Destino celular genoma pre-enriquecimiento y toda amplificación sola célula caracterización aguas abajo

El objetivo general de este procedimiento es aislar las células de la suspensión celular con el fin de hacerlas disponibles para el análisis posterior de una sola célula. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el contexto de las biopsias líquidas y la heterogeneidad celular. La principal ventaja de esta técnica es que permite el aislamiento de células individuales basado en anticuerpos y su recuperación para su posterior análisis genético molecular a nivel de célula única.

Una vez autorizada para su uso en pacientes, esta técnica permitirá la caracterización de las células tumorales circulantes de pacientes con cáncer. Dado que este método puede proporcionar información sobre la heterogeneidad entre células individuales, se puede aplicar a todo tipo de suspensiones celulares que contengan subpoblaciones, como muestras de sangre, muestras de cultivos celulares o tejidos y órganos disociados. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando utilizamos un dispositivo de enriquecimiento in vivo que no era capaz de liberar células con el fin de realizar análisis posteriores.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos para la recolección de células individuales mediante microdisección láser o micromanipulación son difíciles de realizar con éxito porque el proceso de recolección de células individuales es propenso a la pérdida de células y requiere un alto nivel de experiencia. En un mililitro de medio de cultivo celular precalentado, vuelva a suspender las células marcadas con HT-29 CFSE y deje que se regeneren a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Para recolectar las células, centrifugar a 300 g durante tres minutos.

A continuación, vuelva a suspender el pellet celular en un mililitro de solución de tinción de ADN Hoechst 33342 lista para usar a 37 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, centrifugar la suspensión celular a 300 g durante tres minutos. A continuación, deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en cuatro mililitros de solución salina tamponada con fosfato 1X.

Luego, cuente el número de células con un hemocitómetro y verifique el marcaje de fluorescencia con un microscopio de fluorescencia. A continuación, centrifugar las células a 300 g durante tres minutos, desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet a aproximadamente 500.000 células por mililitro y colocar las células en hielo. En cinco mililitros de sangre periférica, agregue alrededor de 500 a 500.000 células y luego mezcle invirtiendo el tubo.

Después de quitar el cable del compartimiento de almacenamiento, retire la tapa de goma que sujeta el cable y lave el cable con solución salina tamponada con fosfato 1X y móntelo en la tapa del tubo. Luego, incube el tubo en un mezclador de rodillos inclinados a cinco rotaciones por minuto durante 30 minutos a temperatura ambiente. Después de la incubación, enjuague el alambre con solución salina tamponada con fosfato 1X tres veces.

Luego, guarde el alambre en un tubo de 15 mililitros que contenga solución salina tamponada con fosfato 1X en la oscuridad. Dibuje un área rectangular en un portaobjetos de vidrio con un bolígrafo de grasa, luego agregue 500 microlitros de solución salina tamponada con fosfato 1X. Para sumergir la parte funcional del alambre en solución salina tamponada con fosfato 1X, doble la parte no funcional del alambre y colóquela en el portaobjetos de vidrio.

Para contar el número de celdas capturadas, inspeccione visualmente ambos lados del cable. Después de inspeccionar, transfiera el cable nuevamente al tubo de 15 mililitros con solución salina tamponada con fosfato 1X y manténgalo en la oscuridad. En un mililitro de solución salina tamponada con fosfato 1X, disuelva cuatro miligramos del componente del tampón de liberación, luego filtre la solución a través de un filtro estéril de 0,2 micrómetros para obtener el tampón listo para usar.

A continuación, caliente el tampón de liberación a 37 grados centígrados durante cinco minutos. Una vez calentado, transfiera 1,6 mililitros de tampón de liberación para llenar completamente un tubo de reacción de 1,5 mililitros. A continuación, incube la parte funcional del alambre en el tampón de liberación a 37 grados centígrados en un baño de agua durante 20 minutos.

Después de la incubación, coloque el alambre en un agitador a 500 rotaciones por minuto durante 15 minutos. A continuación, centrifugar el alambre a 300 g durante 10 minutos. Una vez finalizada la centrifugación, retire el alambre del tubo, cierre la tapa y vuelva a centrifugar el tubo a 300 g durante 10 minutos.

