Name: Flujo de trabajo basado en la combinación de trazador isotópico experimentos para investigar el metabolismo microbiano de múltiples fuentes de nutrientes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-22T13:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 47 s
Description: Aprende a investigar el metabolismo microbiano de múltiples fuentes de nutrientes mediante experimentos con trazadores isotópicos. Este método permite determinar el destino de los nutrientes consumidos y el origen metabólico de los compuestos sintetizados por levaduras.

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Agradecemos a Jean-Roch Mouret, Sylvie Dequin y Jean-Marie Sabalyrolles para contribuir a la concepción del sistema de fermentación asistida por Martine Pradal, Nicolas Bouvier y Pascale Brial para su soporte técnico. La financiación para este proyecto fue proporcionado por el Ministère de l ' Education Nationale, de la Recherche et de la Technologie.

<ol><li>Osterlund, T., Nookaew, I., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fifteen+years+of+large+scale+metabolic+modeling+of+yeast%3A+developments+and+impacts%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Fifteen years of large scale metabolic modeling of yeast: developments and impacts.</a> Biotechnol Adv. 30, 979-988 (2012).</li>
<li>Gombert, A. K., Moreirados Santos, M., Christensen, B., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Network+identification+and+flux+quantification+in+the+central+metabolism+of+Saccharomyces+cerevisiae+under+different+conditions+of+glucose+repression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Network identification and flux quantification in the central metabolism of Saccharomyces cerevisiae under different conditions of glucose repression.</a> J Bacteriol. 183, 1441-1451 (2001).</li>
<li>Wiechert, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">13C metabolic flux analysis.</a> Metab Eng. 3, 195-206 (2001).</li>
<li>Fischer, E., Zamboni, N., Sauer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+metabolic+flux+analysis+based+on+gas+chromatography-mass+spectrometry+derived+13C+constraints%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">High-throughput metabolic flux analysis based on gas chromatography-mass spectrometry derived 13C constraints.</a> Anal Biochem. 325, 308-316 (2004).</li>
<li>Rantanen, A., Rousu, J., Jouhten, P., Zamboni, N., Maaheimo, H., Ukkonen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+analytic+and+systematic+framework+for+estimating+metabolic+flux+ratios+from+13C+tracer+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">An analytic and systematic framework for estimating metabolic flux ratios from 13C tracer experiments.</a> BMC Bioinformatics. 9, 266(2008).</li>
<li>Zamboni, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((13C+metabolic+flux+analysis+in+complex+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">13C metabolic flux analysis in complex systems.</a> Curr Opin Biotechnol. 22, 103-108 (2011).</li>
<li>Kruger, N. J., Ratcliffe, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+plant+metabolic+networks+from+steady-state+metabolic+flux+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimie%22%5BJournal%5D)">Insights into plant metabolic networks from steady-state metabolic flux analysis.</a> Biochimie. 91, 697-702 (2009).</li>
<li>Quek, L. -E., Dietmair, S., Krömer, J. O., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+flux+analysis+in+mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Metab+Eng%22%5BJournal%5D)">Metabolic flux analysis in mammalian cell culture.</a> Metab Eng. 12, 161-171 (2010).</li>
<li>Perpete, P., Santos, G., Bodart, E., Collin, S. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/279893606_Uptake_of_amino_acids_during_beer_production_The_concept_of_a_critical_time_value">Uptake of amino acids during beer production: The concept of a critical time value.</a> J Am Soc Brew Chem. 63, 23-27 (2005).</li>
<li>Magasanik, B., Kaiser, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitrogen+regulation+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Nitrogen regulation in Saccharomyces cerevisiae.</a> Gene. 290, 1-18 (2002).</li>
<li>Ljungdahl, P. O., Daignan-Fornier, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+amino+acid%2C+nucleotide%2C+and+phosphate+metabolism+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Regulation of amino acid, nucleotide, and phosphate metabolism in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 190, 885-929 (2012).</li>
<li>Cooper, T. G. Nitrogen metabolism in Saccharomyces cerevisiae. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCooper%2C+TG+%22The+molecular+biology+of+the+yeast+Saccharomyces%3A+Metabolism+and+gene+expression%22">The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression</a>. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 39-99 (1982).</li>
<li>Jones, E. W., Fink, G. R. Regulation of amino acid and nucleotide biosynthesis in yeast. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJones%2C+EW+%22The+molecular+biology+of+the+yeast+Saccharomyces%3A+Metabolism+and+gene+expression%22">The molecular biology of the yeast Saccharomyces: Metabolism and gene expression</a>. Strathern, J. N., Jones, E. W., Broach, J. R. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor. New York, USA. 182-299 (1982).</li>
<li>Hazelwood, L. A., Daran, J. -M., van Maris, A. J. A., Pronk, J. T., Dickinson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ehrlich+pathway+for+fusel+alcohol+production%3A+a+century+of+research+on+Saccharomyces+cerevisiae+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Environ+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Ehrlich pathway for fusel alcohol production: a century of research on Saccharomyces cerevisiae metabolism.</a> Appl Environ Microbiol. 74, 2259-2266 (2008).</li>
<li>Bely, M., Sablayrolles, J. M., Barre, P. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0922338X90900574">Automatic detection of assimilable nitrogen deficiencies during alcoholic fermentation in oenological conditions.</a> J Ferment Bioeng. 70, 246-252 (1990).</li>
<li>Forster, J., Famili, I., Fu, P., Palsson, B. O., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-scale+reconstruction+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+metabolic+network%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Genome-scale reconstruction of the Saccharomyces cerevisiae metabolic network.</a> Genome Res. 13, 244-253 (2003).</li>
<li>Millard, P., Letisse, F., Sokol, S., Portais, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IsoCor%3A+correcting+MS+data+in+isotope+labeling+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">IsoCor: correcting MS data in isotope labeling experiments.</a> Bioinformatics. 28, 1294-1296 (2012).</li>
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Los autores no tienen nada que revelar.

