Name: Destino celular genoma pre-enriquecimiento y toda amplificación sola célula caracterización aguas abajo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Aprende a aislar células raras mediante aislamiento basado en anticuerpos y micromanipulación láser para análisis genético de células tumorales circulantes en biopsias líquidas.

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Este estudio fue financiado por el fondo austriaco de ciencia (FWF), proyecto no. Me 1220-B19 (para PS) como parte del Proyecto ERANET en cáncer traslacional investigación (TRANSCAN) "Células tumorales de circulación como biomarcador para la enfermedad Residual mínima en cáncer de próstata (CTC-SCAN)". Candidato a doctor S.C. fue entrenado en el marco de la Medicina Molecular del programa de doctorado de la Universidad médica de Graz. Los autores reconocen con gratitud Nina Schlögl, Daniel Kummer, Gabi Wendt, Claudia Chudak, Julia Schulz y Johanna Schiller su asistencia técnica experta. Los autores agradecen a Georg Peinhaupt para apoyo de diseño gráfico.

<ol><li>Saucedo-Zeni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+in+vivo+isolation+of+circulating+tumor+cells+from+peripheral+blood+of+cancer+patients+using+a+functionalized+and+structured+medical+wire%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Oncol%22%5BJournal%5D)">A novel method for the in vivo isolation of circulating tumor cells from peripheral blood of cancer patients using a functionalized and structured medical wire.</a> Int J Oncol. 41 (4), 1241-1250 (2012).</li>
<li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+Molecular+Characterization+of+Tumor+Cells+in+Lung+Cancer+Patients+Using+a+Novel+In+Vivo+Device+for+Capturing+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enumeration and Molecular Characterization of Tumor Cells in Lung Cancer Patients Using a Novel In Vivo Device for Capturing Circulating Tumor Cells.</a> Clin Cancer Res. 22 (9), 2197-2206 (2016).</li>
<li>Kuske, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+detection+of+circulating+tumor+cells+in+non-metastatic+high-risk+prostate+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Improved detection of circulating tumor cells in non-metastatic high-risk prostate cancer patients.</a> Sci Rep-UK. 6 (1), (2016).</li>
<li>van Beers, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multiplex+PCR+predictor+for+aCGH+success+of+FFPE+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Brit+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">A multiplex PCR predictor for aCGH success of FFPE samples.</a> Brit J Cancer. 94 (2), 333-337 (2006).</li>
<li>El-Heliebi, A., Chen, S., Kroneis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Multiplex+PCR+for+Assessing+the+Quality+of+Whole+Genome+Amplified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using Multiplex PCR for Assessing the Quality of Whole Genome Amplified DNA.</a> Methods Mol Biol. 1347, 119-128 (2015).</li>
<li>Möhlendick, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Robust+Method+to+Analyze+Copy+Number+Alterations+of+Less+than+100+kb+in+Single+Cells+Using+Oligonucleotide+Array+CGH%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Robust Method to Analyze Copy Number Alterations of Less than 100 kb in Single Cells Using Oligonucleotide Array CGH.</a> PLoS ONE. 8 (6), e67031(2013).</li>
<li>Chen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+and+Release%3A+rare+cell+analysis+from+a+functionalised+medical+wire%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Catch and Release: rare cell analysis from a functionalised medical wire.</a> Sci Rep-UK. 7, 43424(2017).</li>
<li>Zhang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enumeration+and+molecular+characterization+of+circulating+tumor+cell+using+an+in+vivo+capture+system+in+squamous+cell+carcinoma+of+head+and+neck%5BTitle%5D)+AND+%22Chin+J+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Enumeration and molecular characterization of circulating tumor cell using an in vivo capture system in squamous cell carcinoma of head and neck.</a> Chin J Cancer Res. 29 (3), 196-203 (2017).</li>
<li>Carter, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+analysis+of+circulating+tumor+cells+identifies+distinct+copy-number+profiles+in+patients+with+chemosensitive+and+chemorefractory+small-cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Molecular analysis of circulating tumor cells identifies distinct copy-number profiles in patients with chemosensitive and chemorefractory small-cell lung cancer.</a> Nat Med. 23 (1), 114-119 (2017).</li>
<li>Luca, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutational+analysis+of+single+circulating+tumor+cells+by+next+generation+sequencing+in+metastatic+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Mutational analysis of single circulating tumor cells by next generation sequencing in metastatic breast cancer.</a> Oncotarget. , (2016).</li>
<li>Aravanis, A. M., Lee, M., Klausner, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-Generation+Sequencing+of+Circulating+Tumor+DNA+for+Early+Cancer+Detection%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Next-Generation Sequencing of Circulating Tumor DNA for Early Cancer Detection.</a> Cell. 168 (4), 571-574 (2017).</li>
<li>Page, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next+Generation+Sequencing+of+Circulating+Cell-Free+DNA+for+Evaluating+Mutations+and+Gene+Amplification+in+Metastatic+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Next Generation Sequencing of Circulating Cell-Free DNA for Evaluating Mutations and Gene Amplification in Metastatic Breast Cancer.</a> Clin Chem. 63 (2), 532-541 (2017).</li>
<li>Kalinich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+RNA-based+signature+enables+high+specificity+detection+of+circulating+tumor+cells+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An RNA-based signature enables high specificity detection of circulating tumor cells in hepatocellular carcinoma.</a> P Natl Acad Sci USA. 114 (5), 1123-1128 (2017).</li>