Para disminuir el volumen de la suspensión celular, deseche todos menos 100 microlitros de sobrenadante para la micromanipulación o 300 microlitros para la posterior citocentrifugación y microdisección láser. Luego, proceda rápidamente al muestreo de una sola célula. Para la micromanipulación, transfiera los 100 microlitros completos de suspensión celular a un portaobjetos de vidrio.

Luego, coloque el portaobjetos de vidrio en un microscopio equipado con un micromanipulador y deje que las células se asienten durante cinco minutos. A continuación, en tubos de PCR de 0,2 mililitros, pipetear dos microlitros de mezcla maestra de lisis celular y transferir a hielo. Utilice el micromanipulador para recolectar una sola célula en un microlitro de solución salina tamponada con fosfato 1X.

Luego, transfiera la celda directamente a dos microlitros de mezcla maestra de lisis celular. Utilice un microfuger de sobremesa para centrifugar rápidamente las muestras a 2.000 g durante tres segundos para recoger el líquido en el fondo del tubo. A continuación, transfiera la muestra a hielo y proceda a la amplificación del genoma completo basada en un adaptador-enlazador.

Aspire solo una celda usando un microlitro de tampón como máximo. Al transferir la célula a la solución de lisis, asegúrese de ver burbujas que surgen de la solución, lo que indica que se ha transferido todo el volumen aspirado. Para la microdisección láser, citocentrífugo la totalidad de los 300 microlitros de suspensión celular en un portaobjetos recubierto de membrana a 300 g durante cinco minutos.

A continuación, coloque el portaobjetos recubierto de membrana en un microscopio capaz de realizar microdisecciones con láser. A continuación, pipetee 4,5 microlitros de mezcla maestra de lisis celular en la tapa del tubo de PCR de 0,2 mililitros. Coloque la tapa sobre la muestra y coseche una sola célula mediante microdisección láser.

Inmediatamente después, compruebe si hay células aisladas en el tapón de PCR, retire el tubo de PCR del microscopio de microdisección láser y cierre el tubo. Recoja todo el líquido en el fondo del tubo con un giro corto. Transfiera la muestra en hielo y proceda a la amplificación del genoma completo basada en adaptador-enlazador.

Asegúrese de recuperar la célula microdiseccionada con láser. Por lo tanto, es importante cubrir todo el tapón del tubo con la solución de lisis. Después de la microdisección, revise la tapa del tubo para detectar la presencia de la célula.

Para mostrar las células teñidas con CFSE y Hoechst 33342, se tomaron imágenes de inmunofluorescencia antes de cargar el cable, durante la unión de las células al cable, luego se separaron del cable y, finalmente, en el portaobjetos. Las imágenes de inmunofluorescencia de las células antes de la carga muestran una tinción nucleica brillante en azul, mientras que el citoplasma de las células muestra una tinción CFSE verde con una intensidad intercelular heterogénea. También se observa un patrón de tinción similar para las células que se unen y posteriormente se separan del alambre.

Para comprobar la calidad de los productos de amplificación del genoma completo, se utilizó un gel de agarosa al 1%. El gel de agarosa muestra un frotis de ADN que oscila entre 0,2 y más de 1 kilobase para los productos de PCR de amplificación del genoma completo. Los productos de PCR de control de calidad 4plex obtenidos de una sola célula producen productos de 100, 200, 300 y 400 pares de bases.

Los productos que muestran menos de tres bandas se excluyen de un análisis posterior. Una vez dominada, esta técnica permite el aislamiento de células individuales de suspensiones celulares en cuatro horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las células sumergidas en el tampón, especialmente durante el tiempo que las células están conectadas al cable para evitar dañarlas.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar métodos de análisis como la hibridación genómica comparativa de área, la secuenciación de próxima generación y la PCR específica del objetivo para caracterizar células individuales en función de las variaciones y mutaciones del número de copias. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar y recuperar células de suspensiones celulares utilizando un cable funcionalizado y cómo tomar muestras de células individuales para múltiples análisis genéticos moleculares posteriores. No olvide que trabajar con sangre humana presenta la posibilidad de infección, por lo que el uso de guantes y una bata de laboratorio son obligatorios mientras se realiza este procedimiento.