Name: ShRNAs combinados pantalla para reactivación de MeCP2 en el cromosoma de X inactivo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Aprende a identificar reguladores de la inactivación del cromosoma X utilizando shRNA y secuenciación de próxima generación en fibroblastos de tendón de ratón. Este protocolo permite estudiar el papel de MeCP2 en la regulación génica.

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Agradecemos a Ross Dickins de la Universidad de Melbourne para proporcionar amablemente la biblioteca shRNA utilizada en la pantalla. Este trabajo fue financiado por Rett síndrome Research Trust (A.B.).

Todos los pasos que involucran animales se llevaron a cabo utilizando protocolos de actuación aprobados por el Fred Hutchinson cáncer Research Center institucional Animal cuidado y el Comité uso (IACUC). No reactivos utilizados aquí conocen a riesgos significativos para la salud humana a excepción de la 5-azacitidina (5-AZA).
1. generar una línea de celular de reportero con MeCP2- LUC-HR transgen en el Xi
<ol><li>
Preparación de fibroblastos de ratón tendón de una hembra X /XMeCP2-LUC-HR MeCP2 ratón
	<ol>
<li>Eutanasia a un día de 10-12-vieja hembra X /XMeCP2-LUC-HRratón deMeCP2 .</li>
		<li>Usando las tijeras de disección recta, hacer una incisión circunferencial a través de la piel de la porción proximal de la cola.</li>
		<li>Sosteniendo el cadáver cerca de la base de la cola, tirar de la piel de ratón para exponer la porción fibrocartilaginous de la cola. Retire y corte el terminal 10 mm del tejido expuesto en 1 mm largos fragmentos utilizando un bisturí quirúrgico.</li>
		<li>Transferencia el tejido fragmentado para un 15 mL cónico del tubo que contiene 5 mL de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM) suplementado con 1 U/mL penicilina, estreptomicina μg/mL 1 y colagenasa 1,5 mg/mL, previamente filtradas por 0,45 μm y filtros de malla de entonces 0.2 μm. Incubar durante 3-4 h a 37 ° C con rotación continua.</li>
		<li>Centrifugar la muestra a temperatura ambiente a 500 x g durante 10 minutos Resuspender el precipitado en 10 mL de DMEM suplementado con suero bovino fetal 10%, 1 U/mL de penicilina y 1 estreptomicina μg/mL (DMEM-10) y la placa en una placa de cultivo de tejidos bien 6. Las células de paso una vez y ampliar a una placa de 10 cm antes de proceder al siguiente paso.</li>
		<li>Inmortalizar las células mediante la realización de una transducción de señales con un vector de expresión llevando oncogenes virales de VPH-16 (E6/E7), como se describe previamente7.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Selección de clones de células individuales y caracterización de la expresión del reportero de MeCP2
	<ol>
<li>Cosechar las células de una placa de 10 cm. En primer lugar, aspirar los medios de comunicación, añadir 1 mL de tripsina 0,05%-EDTA e incubar 2-5 minutos a 37 ° C. Saciar con 9 mL de DMEM-10 y recoger las células resuspendidas en un tubo cónico de 15 mL.</li>
		<li>Diluir las células con DMEM-10 a una concentración final de 1 celda/100 μl. transferencia para placas de 96 pocillos por Pipetear 100 μl de la suspensión en cada pozo.</li>
		<li>Incubar a 37 ° C hasta que los pozos son confluentes, lo que pueden tardar hasta 2-3 semanas. Sustituir los medios de comunicación con DMEM fresco-10 cada 3-5 días. Confluente, movilizar las células con 20 μl de 0.05% tripsina-EDTA por pozo y separar en dos conjuntos duplicados de placas de 96 pocillos.</li>
		<li>Utilice un juego de placas para ensayo de actividad de luciferasa. Utilice un kit de ensayo de luciferasa de luciérnaga homogéneo que no requiere el retiro de los medios de comunicación. Seguir el protocolo incluido en el kit.</li>
		<li>Utilizar los resultados del paso 1.2.4 para seleccionar clones con ninguna actividad de luciferasa detectable del conjunto restante de las placas. Ampliar estos clones para placas de 24 pocillos y luego 6-bien.</li>
		<li>Realizar lo mismo para un clon con la mayor actividad de luciferasa; Esto se utilizará como control positivo para la validación.</li>