Cuantificación de la partición de los compuestos a través de redes metabólicas experimentos de trazador isotópico es un enfoque prometedor para entender el funcionamiento del metabolismo microbiano. Esta metodología, mientras que aplica con éxito con uno o dos sustratos etiquetados, no puede ser implementada actualmente para estudiar el metabolismo de varias fuentes usando múltiples etiquetados isótopos elementales (es decir, más de dos substratos). De hecho, las técnicas analíticas disponibles permiten la deter...

Entender cómo funciona el metabolismo microbiano es una cuestión clave para el diseño de estrategias eficientes para mejorar los procesos de fermentación y modulan la producción de compuestos fermentativos. Avances en genómica y genómica funcional en estas dos últimas décadas contribuidas en gran medida a ampliar los conocimientos de la topología de redes metabólicas en muchos microorganismos. Acceso a esta información condujo al desarrollo de enfoques que buscan un panorama completo de la función celular1. Estas metodologías dependen a menudo de una interpretación basada en modelos de parámetros mensurables. Estos datos experimentales incluyen, por un lado, las tasas de captación y producción de metabolitos y, por otro lado, experimentos cuantitativo información intracelular que se obtiene del trazalíneas de isótopos. Estos datos proporcionan información esencial para la deducción de la actividad en vivo de las diferentes vías en una red metabólica definida2,3,4. Actualmente, las técnicas analíticas disponibles sólo permiten la detección precisa de etiquetado patrones de moléculas cuando se utiliza un solo elemento isótopo y posiblemente al conjunto de etiquetado con dos elementos isotópicos. Por otra parte, en la mayoría de las condiciones de crecimiento, la fuente de carbono sólo se compone de uno o dos compuestos. En consecuencia, los enfoques basados en marcadores isotópicos de C 13de substratos de carbón ampliamente y con éxito se aplicaron para desarrollar una comprensión completa de carbono red metabólica operaciones5,6,7 ,8.
Por el contrario, en muchos ambientes naturales e industriales, el recurso de nitrógeno disponible que apoya crecimiento microbiano se compone a menudo de una amplia gama de moléculas. Por ejemplo, durante la fermentación del vino o la cerveza, nitrógeno se presenta como una mezcla de 18 aminoácidos y amonio en concentraciones variables9. Este conjunto de compuestos de N que son accesibles para el anabolismo hace estas condiciones medios complejos considerablemente diferentes de las utilizadas para estudios fisiológicos, como este último se logra mediante una fuente única de nitrógeno, por lo general amonio.
En general, internalizado nitrógeno compuestos pueden ser incorporados en las proteínas directamente o catabolizados. La estructura de la red del metabolismo de nitrógeno en muchos microorganismos, incluyendo la levadura Saccharomyces cerevisiae, es muy compleja según la diversidad de sustratos. Esquemáticamente, este sistema se basa en la combinación del núcleo central del metabolismo de nitrógeno que cataliza la interconversión de glutamina, glutamato y el α-cetoglutarato10,11, con las aminotransferasas y Desaminasas. A través de esta red, se reúnen grupos de Amina de amonio o de otros aminoácidos y α-ceto ácidos liberados. Estos productos intermedios son también sintetizado a carbón central metabolismo (CCM)12,13. Este gran número de reacciones ramificadas y productos intermedios, involucrados en el catabolismo de las fuentes de nitrógeno exógeno y el anabolismo de aminoácidos proteinogenic, cumple con los requisitos anabólicos de las células. También resultados de la actividad a través de estas diferentes rutas interconectadas en la excreción de metabolitos. En particular, α-ceto ácidos pueden ser redirigidos a través de la vía de Ehrlich a producir alcoholes superiores y sus derivados de éster de acetato de14, que son contribuidores esenciales a los perfiles sensoriales de los productos. Posteriormente, cómo funciona el metabolismo del nitrógeno juega un papel clave en la producción de biomasa y la formación de moléculas volátiles (aroma).