<li>Gorges, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accession+of+Tumor+Heterogeneity+by+Multiplex+Transcriptome+Profiling+of+Single+Circulating+Tumor+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Accession of Tumor Heterogeneity by Multiplex Transcriptome Profiling of Single Circulating Tumor Cells.</a> Clin Chem. 62 (11), 1504-1515 (2016).</li>
<li>Sinkala, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Profiling+protein+expression+in+circulating+tumour+cells+using+microfluidic+western+blotting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Profiling protein expression in circulating tumour cells using microfluidic western blotting.</a> Nat Commun. 8, 14622(2017).</li>
<li>Morrow, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumourigenic+non-small-cell+lung+cancer+mesenchymal+circulating+tumour+cells%3A+a+clinical+case+study%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Oncol%22%5BJournal%5D)">Tumourigenic non-small-cell lung cancer mesenchymal circulating tumour cells: a clinical case study.</a> Ann Oncol. 27 (6), 1155-1160 (2016).</li>
<li>Williamson, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenic+mimicry+in+small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Vasculogenic mimicry in small cell lung cancer.</a> Nat Commun. 7, 13322(2016).</li>
<li>Czyż, Z. T., Stoecklein, N. H., Polzer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Microdissection+of+FFPE+Tissue+Areas+and+Subsequent+Whole+Genome+Amplification+by+Ampli1TM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser Microdissection of FFPE Tissue Areas and Subsequent Whole Genome Amplification by Ampli1TM.</a> Methods Mol Biol. 1347, 141-162 (2015).</li>
<li>Czyż, Z. T., Klein, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deterministic+Whole-Genome+Amplification+of+Single+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Deterministic Whole-Genome Amplification of Single Cells.</a> Methods Mol Biol. 1347, 69-86 (2015).</li>
<li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+retrieval+of+single+microchimeric+cells+and+verification+of+identity+by+on-chip+multiplex+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Automatic retrieval of single microchimeric cells and verification of identity by on-chip multiplex PCR.</a> J Cell Mol Med. 14 (4), 954-969 (2010).</li>
<li>Kroneis, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+Molecular+Genetic+and+Cytogenetic+Analysis+from+Single+Cells+after+Isothermal+Whole-Genome+Amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Chem%22%5BJournal%5D)">Combined Molecular Genetic and Cytogenetic Analysis from Single Cells after Isothermal Whole-Genome Amplification.</a> Clin Chem. 57 (7), 1032-1041 (2011).</li>
<li>Kroneis, T., Jonasson, E., Andersson, D., Dolatabadi, S., Ståhlberg, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+preamplification+simplifies+targeted+mRNA+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep-UK%22%5BJournal%5D)">Global preamplification simplifies targeted mRNA quantification.</a> Sci Rep-UK. 7, 45219(2017).</li>
<li>Picelli, S., Faridani, O. R., Bjorklund, A. K., Winberg, G., Sagasser, S., Sandberg, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full-length+RNA-seq+from+single+cells+using+Smart-seq2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Full-length RNA-seq from single cells using Smart-seq2.</a> Nat Protoc. 9 (1), 171-181 (2014).</li>
<li>El-Heliebi, A., Heitzer, E., Kroneis, T., Chen, S., Haudum, C., Fuchs, J. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/chapter/10.1007/978-3-319-53661-3_12">Potential and Challenges of Liquid Biopsies.</a> Mechanisms of Molecular Carcinogenesis. 2, 233-261 (2017).</li>
<li>Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24556840">Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition.</a> Nat Rev Mol Cell Bio. 15 (3), 178-196 (2014).</li>
<li>Ferreira, M. M., Ramani, V. C., Jeffrey, S. S. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S157478911600017X">Circulating tumor cell technologies.</a> Mol Oncol. 10 (3), 374-394 (2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito tiene como objetivo recuperar las células de un alambre funcionalizado (denominado dispositivo) para análisis genómico ex vivo unicelular. Probamos tres EpCAM positivo las líneas celulares (HT-29, LNCaP y VCaP), pero en principio, este método puede aplicarse a cualquier línea celular expresando EpCAM. Células diana EpCAM positivos pueden presentarse al dispositivo de suspensión celular puro (ver 2.1.) o mezclado en un exceso de células de fondo (por ejemplo. periférico sangre, ver 2.2.). Mientras que sobre todo este último podría utilizarse para probar la capacidad de aislamiento en condiciones raras de la célula, puesta a punto del número de las células conectado al cable puede hacerse usando el bajo volumen descrito acercamiento (ver 2.3.). Como diferencias entre las líneas celulares son de esperarse, densidad celular adecuado para cargar el cable, rotación velocidad, así como tiempo de incubación tiene que comprobarse empíricamente, evaluando el número de células conectados usando un microscopio de inmunofluorescencia.
Para aplicaciones posteriores genómicas a nivel unicelular WGA, se requiere. El método WGA de elección puede diferir entre laboratorios y, en principio, nuestro método está abierto a todos los métodos que puede manejar las muestras obtenidas de Microdisección láser o micromanipulación. En este protocolo, utilizamos un método basado en ADN fragmentado enzimáticamente debido a un mejor rendimiento en comparación con un calor-fragmentación basado en WGA7. Opcionales, solo las células pueden enviarse a WGA isotermo permitiendo posterior DNA profiling20,21.
