la liberación de dióxido de carbono.

Después de cultivar una cepa de cerevisiae en medio YPD, recoja una alícuota de precultivo bajo flujo laminar y cuantifique la población celular utilizando un contador electrónico de partículas que esté equipado con una apertura de 100 micrómetros. Después de centrifugar el precultivo, suspender el pellet en un volumen adecuado de agua estéril para obtener una concentración final de 2,5 veces 10 a la 9ª célula por mililitro. Luego, inocular cada fermentador con un mililitro de la suspensión celular.

Después de esto, prepare una plataforma de fermentación instalando los fermentadores en las guías de soporte que están correctamente colocadas en las placas de agitación de 21 posiciones y ajuste la tasa de agitación a 270 RPM. Para iniciar el seguimiento en línea de cada fermentación, inicie la aplicación de control del robot, haga clic en el botón Iniciar ensayo y seleccione el volumen de fermentación a realizar. Para asegurarse de que la interfaz mostrada permita la indicación del número y la posición de los fermentadores en la plataforma, haga clic con el botón derecho del ratón en la ubicación de la ranura y elija Desactivarlo para desactivar el seguimiento de las posiciones vacías.

Para inicializar el software de cálculo, haga clic en el botón Inicializador y valide con OK. A continuación, haga clic en el botón Inicio de la aplicación de control del robot para iniciar las adquisiciones de peso. A continuación, centrifugar dos muestras de seis mililitros tomadas de los fermentadores a 2.000 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Cuando termine, transfiera cada sobrenadante congelado a dos tubos y guárdelo a menos 80 grados centígrados.

Lave cada pellet dos veces con cinco mililitros de agua destilada y guárdelo a menos 80 grados centígrados para medir el enriquecimiento isotópico. Añadir 200 microlitros de una solución de ácido sulfosalicílico al 25% que contenga 2,5 milimolares de norleucina como patrón interno a 800 microlitros de muestra para eliminar moléculas de alto peso molecular. Después de la incubación y centrifugación, filtre la mezcla a través de una membrana de nitrocelulosa del tamaño de un poro de 0,22 micrómetros y coloque la muestra en un sistema de análisis de aminoácidos.

En el programa o software del sistema de análisis, haga clic en el botón Ejecutar para comenzar los análisis de cromatografía líquida con el analizador equipado con una columna de intercambio catiónico. A continuación, prepare un extracto oxidado suspendiendo un pellet de células etiquetadas previamente preparado en 200 microlitros de ácido performático. Después de incubar durante cuatro horas a cuatro grados centígrados, detenga la reacción agregando 33,6 miligramos de sulfato de sodio.

Agregue 800 microlitros de ácido clorhídrico normal al extracto oxidado e incube la muestra en un tubo de vidrio hermético durante 16 horas a 110 grados Celsius en un horno de calor seco. Después de dejar que la muestra se enfríe a temperatura ambiente, agregue 200 microlitros de neuroleucina de 2,5 milimolares y elimine el gas cloruro de hidrógeno con un chorro de nitrógeno. Lave el extracto seco dos veces con 800 microlitros de agua destilada y luego 800 microlitros de etanol.

Luego, agregue 800 microlitros de tampón de acetato de litio de 200 milimolares al extracto. Determinar las concentraciones relativas de aminoácidos dentro de las proteínas de la muestra utilizando el método cromatográfico descrito anteriormente. Hidrolice un gránulo de celda marcada agregando 1,2 mililitros de ácido clorhídrico de seis molares e incubando la muestra durante 16 horas a 105 grados Celsius en un tubo de vidrio herméticamente cerrado en un horno de calor seco.

Después de dejar que la muestra se enfríe a temperatura ambiente, agregue 1,2 mililitros de agua destilada. Después de la centrifugación para eliminar los desechos celulares, distribuya el sobrenadante en seis fracciones de 400 microlitros en tubos de vidrio abiertos. Seque las fracciones en el horno de calor seco a 105 grados centígrados durante cuatro o cinco horas hasta que alcancen la consistencia de almíbar.

Durante la hidrólisis de la biomasa, seque la fracción hasta obtener la consistencia de un jarabe controlando frecuentemente el ácido de operación. Para la derivatización de ECF, disuelva el hidrolizado seco enfriado en 200 microlitros de ácido clorhídrico de 20 milimolares y 133 microlitros de una mezcla de uno a cuatro de piridina y etanol. Añadir 50 microlitros de cloroformiato de etilo para derivatizar los aminoácidos.

Una vez que se haya liberado el dióxido de carbono, transfiera la mezcla a tubos de centrífuga que contengan 500 microlitros de diclorometano para extraer los compuestos derivatizados. Agite las muestras durante 10 segundos. Después de centrifugar durante cuatro minutos a 10.000 veces G, recoja la fase orgánica inferior de cada muestra con una pipeta Pasteur y transfiérala a un vial de muestreador automático de GC que contiene un inserto de vidrio cónico para que cada muestra pueda inyectarse directamente en el instrumento GCMS.