		<li>Cosecha una alícuota de cada pocillo de la placa de 6 pozos para un Western blot. Movilizar las células con 200 μL de 0.05% tripsina-EDTA. Incubar durante 2-5 min a 37 ° C. Saciar con 2 mL de DMEM-10 y transferir la mitad de las células al tubo de centrífuga de 1.5ml. Lave las células una vez con PBS antes de lisis para Western blot. Alternativamente, transferir la mitad de las células a otra placa de 6 pozos. Cuando las células se unen a la parte inferior de la placa, enjuague con PBS y lyse para Western blot.</li>
		<li>Realizar un Western blot con anticuerpos anti-MeCP2 para confirmar que las células negativas luciferase expresan, mientras que las células positivas de luciferasa no expresan tipo MeCP2 del cromosoma X activo; seguir el protocolo descrito previamente8. Usar tejido cerebral lisado de cualquier ratón de tipo salvaje como un control positivo.</li>
		<li>Varios clones negativos en 2 x 105 células/pozo en una placa de 6 pozos de la placa. Tratar una vez con 10 μm 5-AZA, incuban durante 72 h sin cambiar los medios de comunicación y análisis para la actividad de luciferasa como se describe en el paso 1.2.3.</li>
		<li>Elija una copia negativa (clon del Xi) que ganó actividad de luciferasa con 5-AZA y comenzar a expandirse a varias placas de 10 cm. Congelar los clones restantes negativos en nitrógeno líquido como una copia de seguridad. El clon positivo (Xa clon) puede ser mantenido en el cultivo de tejidos o congelado hasta su uso posterior.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. proyección de la biblioteca de la reactivación con higromicina B selección
<ol><li>
Infectar el clon de prueba, aplicación de selección y recolección de ADN para secuenciación
	<ol>
<li>Obtener concentrados virales de retrovirales construcciones expresando horquillas de una biblioteca de shRNA o producir concentrado sobrenadante viral usando el protocolo incluido en la biblioteca deseada.</li>
		<li>Antes de proceder con la pantalla, valorar la biblioteca (con un marcador GFP, si está disponible). Objetivo para una multiplicidad de infección entre 0.3 y 0.5. Nota: Realice al menos cuatro pantallas independientes para minimizar falsas tasas positivas. Utilice 20 placas por pantalla para obtener cobertura de 100-fold de la biblioteca para mantener una adecuada representación de horquillas para el pelo y evitar caídas al azar9. Sin embargo, pantalla de selección positiva y un tamaño de la gran biblioteca, es probable que bastaría con una cobertura menor.</li>
		<li>En la mañana, placa de 1 x 106 células de Xi sobre placas de cultivo de tejidos de 10 cm.</li>
		<li>En la tarde, infectar a las placas mediante la sustitución de los medios de comunicación con DMEM fresco-10 que contiene 5-10 μg/mL de polibreno y el sobrenadante viral. Use la cantidad de sobrenadante viral determinada en el paso 2.1.2.</li>
		<li>Después de 18-24 h, Aspire los medios de comunicación y añadir 10 mL de DMEM-10 fresco a cada plato. Cultura para otra 48 h.</li>
		<li>En la mañana, movilizar las células con 1 mL de tripsina 0,05%-EDTA por placa y saciar con 9 mL de DMEM-10 por placa. Pase la suspensión a través de un filtro de malla de 100 μm. Las suspensiones filtradas de la piscina juntos y dos conjuntos de placas de 10 cm a 1 x 106 células/placa de la semilla.</li>
		<li>En la tarde, vuelva a colocar los medios de comunicación en un juego de placas con DMEM-10 que contienen 15 μg/mL de higromicina B (día 0). En el otro juego, reemplace los medios DMEM fresco-10 solamente.</li>
		<li>Después de 48 horas, movilizar las células untreated juego de placas con 1 ml de tripsina 0,05%-EDTA. Incubar durante 2-5 min a 37 ° C. Saciar con 9 mL de DMEM-10. Transferir las células a tubos cónicos de 15 ml y centrifugar a 500 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y proceder de inmediato con la extracción de ADN de los pellets. Por otra parte, la piscina las células en los tubos más grandes antes del paso de centrifugación.</li>