El protocolo descrito tiene como objetivo recuperar las células intactas después de ser unido a una nueva generación de cables funcionalizados para análisis genómico unicelular. La primera generación de cables funcionalizados, que también representan a los dispositivos de enriquecimiento sólo CE-aprobados en vivo en el mercado hasta ahora, fueron utilizada para la enumeración de CTC en pacientes con metástasis de cáncer. Publicaciones anteriores y nuestros datos sugieren que la técnica de aislamiento en vivo para ser más sensibles en comparación con el estándar de oro actual tecnología2. Así, equipando esta técnica de aislamiento en vivo con una función de recuperación cuando se dio cuenta en el dispositivo permite combinar la alta recuperación CTC con la caracterización a nivel unicelular.
Sin embargo, no se borra el dispositivo para el uso en pacientes, por lo tanto, los datos clínicos no están disponibles. Aplicaciones ex vivo (es decir, aislar CTCs de la sangre periférica después de muestreo) no son recomendables como la tecnología se adapta a la configuración presente del cubital inútil, por ejemplo bajo diámetro del vano (aumento de la probabilidad de directa de contacto entre el CTC y los anticuerpos de captura) y tiempo de retención largo (30 minutos, permitiendo que 2-3 L de sangre pasar el cable). Sin embargo, como se describe en la sección 2.2. las células de blanco también pueden ser aisladas de muestras mixtas7.
Una limitación actual del método es la ineficiente recuperación de células no fijadas después de la separación de los cables. Esto, sin embargo, podría mejorarse mediante un paso de fijación de la célula antes del tratamiento de la separación.
En Resumen, este protocolo es un primer paso hacia el uso combinado de una técnica de aislamiento en vivo con la recuperación de la célula para caracterizar genéticamente las células. Sus esfuerzos tienen que abordar la optimización de la recuperación de la célula y espacio para su aplicación en pacientes de1,2. Sin embargo, la medicina personalizada para las decisiones de control y terapia de tratamiento es más allá de la enumeración de los CTC. Así, este método es un primer paso hacia la caracterización genómica de CTC en el nivel unicelular.
Aplicaciones para análisis de transcriptoma unicelular parecen factibles como se cosechan las células intactas. Sin embargo, queda por evaluar si el procedimiento de recuperación tiene un impacto sobre la integridad del RNA (e.g. expedición recuperado las células a la lisis directa seguida por RT-qPCR22). Si tiene éxito, caracterización de las células (por ejemplo, CTC) puede cambiar de puesto al nivel de transcriptoma, permitiendo análisis más detallados. En este sentido, RNA-seq usando Smart-Sec2 proporciona una herramienta valiosa para posterior análisis del ARN de las células como el cDNA activos (obtenido durante la preparación de la biblioteca de RNA-seq) puede ser sometido a la PCR cuantitativa. Esto permitirá un objetivo combinado y análisis basado en la proyección de las células recuperadas22,23.
Los actuales cables funcionalizados se basan en anticuerpos anti-EpCAM que es un marcador epitelial ampliamente utilizado para la selección positiva de CTC24. Como varios CTC downregulate marcadores epiteliales citoqueratinas como EpCAM25, añadiendo anticuerpos como HER2/nueva aumentaría las posibilidades de aislamiento de la CTC. Varios anticuerpos basado en enriquecimiento de estrategias han sido elaboradas y revisados por Ferreira et al. en el 201626. Una mezcla de anticuerpos inmovilizados en un alambre podría ser una futura mejora de la tecnología líder para el aislamiento de un número más alto y subtipos adicionales de CTC.
Es obligatorio para todos los pasos de alambre manipulación para mantener la parte funcional del alambre sumergido en la solución para mantener su funcionalidad. Le recomendamos que coloque el cable de 1 x PBS durante la evaluación (microscopio; por ej. 3.1 los pasos. -3.3.) y almacenamiento de información. Con el fin de evitar que se manchen inadecuado, recomendamos usar recién preparado solución de tinción en pasos 1.2.1. y 1.2.2. Células débil obstaculizan el celular con el cable y pueden llevar a la subestimación de las células adjuntas.
Es necesario evitar conectar la pipeta Pasteur con el tapón de goma al insertar el cable de la pipeta Pasteur para la posterior carga de la suspensión celular (paso 2.3.4.). El tapón de goma se utiliza para sostener el cable en su lugar para que la parte funcional se encuentra dentro de la punta de la pipeta de Pasteur. Si la tapa se une demasiado firmemente a la parte posterior de la pipeta de Pasteur, carga de la suspensión de células no es posible. En este caso, facilitar la tapa que el aire que es desplazado por la suspensión de células cargadas puede dejar la pipeta.
El cable de la flexión es fundamental para su orientación durante la célula contando pasos 3.2. y 3.3. Monte los cables con la cinta adhesiva, tal que al final no funcional del alambre viene a mentir a un lado. Después de la digitalización de toda la longitud de la parte funcional, el alambre se enrolla 180° por lo que la otra mitad del cable funcional puede digitalizarse. Este paso es importante para los experimentos iniciales determinar el número de células en el alambre. Una vez que se evalúa el número de células de un determinado procedimiento y línea celular, el procedimiento se puede repetir sin contar a la célula (ej. sólo comprobando la presencia de células u omitir este paso). Pipeteo cuidadoso es fundamental para evitar la pérdida de la célula al reducir el volumen del sobrenadante en el paso 4.8. Asegúrese de pipeteo se realiza suavemente sin causar turbulencias a la pelotilla.