Las reacciones, las enzimas y genes implicados en el metabolismo del nitrógeno son ampliamente descritos en la literatura. Sin embargo, la cuestión de la distribución de múltiples fuentes de nitrógeno a través de una red metabólica ha no aún abordada. Hay dos razones principales que explican esta falta de información. En primer lugar, dada la importante complejidad de la red de metabolismo del nitrógeno, una gran cantidad de datos cuantitativos se requiere para una comprensión completa de su funcionamiento que no estaba disponible hasta ahora. Segundo, muchas limitaciones experimentales y limitaciones de los métodos analíticos impidieron la aplicación de métodos que fueron utilizados previamente para la aclaración de la función CCM.
Para superar estos problemas, decidimos desarrollar un enfoque de nivel de sistema que se basa en la reconciliación de los datos de una serie de experimentos de trazador isotópico. El flujo de trabajo incluye: -Una serie de fermentaciones realizadas bajo las mismas condiciones ambientales, mientras que otra fuente nutrientes seleccionada (sustrato) se etiqueta cada vez. -Una combinación de procedimientos analíticos (HPLC, GC-MS) para una determinación precisa, en diferentes etapas de la fermentación, de la concentración residual de sustrato marcado y la concentración y el enriquecimiento isotópico de compuestos que se derivan de el catabolismo de la molécula marcada, incluida la derivada de la biomasa. -Un cálculo del equilibrio isotópico y masa para cada uno consume molécula marcada y un posterior análisis integrado del conjunto de datos para obtener una visión global de la gestión de múltiples fuentes de nutrientes por los microorganismos a través de la determinación de coeficientes de flujo .
Para aplicar esta metodología, debe prestarse atención al comportamiento reproducible del microorganismo y la tensión entre culturas. Además, deben tomarse muestras de diferentes culturas durante el progreso mismo de fermentación bien definidos. En el trabajo experimental en este manuscrito, un sistema de robótica se utiliza para el monitoreo en línea de las fermentaciones para tener en cuenta estas limitaciones.
Además, es esencial elegir un conjunto de sustratos marcados (compuesto, naturaleza y posición de las etiquetas) que es apropiado para abordar el problema científico del estudio. Aquí, arginina, glutamina y 15marcado con el N amonio fueron seleccionados como las tres fuentes de nitrógeno más importantes encontradas en el jugo de uva. Esto permitió evaluar el patrón de redistribución del nitrógeno de compuestos consumidos a los aminoácidos proteinogenic. También se intentó investigar el destino de la columna vertebral de carbono de los aminoácidos consumidos y su contribución a la producción de moléculas volátiles. Para cumplir con este objetivo, uniformemente leucina marcada con C 13, isoleucina, treonina y valina fueron incluidos en el estudio como aminoácidos que se derivan de importantes intermediarios de la vía de los Ehrlich.
En general, exploramos cuantitativamente cómo levadura gestiona un recurso complejo nitrógeno por redistribución de fuentes exógenas de nitrógeno para cumplir con sus requerimientos anabólicos a través Fermentación mientras que además quita el exceso de precursores de carbono como moléculas volátiles. El procedimiento experimental reportado en este trabajo puede aplicarse para investigar otras múltiples fuentes de nutrientes utilizadas por cualquier otro microorganismo. Parece ser un enfoque apropiado para el análisis del impacto de la genética o las condiciones ambientales en el comportamiento metabólico de los microorganismos.