Los reactivos de derivatización de HPLC se utilizan para el procedimiento ECF. Cambie con frecuencia los reactivos ECF. Para la derivatización de DMF-DMA, disuelva el hidrolizado seco en 50 microlitros de metanol y 200 microlitros de acetonitrilo.

Añadir 300 microlitros de DMF-DMA y vorticear la muestra. A continuación, transfiera la muestra a un vial de muestreador automático de GC que contenga un inserto de vidrio cónico. Para la derivatización de BSTFA, suspender el hidrolizado en 200 microlitros de acetonitrilo.

Agregue 200 microlitros de BSTFA a la muestra y cierre herméticamente el tubo de vidrio. Después de la incubación durante cuatro horas a 135 grados centígrados, transfiera el extracto enfriado directamente a un vial de muestreador automático de GC que contiene un inserto de vidrio cónico. Ahora, analice las muestras con un cromatógrafo de gases equipado con un inyector automuestreador y acoplado a un espectrómetro de masas.

Haga clic en Instrumento en el menú del software de la computadora. En la pestaña Secuencia, haga clic en Editar tabla de registro de muestra para crear una lista de muestras y haga clic en Ejecutar y Ejecutar secuencia para iniciar las inyecciones. Una vez completados los análisis, registre un grupo de intensidades para cada aminoácido que corresponda a sus diferentes isótopos de masa.

Agregue 10 microlitros de los patrones internos deuterados apropiados a cinco mililitros de sobrenadante en un tubo de vidrio de 15 mililitros. Agregue un mililitro de diclorometano, cierre bien el tubo y agite la muestra en una plataforma oscilante durante 20 minutos. Después de la centrifugación, recoja la fase orgánica inferior en un tubo de vidrio de 15 mililitros.

Después de repetir la extracción de diclorometano, seque el extracto orgánico sobre 500 miligramos de sulfato de sodio anhidro y recoja la fase líquida con una pipeta Pasteur. Concentrar el extracto por un factor de cuatro bajo flujo de nitrógeno. A continuación, transfiera la muestra concentrada a un vial de muestreador automático de GC.

Para la cuantificación de GCMS, inyecte dos microlitros de muestra con una proporción dividida de 10 a uno, y separe las moléculas volátiles extraídas utilizando el perfil de temperatura de horno adecuado. Usando las hojas de cálculo en el protocolo de texto, ingrese los valores de datos brutos que corresponden a la concentración de aminoácidos extracelulares, el peso seco de la célula, el contenido de proteínas de las células, la concentración de moléculas volátiles y el enriquecimiento isotópico de aminoácidos proteinogénicos y moléculas volátiles. Aquí se muestra un diagrama esquemático del flujo de trabajo para investigar la gestión por parte de la levadura de las múltiples fuentes de nitrógeno que se encuentran durante la fermentación del vino.

Para diferentes puntos de muestreo, los parámetros biológicos muestran una alta reproducibilidad entre las fermenaciones. Aquí se muestra una descripción general de la redistribución del nitrógeno desde las fuentes en el jugo de uva a todos los aminoácidos proteinogénicos. Combinado con la determinación de los balances de masa, la medición del enriquecimiento isotópico de aminoácidos proteinogénicos proporcionó la primera cuantificación de la contribución de arginina, glutamina, amonio y otras fuentes originadas en nitrógeno a los grupos aminas de cada uno de estos compuestos.

Aquí se muestra una comparación entre la cantidad de aminoácido consumido que se recupera directamente en la biomasa. Aquí se muestra la partición de los aminoácidos alifáticos consumidos, leucina y valina en la red metabólica de la levadura. Más del 96% de la valina y la leucina consumidas se recuperan en sus productos de conversión.

Sorprendentemente, una fracción sustancial de valina y leucina se catabolizan a pesar de un desequilibrio considerable entre la disponibilidad de estos compuestos en el medio y su contenido en biomasa. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco días. Al intentar este procedimiento, es importante recordar seleccionar cuidadosamente la parte de etiquetado del sustrato de acuerdo con las cuestiones científicas.

Para garantizar una buena reproducibilidad biológica, realice la fermentación y el análisis cromatográfico por duplicado. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la microbiología exploraran cómo cambian el metabolismo y la fisiología de los microorganismos en función de las condiciones ambientales. No olvide que trabajar con reactivos de derivatización y solvente de arginina puede ser extremadamente peligroso, por lo que siempre se deben tomar precauciones como usar guantes y trabajar bajo una campana extractora mientras se realiza este procedimiento.