Recientemente, CellCollector DC01, un alambre médico funcionalizado con anticuerpos anti-EpCAM para aislar CTCs de sangre periférica de pacientes con cáncer, fue agregado a la gama metódica de CTC enumeración1,2,3 . En un estudio actualmente en curso en cáncer de próstata no metastásico, este cable funcionalizado divulga a casi dos veces tantos pacientes CTC-positivas y mayor CTC cuenta en CTC-pacientes positivos en comparación con CellSearch, el estándar de oro para enumeración CTC3 . Debido a este alentador desempeño, aislamiento de las células de un alambre médico funcionalizado para el análisis unicelular sería deseable, pero tratamiento enzimático con soluciones de separación celular (por ejemplo, tripsina) ni Microdisección láser permite la recuperación de las células intactas (datos no mostrados).
Para permitir la separación de las células capturadas, una nueva generación de cables funcionalizados fue equipada de un polímero específico. Este polímero, que une a los anticuerpos de captura con el alambre, es susceptible a un tratamiento de buffer de liberación que permite la separación de las células intactas (CellCollector DC03 denominado dispositivo). El nuevo dispositivo funcionalizado, permite el aislamiento de las células de la blanco de varias concentraciones de células de cáncer de la célula línea muestras mezcladas, albúmina de suero bovino (BSA) / fosfato tampón salino (PBS) y sangre periférica, respectivamente.
Para facilitar la detección visual de las células en el dispositivo y después de la recuperación, las células de cáncer blanco son etiquetadas con éster de succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE) y una mancha de ADN antes del tratamiento de recuperación (es decir. carga y desmontaje). Los efectos del tratamiento sobre la calidad del ADN de las células previamente fueron evaluados después de WGA por medio de un control de calidad PCR4,5, array-CGH6,7 y dirigido la secuencia7 no mostrando ninguna diferencia comparados con no tratados las células micromanipulated de suspensiones de células7. La ventaja de este método radica en la combinación de enriquecimiento previo rara de célula diana y la recuperación de las células unicelulares análisis aguas abajo (figura 1). El actual dispositivo de recolección con etiqueta CE en vivo es generalmente usado para recuento de CTC en lugar de caracterización molecular de la célula de solo2,8. Sin embargo, análisis más exhaustivo para investigar la heterogeneidad entre los CTCs para análisis a nivel de células individuales (es decir, dirigida la secuencia en el nivel unicelular). Otros métodos basados en la célula se basan en el aislamiento Inmunomagnética de CTC EpCAM positivos y manejo sola célula basado en dielectroforesis para posterior análisis genético molecular9,10. Caracterización molecular de CTC es un requisito importante para su aplicación útil en un ajuste clínico y es igualmente importante en la investigación básica de la cascada metastásica. En paralelo a la CTC, ADN tumoral circulante (ctDNA) se ha convertido en de gran importancia ya que permite el análisis de la DNA de la carga del tumor con mínimo aislamiento técnico procedimientos11,12. Los enfoques de base de la célula podrían servir como un aporte complementario que permite RNA13,14 y proteína15 análisis de la expresión y también para CTC derivan célula culturas o xenoinjertos16, 17. aunque todavía necesitan superar obstáculos tales como recuperación de la célula bajo y espacio para el uso en pacientes, el método de captura y liberación toma un importante paso hacia la caracterización de las células blanco raro.

<table><tbody><tr><td>Gilupi Release Buffer</td><td>Gilupi</td><td>GIL083</td><td>Se utiliza para separar las células del cable</td></tr><tr><td>McCoy's 5A Medium (1x) suppl. con L-Glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16600-082</td><td>Medio de cultivo utilizado para células HT-29, adapte el medio de cultivo a la línea celular utilizada para los experimentos</td></tr><tr><td>HEPES Buffer Solution (1 M)</td><td>PAA</td><td>S11-001</td><td>Suplemento para McCoy's 5A Medium</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino Gold</td><td>PAA</td><td>A15-151</td><td>Suplemento para el medio modificado 5a de McCoy's</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (100x)</td><td>Biowest</td><td>L0018-100</td> Suplemento para solución salina tamponada con fosfato del <td>medio modificado 5a de McCoy</td></tr><tr><td>(1x PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-015</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Biowest</td><td>L0950-100</td><td>Solución de desprendimiento celular (cultivo celular)</td></tr><tr><td>Baño de agua</td><td>GFL</td><td>Tipo 1003</td><td>Se utiliza para soluciones de precalentamiento</td></tr><tr><td>Incubadora</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Se utiliza para incubar células (cultivo celular)</td></tr><tr><td>50 ml Tubos de reacción</td><td>VWR</td><td>525-0403</td><td></td></tr><tr><td>Mezclador de rodillos</td><td>Stuart Scientific</td><td>SRT6D</td><td>Se utiliza para unir las células al cable mientras se evitan que las células se sedimenten</td></tr><tr><td>CellTrace CFSE Proliferación celular Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C34554</td><td>Se utiliza para etiquetar células vivas (etiqueta citoplasmática)</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>H3570</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Se utiliza para teñir ADN (contratinción nucleica)</td></tr><tr><td>Centrífuga (equipada para contener tubos de reacción de 15 mL y 50 mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Megafuge 40R</td><td>Se utiliza para peletizar células</td></tr><tr><td>Observer Z1 (Microscopio de fluorescencia/microdisección láser)</td><td>Carl Zeiss Microscopio</td><td></td><td>invertido (inmunofluorescencia) capaz de microdisección láser; Los microscopios de fluorescencia deben ser