<table><tbody><tr><td>D-Glucosa</td><td>PanReac</td><td>141341.0416</td><td></td></tr><tr><td>D-Fructosa</td><td>PanReac</td><td>142728.0416</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ácido málico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0875</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico monohidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7129</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de potasio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0772</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio heptahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A4514</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de manganeso monohidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7634</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de zinc heptahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z4750</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de cobre (II) pentahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7631</td><td></td></tr><tr><td>Yodo potásico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4286</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de cobalto (II) hexahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3169</td><td></td></tr><tr><td>Ácido bórico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B7660</td><td></td></tr><tr><td>Heptamolibdato de amonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7302</td><td></td></tr><tr><td>Mioinositol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>Ácido D-pantoténico sal hemicálcica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>21210</td><td></td></tr><tr><td>Tiamina, clorhidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4625</td><td></td></tr><tr><td>Ácido nicotínico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N4126</td><td></td></tr><tr><td>Piridoxina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5669</td><td></td></tr><tr><td>Biotina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4501</td><td></td></tr><tr><td>Ergost&eacute; rol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6510</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr><tr><td>Etanol absoluto</td><td>VWR Chemicals</td><td>101074F</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de hierro (III) hexahidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>236489</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-aspártico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9256</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-glutámico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1251</td><td></td></tr><tr><td>L-Alanina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7627</td><td></td></tr><tr><td>L-Arginina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5006</td><td></td></tr><tr><td>L-Cisteína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C7352</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G3126</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7126</td><td></td></tr><tr><td>L-Histidina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Isoleucina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I2752</td><td></td></tr><tr><td>L-Leucina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>L-Lisina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5501</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9625</td><td></td></tr><tr><td>L-Fenilalanina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P2126</td><td></td></tr><tr><td>L-Prolina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0380</td><td></td></tr><tr><td>L-Serina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S4500</td><td></td></tr><tr><td>L-treonina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8625</td><td></td></tr><tr><td>L-triptófano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0254</td><td></td></tr><tr><td>L-tirosina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3754</td><td></td></tr><tr><td>L-valina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V0500</td><td></td></tr><tr><td>13C5-L-valina</td><td>Eurisotop</td><td>CLM-2249-H-0.25</td><td></td></tr><tr><td>13C6-L-Leucina</td><td>Eurisotop</td><td>CLM-2262-H-0.25</td><td></td></tr><tr><td>15N-Cloruro de amonio</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-467-1</td><td></td></tr><tr><td>ALPHA-15N-L-Glutamina</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-1016-1</td><td></td></tr><tr><td>U-15N4-L-Arginina</td><td>Eurisotop</td><td>NLM-396-PK</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>270989</tr><tr><td>Propanaato de etilo</td><td>Sigma Aldrich 112305</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-metilpropanoato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>246085</td><td></td></tr><tr><td>Butanoato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E15701</td><td></td></tr><tr><td>2-metilbutanoato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>306886</td><td></td></tr><tr><td>3-metilbutanoato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>8.08541.0250</td><td></td></tr><tr><td>Hexanoato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>148962</td><td></td></tr><tr><td>Octanoato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244910</td><td></td></tr><tr><td>Decanoato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W243205</td><td></td></tr><tr><td>Dodecanoato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244112</td><td></td></tr><tr><td>Lactato de etilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W244015</td><td></td></tr><tr><td>Succinato de dietilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>W237701</tr><tr><td>Acetato de 2-metilpropilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W217514</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de 2-metilbutilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W364401</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de 3-metilbutilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>287725</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de 2-feniletil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>290580</td><td></td></tr><tr><td>2-metilpropanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>294829</td><td></td></tr><tr><td>2- metilbutanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>133051</td><td></td></tr><tr><td>3-metilbutanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>309435</td><td></td></tr><tr><td>Hexanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>128570</td><td></td></tr><tr><td>2-feniletanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>77861</td><td></td></tr><tr><td>Ácido propanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>94425</td><td></td></tr><tr><td>Ácido butanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>19215</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 2-metilpropanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>58360</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 2-metilbutanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>193070</td><td></td></tr><tr><td>Ácido 3-metilbutanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W310212</td><td></td></tr><tr><td>Ácido hexanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>153745</td><td></td></tr><tr><td>Ácido octanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W279900</td><td></td></tr><tr><td>Ácido decanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>W236403</td><td></td></tr><tr><td>Ácido dodecanoico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L556</td><td></td></tr><tr><td>Fermentador 1L</td><td>Legallais</td><td>AT1357</td><td>Fermentador hecho a mano para la fermentación</td></tr><tr><td>Sistema de filtración al vacío desechable</td><td>Dominique Deutscher</td><td>029311</td><td></td></tr><tr><td>Fermentadores (250 ml)</td><td>Legallais</td><td>AT1352</td><td>Fermentador hecho a mano para la fermentación</td></tr><tr><td>Tubos estériles</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Cerraduras de fermentación</td><td>Legallais</td><td>AT1356</td><td>Cerraduras de fermetación hechas a mano para la fermentación Extracto de</td></tr> levadura <tr><td>BactoYeast</td><td>Becton, Dickinson and Company 212750</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BactoPeptone</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Agitador de incubadora</td><td>Infors HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Contador de partículas</td><td>Beckman Coulter</td><td>6605697</td><td>Multisizer 3</td></tr><tr><td>Contracentrífuga</td><td>Jouan</td><td></td><td>GR412</td></tr><tr><td>Plate Butler Sistema robótico</td><td>Servicios de laboratorio BV</td><td>PF0X-MA</td><td>Placa de instrumentos automáticos</td></tr><tr><td>Software Butler Servicios</td><td>de laboratorio BV</td><td></td><td>Software de monitor de robot</td></tr><tr><td>RobView</td><td></td><td></td><td>Software de cálculo de desarrollo propio</td></tr><tr><td>My SQL</td><td></td><td></td><td>Base de datos de fuentes internacionales</td></tr><tr><td>Cimarec i Telesystem Agitadores multipunto</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>50088009</td><td>String Drive 60</td></tr><tr><td>BenchBlotter balancín de plataforma</td><td>Dutscher</td><td>60903</td><td></td></tr><tr><td>Kit enzimático de amoníaco</td><td>R-Biopharm AG</td><td>5390</td><td></td></tr><tr><td>Cubetas de espectrofotómetro</td><td>VWR</td><td>634-0678</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UviLine 9400</td><td>Secomam</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos patrones fisiológicos - ácidos y neutros</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6407</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos patrones fisiológicos - básicos</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6282</td><td></td></tr><tr><td>Tampones de litio de citrato - Reactivo de ultra ninhidrina</td><td>Biochrom</td><td>BC80-6000-06</td><td></td></tr><tr><td>Ácido sulfosalicílico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2130</td><td></td></tr><tr><td>Norleucina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N1398</td><td></td></tr><tr><td>Biochrom 30 AAA</td><td>Biochrom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>EZChrom Elite</td><td>Biochrom</td><td></td><td>Software de control de instrumentos y análisis de datos</td></tr><tr><td>Resina Ultropac 8 Litio</td><td>Biochrom</td><td>BC80-6002-47</td><td>Litio Filtro de columna fisiológico de alta resolución</td></tr><tr><td>Millex GV</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGVX13NL</td><td>Millex GV 13mm (tamaño de poro 0,22 y micro; m)</td></tr> <tr><td>Filtro de membrana PALL</td><td>VWR</td><td>514-4157</td><td>Supor-450 47mm 0.45&micro; m</td></tr><tr><td>Bomba de vacío Millivac Mini</td><td>Millipore</td><td>XF5423050</td><td></td></tr><tr><td>Plato de pesaje liso de aluminio 70mm</td><td>VWR</td><td>611-1380</td><td></td></tr><tr><td>Balanza de precisión</td><td>Mettler</td><td></td><td>Especificaciones AE163</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido secado</td><td>Merck</td><td>1029310161</td><td>(máx. 0,025% H2O) SeccoSolv</td></tr><tr><td>Horno de combustión</td><td>Legallais</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de proteínas Pierce BCA</td><td>Interchim UP40840A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Fluka</td><td>94318</td><td></td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H1009</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorhídrico fumante 37% Emsure</td><td>Merck</td><td>1003171000</td><td>grado ACS, ISO, Reag. Ph Eur</td></tr><tr><td>Tampón de acetato de litio</td><td>Biochrom</td><td>80-2038-10</td><td></td></tr><tr><td>Solución comercial de aminoácidos hidrolizados</td><td>Sigma Aldrich</td><td>AAS18</td><td></td></tr><tr><td>L-metionina sulfona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M0876</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-cisteico monohidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>30170</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de cultivo de vidrio Pyrex</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z653586</td><td></td></tr><tr><td>Piridina</td><td>Acros Organics</td><td>131780500</td><td>99% Etilo</td></tr><tr><td>Cloroformiato</td> Extrapuro <td>Sigma Aldrich</td><td>23131</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>32222</td><td></td></tr><tr><td>Viales Sigma</td><td>Aldrich</td><td>854165</td><td></td></tr><tr><td>Microinsertos para viales de 1,5 ml</td><td>Sigma Aldrich</td><td>SU860066</td><td></td></tr><tr><td>GC/MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>5890 GC/5973 MS</td><td></td></tr><tr><td>Chemstation</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>Software de control de instrumentos y análisis de datos</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34860</td><td>Chromasolv, para HPLC</td></tr><tr><td>Acetonitrilo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34998</td><td>ChromasolvPlus, para HPLC</td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformamida dimetilacetal</td><td>Sigma Aldrich 394963</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSTFA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>33024</td><td></td></tr><tr><td>DB-17MS columna</td><td>Agilent Technologies</td><td>122-4731</td><td>30m * 0.25mm * 0.15&micro; m</td></tr><tr><td>Sulfato de sodio, anhidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238597</td><td></td></tr><tr><td>Nitrógeno técnico</td><td>Productos del aire</td><td>14629</td><td></td></tr><tr><td>Zebron ZB-WAX columna</td><td>Phenomenex</td><td>7HG-G007-11</td><td>30m * 0.25mm * 0.25&micro; m</td></tr><tr><td>Helio BIP</td><td>Air products</td><td>26699</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio Pipetas Pasteur</td><td>VWR</td><td>612-1702</td><td></td></tr></tbody></table>

flujo de trabajo basado en la combinación de trazador isotópico experimentos para investigar el metabolismo microbiano de múltiples fuentes de nutrientes

Workflow Based on the Combination of Isotopic Tracer Experiments to Investigate Microbial Metabolism of Multiple Nutrient Sources

Estudios en el campo de la microbiología se basan en la aplicación de una amplia gama de metodologías. En particular, el desarrollo de métodos adecuados substancialmente contribuye a proporcionar amplios conocimientos sobre el metabolismo de los microorganismos crecen en medios químicamente definidos que contiene fuentes de carbono y nitrógeno único. En cambio, la gestión a través de múltiples fuentes de nutrientes, a pesar de su amplia presencia en ambientes naturales o industriales, permanece prácticamente inexplorada. Esta situación se debe principalmente a la falta de metodologías adecuadas, que dificulta las investigaciones.