capaces de detectar Hoechst 33342 (filtro DAPI) y CFSE (filtro FITC)</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td>Se utiliza para el recubrimiento de superficies de vidrio/plástico</td></tr><tr><td>MS1 Minishaker</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z404039</td><td>Se utiliza para el vórtice</td></tr><tr><td>Vacutainer Tubos de EDTA (o Na-heparina)</td><td>BD</td><td>366450 (o 366480)</td><td>Utilizado como tubo de reacción para la captura ex vivo de células diana</td></tr><tr><td>Detektor CANCER03 DC03</td><td>Gilupi</td><td>GIL003</td><td>Cable funcionalizado capaz de aislar y separar células EpCAM positivas (también conocido como catch& lanzamiento, C& R)</td></tr><tr><td>Agujas de jeringa (G20)</td><td>VWR</td><td>613-0554</td><td>Se utilizan para perforar tapas de goma con el fin de permitir la parte no funcional del C& R para conducir a través de ella</td></tr><tr><td>Cámara de Neubauer</td><td>Roth</td><td>T729.1</td><td>Se utiliza para contar células</td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur 150 mm</td><td>Volac</td><td>D810</td><td>Se utiliza para la aplicación de bajo volumen de células a la C& R</td></tr><tr><td>Grease pen</td><td>Dako</td><td>S2002</td><td>Se utiliza en portaobjetos de vidrio para mantener la suspensión de la célula en su lugar</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa estéril (0.2 y micro; m)</td><td>Corning</td><td>431219</td><td>Para filtrar Gilupi recién preparado Tampón de liberación</td></tr><tr><td>Delfia PlateShaker</td><td>Perkin Elmer</td><td>1296-003</td><td>Utilizado para la agitación durante el desprendimiento de la célula</td></tr><tr><td>Tubos de 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>30,125,150</td><td></td></tr><tr><td>Ampli1 WGA Kit</td><td>Silicon Biosystems</td><td></td><td>A pedir a través de Silicon Biosystems</td></tr><tr><td>Axiovert M200 equipado con Mikromanipulator MMJ y CellTram vario</td><td>Zeiss/Eppendorf</td><td></td><td>Utilice la micromanipulación a mano</td></tr><tr><td>Los microcapilares (25 y micro; m de diámetro), CustomTip Tipo I</td><td>Eppendorf</td><td>930001201</td><td>Se utiliza para micromanipular células</td></tr><tr><td>Tubos de PCR de 0,2 mL</td><td>Biozym</td><td>710920</td><td></td></tr><tr><td>Citocentrífuga y equipo</td><td>Hettich</td><td>Universal 32</td><td>Utilice la citocentrífuga a mano</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>Bio-Rad</td><td>DNA Engine Dyad</td><td>Todos los termocicladores con tapa calefactada se pueden utilizar</td></tr><tr><td>Microcentrífugas</td><td>Roth</td><td>CX73.1</td><td>Utilice la centrífuga de sobremesa</td></tr><tr><td>a mano MembraneSlide 1.0 PET</td><td>Zeiss</td><td>415101-4401-050</td><td>Portaobjetos de vidrio recubiertos de membrana utilizados para la microdisección láser</td></tr><tr><td>UV Stratalinker 1800</td><td>Stratagene</td><td>400072</td><td>Utilice el reticulante cruzado de ADN a mano</td></tr><tr><td>Reactivos</td><td></td><td></td><td></td>de PCR estándar</tr><tr><td>6x Carga de ADN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0611</td><td>Usar gel Cargando tinte a mano</td></tr><tr><td>escalera de ADN</td><td>BioLabs</td><td>N0551G</td><td>Utilice una escalera de 100 pb a mano</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>Gel estación de electorforesis</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>Utilice el sistema de electroforesis a mano</td></tr><tr><td>Gel Tinte de ácido nucleico rojo Biotium</td><td></td><td>41003</td><td>Colorante intercalante para la visualización del ADN En geles de agarosa</td></tr></tbody></table>

destino celular genoma pre-enriquecimiento y toda amplificación sola célula caracterización aguas abajo

Target Cell Pre-enrichment and Whole Genome Amplification for Single Cell Downstream Characterization

Células blanco raro pueden ser aisladas de un alto fondo de células no objetivo utilizando anticuerpos específicos para proteínas de la superficie de las células diana. Un método recientemente desarrollado utiliza un alambre médico funcionalizado con anticuerpos de molécula (EpCAM) de adherencia de célula epitelial contra en vivo aislamiento de circulación tumor células (CTC)1. Una cohorte emparejado de paciente en cáncer de próstata no metastásico demostró que la técnica de aislamiento en vivo resultó en un mayor porcentaje de pacientes positivos para CTC, así como mayor CTC cuentas en comparación con el patrón oro en enumeración de CTC. Como las células no pueden ser recuperadas de los dispositivos médicos actuales, fue fabricado un nuevo cable funcionalizado (denominado dispositivo) lo que permite la captura y posterior desprendimiento de las células por tratamiento enzimático. Las células están autorizadas a conectar al dispositivo, visualizados en el microscopio y separada mediante tratamiento enzimático. Las células recuperadas son cytocentrifuged en portaobjetos recubiertos con membrana y cosechan individualmente mediante Microdisección láser o micromanipulación. Sola célula muestras son entonces sometidas a amplificación sola célula genoma permitiendo múltiples análisis aguas abajo como métodos de screening y específico del destino. El procedimiento de aislamiento y recuperación produce alta calidad de ADN de las células y no impide la amplificación del genoma entero posterior (WGA). ADN amplificado de una sola célula puede enviarse a proyección o dirigida análisis de hibridación genómica comparativa de matriz (array-CGH) como secuencia. El dispositivo permite ex vivo aislado de muestras de células raras artificial (es decir 500 células blanco tacon en 5 mL de sangre periférica). Mientras que las tasas de desprendimiento de las células son aceptable (50-90%), la tasa de recuperación de células separadas en diapositivas abarca una amplia gama depende de la línea celular utilizada (< 10 - > 50%) y necesita más atención. Este dispositivo no se despejó para el uso en pacientes.