Divulgamos una estrategia experimental cuantitativa y comprensivo explorar cómo metabolismo funciona cuando un alimento se suministra como una mezcla de diferentes moléculas, es decir, un recurso complejo. Aquí, Describimos su aplicación para la evaluación de la partición de múltiples fuentes de nitrógeno a través de la red metabólica de la levadura. El flujo de trabajo combina la información obtenida durante experimentos de trazalíneas de isótopos estables usando las 13C - o sustratos marcados con N 15. Primero consiste en fermentaciones paralelas y reproducibles en el mismo medio, que incluye una mezcla de moléculas que contiene N; sin embargo, una fuente de nitrógeno seleccionado se etiqueta cada vez. Se implementa una combinación de procedimientos analíticos (HPLC, GC-MS) para evaluar los patrones Etiquetadoras de compuestos específicos y cuantificar el consumo y la recuperación de sustratos en otros metabolitos. Un análisis integrado del conjunto completo de datos proporciona una visión general del destino de sustratos consumidos dentro de las células. Este enfoque requiere un protocolo preciso para la recolección de las muestras – facilitado por un sistema asistido por robot para monitoreo en línea de fermentaciones- y la realización de numerosos análisis desperdiciador de tiempo. A pesar de estas limitaciones, permitió entender por primera vez, la partición de múltiples fuentes de nitrógeno a través de la red metabólica de la levadura. Había aclarada la redistribución del nitrógeno de las fuentes más abundantes hacia otros compuestos de N y determinar el origen metabólico de proteinogenic aminoácidos y moléculas volátiles.

Figura 3 presenta un diagrama esquemático del flujo de trabajo que llevó a cabo para investigar la gestión de las múltiples fuentes de nitrógeno que se encuentran durante la fermentación la levadura. Para diferentes puntos de muestreo, las características de los parámetros biológicos, crecimiento, patrones de consumo de nitrógeno y el perfil de aminoácidos proteinogenic-muestran una alta reproducibilidad entre las fermentaciones (figur...

Este protocolo describe un procedimiento experimental cuantitativa y comprensivo investigar el metabolismo de múltiples fuentes de nutrientes. Este flujo de trabajo, basado en una combinación de experimentos de trazador isotópico y de un procedimiento analítico permite el destino de los nutrientes consumidos y el origen metabólico de moléculas sintetizado por microorganismos a determinar.

Flujo de trabajo basado en la combinación de trazador isotópico experimentos para investigar el metabolismo microbiano de múltiples fuentes de nutrientes

Studies in the field of microbiology rely on the implementation of a wide range of methodologies. In particular, the development of appropriate methods ...

El objetivo general de este procedimiento es investigar cuantitativamente el metabolismo de múltiples fuentes de nutrientes utilizando sustratos marcados. Este flujo de trabajo permite determinar el destino de los nutrientes consumidos y el origen metabólico de los compuestos sintetizados por las levaduras. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del metabolismo microbiano, como cómo funciona todo el metabolismo en función de las condiciones ambientales.La principal ventaja de esta técnica es que permite la elucidación y cuantificación de la proteína de distribución de nutrientes a partir de múltiples fuentes. Este método se utilizó para investigar el metabolismo del nitrógeno de la levadura, pero también se puede aplicar a otros metabolismos y microorganismos. La clave del éxito de este experimento reside en la reproducibilidad de las fermentaciones.Los usuarios deben prestar especial atención a recoger las células en la misma etapa fisiológica definida. La demostración del procedimiento estará a cargo de Christian Picou, de nuestro equipo técnico, Pauline Seguinot, estudiante de doctorado del laboratorio, y Stephanie Rollero, becaria postdoctoral. En un autoclave, pasteurice cada medio sintético preparado para cada fuente de nitrógeno en un matraz de un litro que contenga una barra agitadora magnética.Disuelva la cantidad adecuada de molécula marcada para alcanzar la concentración final deseada en el medio. Esterilice el medio utilizando un sistema de filtración al vacío desechable. Utilizando un cilindro de medición estéril, divida el medio entre dos fermentadores preesterilizados que contengan una barra de agitación magnética y estén equipados con bloqueos de fermentación para evitar la entrada de oxígeno pero permitir la liberación de dióxido de carbono.Después de cultivar una cepa de cerevisiae en medio YPD, recoja una alícuota de precultivo bajo flujo laminar y cuantifique la población celular utilizando un contador electrónico de partículas que esté equipado con una apertura de 100 micrómetros. Después de centrifugar el precultivo, suspender el pellet en un volumen adecuado de agua estéril para obtener una concentración final de 2,5 veces 10 a la 9ª célula por mililitro. Luego, inocular cada fermentador con un mililitro de la suspensión celular.Después de esto, prepare una plataforma de fermentación instalando los fermentadores en las guías de soporte que están correctamente colocadas en las placas de agitación de 21 posiciones y ajuste la tasa de agitación a 270 RPM. Para iniciar el seguimiento en línea de cada fermentación, inicie la aplicación de control del robot, haga clic en el botón Iniciar ensayo y seleccione el volumen de fermentación a realizar. Para asegurarse de que la interfaz mostrada permita la indicación del número y la posición de los fermentadores en la plataforma, haga clic con el botón derecho del ratón en la ubicación de la ranura y elija Desactivarlo para desactivar el seguimiento de las posiciones vacías.Para inicializar el software de cálculo, haga clic en el botón Inicializador y valide con OK. A continuación, haga clic en el botón Inicio de la aplicación de control del robot para iniciar las adquisiciones de peso. A continuación, centrifugar dos muestras de seis mililitros tomadas de los fermentadores a 2.000 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados. Cuando termine, transfiera cada sobrenadante congelado a dos tubos y guárdelo a menos 80 grados centígrados.Lave cada pellet dos veces con cinco mililitros de agua destilada y guárdelo a menos 80 grados centígrados para medir el enriquecimiento isotópico. Añadir 200 microlitros de una solución de ácido sulfosalicílico al 25% que contenga 2,5 milimolares de norleucina como patrón interno a 800 microlitros de muestra para eliminar moléculas de alto peso molecular. Después de la incubación y centrifugación, filtre la mezcla a través de una membrana de nitrocelulosa del tamaño de un poro de 0,22 micrómetros y coloque la muestra en un sistema de análisis de aminoácidos.En el programa o software del sistema de análisis, haga clic en el botón Ejecutar para comenzar los análisis de cromatografía líquida con el analizador equipado con una columna de intercambio catiónico. A continuación, prepare un extracto oxidado suspendiendo un pellet de células etiquetadas previamente preparado en 200 microlitros de ácido performático. Después de incubar durante cuatro horas a cuatro grados centígrados, detenga la reacción agregando 33,6 miligramos de sulfato de sodio.Agregue 800 microlitros de ácido clorhídrico normal al extracto oxidado e incube la muestra en un tubo de vidrio hermético durante 16 horas a 110 grados Celsius en un horno de calor seco. Después de dejar que la muestra se enfríe a temperatura ambiente, agregue 200 microlitros de neuroleucina de 2,5 milimolares y elimine el gas cloruro de hidrógeno con un chorro de nitrógeno. Lave el extracto seco dos veces con 800 microlitros de agua destilada y luego 800 microlitros de etanol.Luego, agregue 800 microlitros de tampón de acetato de litio de 200 milimolares al extracto. Determinar las concentraciones relativas de aminoácidos dentro de las proteínas de la muestra utilizando el método cromatográfico descrito anteriormente. Hidrolice un gránulo de celda marcada agregando 1,2 mililitros de ácido clorhídrico de seis molares e incubando la muestra durante 16 horas a 105 grados Celsius en un tubo de vidrio herméticamente cerrado en un horno de calor seco.Después de dejar que la muestra se enfríe a temperatura ambiente, agregue 1,2 mililitros de agua destilada. Después de la centrifugación para eliminar los desechos celulares, distribuya el sobrenadante en seis fracciones de 400 microlitros en tubos de vidrio abiertos. Seque las fracciones en el horno de calor seco a 105 grados centígrados durante cuatro o cinco horas hasta que alcancen la consistencia de almíbar.Durante la hidrólisis de la biomasa, seque la fracción hasta obtener la consistencia de un jarabe controlando frecuentemente el ácido de operación. Para la derivatización de ECF, disuelva el hidrolizado seco enfriado en 200 microlitros de ácido clorhídrico de 20 milimolares y 133 microlitros de una mezcla de uno a cuatro de piridina y etanol. Añadir 50 microlitros de cloroformiato de etilo para derivatizar los aminoácidos.Una vez que se haya liberado el dióxido de carbono, transfiera la mezcla a tubos de centrífuga que contengan 500 microlitros de diclorometano para extraer los compuestos derivatizados. Agite las muestras durante 10 segundos. Después de centrifugar durante cuatro minutos a 10.000 veces G, recoja la fase orgánica inferior de cada muestra con una pipeta Pasteur y transfiérala a un vial de muestreador automático de GC que contiene un inserto de vidrio cónico para que cada muestra pueda