Las células después de CFSE y tinción nucleicos pueden evaluarse usando un microscopio de inmunofluorescencia equipado con filtros DAPI y FITC. Los núcleos presentan un contraste brillante en el canal DAPI mientras que el citoplasma de las células muestran etiquetado uniforme con CFSE con intensidad de entre célula heterogénea (figura 2A y 2E). Forma y coloración de intensidades similares son esperados de las células conectadas al cable (figura 2B y 2F) así como desprende el cable y recuperados en un portaobjetos (Figura 2D y 2 H).
Las densidades de célula alta (por ejemplo &gt; 1 000 000 células/mL) puede resultar en cobertura total del alambre con las células de carga de los cables. Sin embargo, reducir las densidades de célula, cambios en la velocidad de rotación durante la incubación y el uso de diferentes líneas celulares afectan la eficiencia de aislamiento y deben analizarse por separado. Cuando los cables se incubaron con 5 mL de células HT-29 en el de 100 000 células / mL como se describe en la sección 2.1., una media de 254 ± 103 células (n = 5) fueron capturados en los cables. Con el mismo experimento usando las células LNCaP, una media de 440 ± 319 células (n = 5) por cable se obtuvo.
Presentar células HT-29 500, 5 000 y 50 000 en un fondo de 5 mL de sangre periférica a los cables (según protocolo de sección 2.2.) resultó en la captura de 75 ± 18 células, 25 ± 9 células y células ± 57 47 (n = 3, cada uno), respectivamente. Si el cable está cargado con 15 μl de suspensión celular (1 000 000 células/mL) según el protocolo en la sección 2.3., hasta 1 000 (HT-29) las células pueden unir a un cable.
Eficiencias de separación osciló entre el 81% en las células HT-29 de la célula (gama 54,9% y 93.2% y n = 5) al 81% (gama 63.51% - 92.87%, n = 6) y el 91% (rango de 84,7% y 95,3%, n = 6) en LNCaP y VCaP células, respectivamente. Del mismo modo, la recuperación de células separadas difiere entre líneas celulares: una media de 28% de células HT-29 chalets fueron recuperados por citocentrifugación. Mientras que la tasa de recuperación de LNCaP fue inferior al 10%, la tasa de recuperación media para las células VCaP fue 55%.
Aproximadamente el 75% de las células sometidas a productos de WGA WGA rendimiento de alta calidad: esto es 1) borrón de transferencia de productos WGA desde 0.1 a &gt; 1 kb (figura 4, panel superior) y 2) tres o cuatro bandas de calidad 4plex controlan PCR (figura 4, panel inferior) . Productos WGA se pueden utilizar para 1) array-CGH perfiles cumplen con los criterios de calidad para single-cell array-CGH perfiles 6,7 y NGS 2) objetivo después de la amplificación WGA 7.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig1.jpg"> Figura 1: flujo de trabajo para aislar y la recuperación de las células de la blanco para el análisis unicelular. (A) las células se cultivan para el 90% de confluencia y (B) cosechadas para obtener una suspensión unicelular. Después de la tinción con CFSE y mancha de nucleico, (C) el cable funcionalizado se incuba en presencia de las células en un volumen de 5 mL en tubos de reacción o en un volumen bajo, utilizando una pipeta Pasteur. Este último permite para aplicación de volúmenes de suspensión celular tan bajas como 15 μl. (D) células necesitan ser separadas dentro de 4 h después de la carga. Por lo tanto, el cable se coloca en un tubo de reacción de 1,5 mL con buffer de liberación. Después de la incubación de 15 minutos en un eje de balancín y centrifugación de 10 minutos, se retira el cable y la suspensión se centrifuga para que sedimenten las células. (E) recuperan las células son o transfiere a un portaobjetos de vidrio para micromanipulación unicelular (arriba) o cytocentrifuged un portaobjetos recubierto de membrana y remitió a láser microdissection (abajo). (F) finalmente, las células recolectadas se amplifican por medio de la amplificación del genoma (WGA). Productos WGA son compatibles con el array-CGH y objetivo análisis descendente de NGS. EpCAM epitopo: círculo verde en la superficie de la célula. Funcionalizados cable: dispositivo, de alambres helicoidal triple gris. Polímero: líneas moradas. Anticuerpos anti-EpCAM: naranja. Liberar la actividad buffer: flecha roja. Marcador de grasa para mantener la suspensión de células en su lugar: elipse azul oscuro. Recuperado de suspensión celular: azul claro. Capilares para micromanipulación: Negro línea. Ampliación: celular recuperado por micromanipulación, cytospin en membrana diapositiva que contienen células recuperadas (elipse llena gris). Ampliación: celular recuperado siendo láser microdissected (línea circular gris: membrana de diapositiva de membrana que sirven como columna vertebral para Microdisección láser), objetivo con láser (línea azul a la diapositiva de la membrana de abajo). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig2.jpg"> Figura 2: visualización de las células con. (A, E) Las células antes de la carga: las células son etiquetadas con CFSE y contratinción con un ADN intercalando tinte mostrando una intensidad de señal del rango de CFSE (verde). (B,F) Etiquetado células capturadas en el alambre. (C,G) De alambre después de procedimiento de separación celular. (D,H) Las células desprendidas de alambre y recuperaron por citocentrifugación en una diapositiva. CFSE: FITC el canal (verde). Tinción de DNA: canal DAPI (azul). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig3.jpg"> Figura 3: alambre y conservación compartimiento conservación. (A) los compartimientos del alambre. (B) detalle de la parte funcionalizada. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56394/56394fig4.jpg"> Figura 4: control de calidad de productos WGA obtenida de células micromanipulated solo. Panel superior: productos WGA obtenidos de células típicamente resultado en ADN los borrones de transferencia que van desde 0,2 kb &gt; 1,0 KB con una intensidad de pico en alrededor de 0,5 kb. Frotis de muestras número 1, 7 y 13 (indicadas con asteriscos) Mostrar subóptima o no ADN. Panel inferior: WGA productos son de calidad suficiente si la PCR 4plex produce tres o cuatro de cuatro productos PCR (100, 200, 300 y 400 bp). Las muestras 1, 7, 10 y 13 muestran menos de tres bandas y sería excluidas de su análisis posterior. Carril M contiene una escalera de bp 100 y los asteriscos indican las muestras de calidad de producto insuficiente de WGA. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56394/56394fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Secuencia de primer</td>
			<td>NOTA</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 gtt cca ata tga ttc cac cc-3 '</td>
			<td>primer avance de 100 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5-ctc ctg gaa gat ggt Tag gg-3 '</td>
			<td>primer revés de 100 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>mordaza de 5′-agg tgg agc TCG agc-3 '</td>
			<td>primer avance de 200 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5-ttt ggt tgc gga aat gtc ct-3′</td>
			<td>primer revés de 200 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5-agg tga gac att ctt gct gg-3 '</td>
			<td>primer avance de 300 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5-tcc ley aac cag tca gcg tc-3 '</td>
			<td>300 cartilla reversa de bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5-aca gtc gato gcc atc ley gc-3 '</td>
			<td>primer avance de 400 bp</td>
		</tr>
<tr>
<td>5-gct tga caa agt ggt cgt tg-3 '</td>
			<td>primer revés de 400 bp</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Secuencias de la cartilla para control de calidad 4plex PCR

Este protocolo es recuperar y preparar dianocitos rara de una mezcla con las células de distintos antecedentes caracterización genética molecular a nivel unicelular. Calidad de ADN es igual a las células no tratadas y permite aplicación unicelular (ambos proyección base y objetivo análisis).

Destino celular genoma pre-enriquecimiento y toda amplificación sola célula caracterización aguas abajo

Rare target cells can be isolated from a high background of non-target cells using antibodies specific for surface proteins of target cells. A recently ...

El objetivo general de este procedimiento es aislar las células de la suspensión celular con el fin de hacerlas disponibles para el análisis posterior de una sola célula. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el contexto de las biopsias líquidas y la heterogeneidad celular. La principal ventaja de esta técnica es que permite el aislamiento de células individuales basado en anticuerpos y su recuperación para su posterior análisis genético molecular a nivel de célula única.Una vez autorizada para su uso en pacientes, esta técnica permitirá la caracterización de las células tumorales circulantes de pacientes con cáncer. Dado que este método puede proporcionar información sobre la heterogeneidad entre células individuales, se puede aplicar a todo tipo de suspensiones celulares que contengan subpoblaciones, como muestras de sangre, muestras de cultivos celulares o tejidos y órganos disociados. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando utilizamos un dispositivo de enriquecimiento in vivo que no era capaz de liberar células con el fin de realizar análisis posteriores.La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos para la recolección de células individuales mediante microdisección láser o micromanipulación son difíciles de realizar con éxito porque el proceso de recolección de células individuales es propenso a la pérdida de células y requiere un alto nivel de experiencia. En un mililitro de medio de cultivo celular precalentado, vuelva a suspender las células marcadas con HT-29 CFSE y deje que se regeneren a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Para recolectar las células, centrifugar a 300 g durante tres minutos.A continuación, vuelva a suspender el pellet celular en un mililitro de solución de tinción de ADN Hoechst 33342 lista para usar a 37 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, centrifugar la suspensión celular a 300 g durante tres minutos. A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en cuatro mililitros de solución salina tamponada con fosfato 1X.Luego, cuente el número de células con un hemocitómetro y verifique el marcaje de fluorescencia con un microscopio de fluorescencia. A continuación, centrifugar las células a 300 g durante tres minutos, desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet a aproximadamente 500.000 células por mililitro y colocar las células en hielo. En cinco mililitros de sangre periférica, agregue alrededor de 500 a 500.000 células y luego mezcle invirtiendo el tubo.Después de quitar el cable del compartimiento de almacenamiento, retire la tapa de goma que sujeta el cable y lave el cable con solución salina tamponada con fosfato 1X y móntelo en la tapa del tubo. Luego, incube el tubo en un mezclador de rodillos inclinados a cinco rotaciones por minuto durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, enjuague el alambre con solución salina tamponada con fosfato 1X tres veces.Luego, guarde el alambre en un tubo de 15 mililitros que contenga solución salina tamponada con fosfato 1X en la oscuridad. Dibuje un área rectangular en un portaobjetos de vidrio con un bolígrafo de grasa, luego agregue 500 microlitros de solución salina tamponada con fosfato 1X. Para sumergir la parte funcional del alambre en solución salina tamponada con fosfato 1X, doble la parte no funcional del alambre y colóquela en el portaobjetos de vidrio.Para contar el número de celdas