inyectarse directamente en el instrumento GCMS.Los reactivos de derivatización de HPLC se utilizan para el procedimiento ECF. Cambie con frecuencia los reactivos ECF. Para la derivatización de DMF-DMA, disuelva el hidrolizado seco en 50 microlitros de metanol y 200 microlitros de acetonitrilo.Añadir 300 microlitros de DMF-DMA y vorticear la muestra. A continuación, transfiera la muestra a un vial de muestreador automático de GC que contenga un inserto de vidrio cónico. Para la derivatización de BSTFA, suspender el hidrolizado en 200 microlitros de acetonitrilo.Agregue 200 microlitros de BSTFA a la muestra y cierre herméticamente el tubo de vidrio. Después de la incubación durante cuatro horas a 135 grados centígrados, transfiera el extracto enfriado directamente a un vial de muestreador automático de GC que contiene un inserto de vidrio cónico. Ahora, analice las muestras con un cromatógrafo de gases equipado con un inyector automuestreador y acoplado a un espectrómetro de masas.Haga clic en Instrumento en el menú del software de la computadora. En la pestaña Secuencia, haga clic en Editar tabla de registro de muestra para crear una lista de muestras y haga clic en Ejecutar y Ejecutar secuencia para iniciar las inyecciones. Una vez completados los análisis, registre un grupo de intensidades para cada aminoácido que corresponda a sus diferentes isótopos de masa.Agregue 10 microlitros de los patrones internos deuterados apropiados a cinco mililitros de sobrenadante en un tubo de vidrio de 15 mililitros. Agregue un mililitro de diclorometano, cierre bien el tubo y agite la muestra en una plataforma oscilante durante 20 minutos. Después de la centrifugación, recoja la fase orgánica inferior en un tubo de vidrio de 15 mililitros.Después de repetir la extracción de diclorometano, seque el extracto orgánico sobre 500 miligramos de sulfato de sodio anhidro y recoja la fase líquida con una pipeta Pasteur. Concentrar el extracto por un factor de cuatro bajo flujo de nitrógeno. A continuación, transfiera la muestra concentrada a un vial de muestreador automático de GC.Para la cuantificación de GCMS, inyecte dos microlitros de muestra con una proporción dividida de 10 a uno, y separe las moléculas volátiles extraídas utilizando el perfil de temperatura de horno adecuado. Usando las hojas de cálculo en el protocolo de texto, ingrese los valores de datos brutos que corresponden a la concentración de aminoácidos extracelulares, el peso seco de la célula, el contenido de proteínas de las células, la concentración de moléculas volátiles y el enriquecimiento isotópico de aminoácidos proteinogénicos y moléculas volátiles. Aquí se muestra un diagrama esquemático del flujo de trabajo para investigar la gestión por parte de la levadura de las múltiples fuentes de nitrógeno que se encuentran durante la fermentación del vino.Para diferentes puntos de muestreo, los parámetros biológicos muestran una alta reproducibilidad entre las fermenaciones. Aquí se muestra una descripción general de la redistribución del nitrógeno desde las fuentes en el jugo de uva a todos los aminoácidos proteinogénicos. Combinado con la determinación de los balances de masa, la medición del enriquecimiento isotópico de aminoácidos proteinogénicos proporcionó la primera cuantificación de la contribución de arginina, glutamina, amonio y otras fuentes originadas en nitrógeno a los grupos aminas de cada uno de estos compuestos.Aquí se muestra una comparación entre la cantidad de aminoácido consumido que se recupera directamente en la biomasa. Aquí se muestra la partición de los aminoácidos alifáticos consumidos, leucina y valina en la red metabólica de la levadura. Más del 96% de la valina y la leucina consumidas se recuperan en sus productos de conversión.Sorprendentemente, una fracción sustancial de valina y leucina se catabolizan a pesar de un desequilibrio considerable entre la disponibilidad de estos compuestos en el medio y su contenido en biomasa. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco días. Al intentar este procedimiento, es importante recordar seleccionar cuidadosamente la parte de etiquetado del sustrato de acuerdo con las cuestiones científicas.Para garantizar una buena reproducibilidad biológica, realice la fermentación y el análisis cromatográfico por duplicado. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la microbiología exploraran cómo cambian el metabolismo y la fisiología de los microorganismos en función de las condiciones ambientales. No olvide que trabajar con reactivos de derivatización y solvente de arginina puede ser extremadamente peligroso, por lo que siempre se deben tomar precauciones como usar guantes y trabajar bajo una campana extractora mientras se realiza este procedimiento.

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