capturadas, inspeccione visualmente ambos lados del cable. Después de inspeccionar, transfiera el cable nuevamente al tubo de 15 mililitros con solución salina tamponada con fosfato 1X y manténgalo en la oscuridad. En un mililitro de solución salina tamponada con fosfato 1X, disuelva cuatro miligramos del componente del tampón de liberación, luego filtre la solución a través de un filtro estéril de 0,2 micrómetros para obtener el tampón listo para usar.A continuación, caliente el tampón de liberación a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Una vez calentado, transfiera 1,6 mililitros de tampón de liberación para llenar completamente un tubo de reacción de 1,5 mililitros. A continuación, incube la parte funcional del alambre en el tampón de liberación a 37 grados centígrados en un baño de agua durante 20 minutos.Después de la incubación, coloque el alambre en un agitador a 500 rotaciones por minuto durante 15 minutos. A continuación, centrifugar el alambre a 300 g durante 10 minutos. Una vez finalizada la centrifugación, retire el alambre del tubo, cierre la tapa y vuelva a centrifugar el tubo a 300 g durante 10 minutos.Para disminuir el volumen de la suspensión celular, deseche todos menos 100 microlitros de sobrenadante para la micromanipulación o 300 microlitros para la posterior citocentrifugación y microdisección láser. Luego, proceda rápidamente al muestreo de una sola célula. Para la micromanipulación, transfiera los 100 microlitros completos de suspensión celular a un portaobjetos de vidrio.Luego, coloque el portaobjetos de vidrio en un microscopio equipado con un micromanipulador y deje que las células se asienten durante cinco minutos. A continuación, en tubos de PCR de 0,2 mililitros, pipetear dos microlitros de mezcla maestra de lisis celular y transferir a hielo. Utilice el micromanipulador para recolectar una sola célula en un microlitro de solución salina tamponada con fosfato 1X.Luego, transfiera la celda directamente a dos microlitros de mezcla maestra de lisis celular. Utilice un microfuger de sobremesa para centrifugar rápidamente las muestras a 2.000 g durante tres segundos para recoger el líquido en el fondo del tubo. A continuación, transfiera la muestra a hielo y proceda a la amplificación del genoma completo basada en un adaptador-enlazador.Aspire solo una celda usando un microlitro de tampón como máximo. Al transferir la célula a la solución de lisis, asegúrese de ver burbujas que surgen de la solución, lo que indica que se ha transferido todo el volumen aspirado. Para la microdisección láser, citocentrífugo la totalidad de los 300 microlitros de suspensión celular en un portaobjetos recubierto de membrana a 300 g durante cinco minutos.A continuación, coloque el portaobjetos recubierto de membrana en un microscopio capaz de realizar microdisecciones con láser. A continuación, pipetee 4,5 microlitros de mezcla maestra de lisis celular en la tapa del tubo de PCR de 0,2 mililitros. Coloque la tapa sobre la muestra y coseche una sola célula mediante microdisección láser.Inmediatamente después, compruebe si hay células aisladas en el tapón de PCR, retire el tubo de PCR del microscopio de microdisección láser y cierre el tubo. Recoja todo el líquido en el fondo del tubo con un giro corto. Transfiera la muestra en hielo y proceda a la amplificación del genoma completo basada en adaptador-enlazador.Asegúrese de recuperar la célula microdiseccionada con láser. Por lo tanto, es importante cubrir todo el tapón del tubo con la solución de lisis. Después de la microdisección, revise la tapa del tubo para detectar la presencia de la célula.Para mostrar las células teñidas con CFSE y Hoechst 33342, se tomaron imágenes de inmunofluorescencia antes de cargar el cable, durante la unión de las células al cable, luego se separaron del cable y, finalmente, en el portaobjetos. Las imágenes de inmunofluorescencia de las células antes de la carga muestran una tinción nucleica brillante en azul, mientras que el citoplasma de las células muestra una tinción CFSE verde con una intensidad intercelular heterogénea. También se observa un patrón de tinción similar para las células que se unen y posteriormente se separan del alambre.Para comprobar la calidad de los productos de amplificación del genoma completo, se utilizó un gel de agarosa al 1%. El gel de agarosa muestra un frotis de ADN que oscila entre 0,2 y más de 1 kilobase para los productos de PCR de amplificación del genoma completo. Los productos de PCR de control de calidad 4plex obtenidos de una sola célula producen productos de 100, 200, 300 y 400 pares de bases.Los productos que muestran menos de tres bandas se excluyen de un análisis posterior. Una vez dominada, esta técnica permite el aislamiento de células individuales de suspensiones celulares en cuatro horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las células sumergidas en el tampón, especialmente durante el tiempo que las células están conectadas al cable para evitar dañarlas.Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos de análisis como la hibridación genómica comparativa de área, la secuenciación de próxima generación y la PCR específica del objetivo para caracterizar células individuales en función de las variaciones y mutaciones del número de copias. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y recuperar células de suspensiones celulares utilizando un cable funcionalizado y cómo tomar muestras de células individuales para múltiples análisis genéticos moleculares posteriores. No olvide que trabajar con sangre humana presenta la posibilidad de infección, por lo que el uso de guantes y una bata de laboratorio son obligatorios mientras se realiza este procedimiento.

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