		<li>Extracto de ADN utilizando una mezcla de fenol y chroroform y precipitar el ADN con sodio acetato y frío el etanol como se describió anteriormente10. Las muestras de ADN individuales de preselección de la piscina y almacenar a-20 ° C hasta su uso posterior.</li>
		<li>Continuar el cultivo selección de la B de Higromicina para 4 días más. Reponer los medios de selección con fresco DMEM-10 con higromicina B después de 2 días.</li>
		<li>En el día 7, sustituir los medios de selección con DMEM fresco-10 solamente. Permite 2 a 4 días para la recuperación y luego cosechar las células como se describe en el paso 2.1.8. Proceder a la extracción de ADN como se describe en el paso 2.1.9.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Identificación de horquillas enriquecidos en las muestras post-selección
	<ol>
<li>Contexto del uso 5' (5'-ATCGTTGCCTGCACATCTTGG-3') y 3' reverse loop primers (5'-ACATCTGTGGCTTCACTA-3') para amplificar la mitad-reguladores de pre- y post-selección de muestras de ADN. Uso todos extrajeron ADN en reacciones de PCR independientes con 100-200 ng de ADN por reacción. Nota: Estos contexto cartilla de 5' y 3' bucle inverso cartillas corresponden a la secuencia de miR-30 contexto aguas arriba de la inserción de shRNA y la secuencia en el bucle de shRNA, respectivamente. Bibliotecas diferentes requieren diferentes oligos. Ajustar medidas de purificación para aislar diferentes tamaños según sea necesario.</li>
		<li>Uso selección del tamaño granos para eliminar cebadores, DNA genomic y recuperar productos de la PCR entre 100 y 200 BP siguen el protocolo incluido en las cuentas.</li>
		<li>Preparar una biblioteca de la secuencia a la secuencia de las horquillas de media. Generar por lo menos 50 millones Lee por pantalla. Seguir el protocolo apropiado para el kit de secuenciación y equipo. Nota: Lee 50 millones por pantalla provee 1000-fold representación de cada shRNAs en la biblioteca y aproximadamente 10 veces la cobertura de cada infección independiente (realizado en 100-fold representación de cada shRNAs), que asegura la representación adecuada de cada evento de infección.</li>
		<li>Enumerar cada shRNA usando un script en Perl que cuenta secuencias con los fósforos perfectos. Eligió shRNAs que lee por lo menos 10 en la piscina de preselección para su posterior análisis. Calcular los enriquecimientos como cocientes de post a preselección cuenta y determinar la tarifa falsa del descubrimiento (FDR) sobre la base de 1000 permutaciones. Eligieron los genes blanco de shRNAs con < 5% FDR como "hits" para más pruebas.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. validación de las horquillas identificadas ("hits")
<ol><li>
Lentivirus de empaquetado que contiene shRNAs identificado en la pantalla
	<ol>
<li>Semilla 8 x 106 FT 293 células por placa en placas de 10 cm.</li>
		<li>Al día siguiente, reemplazar los medios de comunicación con 9 mL de DMEM-10 sin antibióticos por placa; hacer esta 30 minutos antes de la transfección.</li>
		<li>Durante el intervalo de 30 minutos, preparar dos mezclas de transfección:<ol>
<li>Preparar mezcla 1 (por placa/shRNA; aumentar según el número total de shRNAs): 10 μl de 2 mg/mL polietilenimina (PEI) en 0,5 mL de medio esencial mínimo óptimo. Mezclar mediante pipeteo e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos.</li>
			<li>Preparar mezcla 2 (por shRNA): 4 μg del vector shRNA a empaquetar, 1,5 μg del vector VSV-G sobres (pMD2.G) y 2.5 μg del vector packaging (psPAX2), mezclan en 0,5 mL de medio esencial mínimo óptimo. Nota: Incluye un vector lentivirales vacío en el envase para uso en infecciones más adelante como control negativo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Añadir 0,5 mL de mezcla 1 a cada alícuota de la mezcla 2 y suavemente mezclar mediante pipeteo. Incubar en la oscuridad a temperatura ambiente durante 20 minutos.</li>
		<li>Aplique la mezcla en cada placa de paso 3.1.2 de forma gota a gota; Agitar la placa suavemente para mezclar.</li>
		<li>Al día siguiente, reemplazar los medios de comunicación con 5 mL de DMEM fresco-10.</li>
		<li>48 horas después de la inicial de la transfección, recoger el sobrenadante y pase a través de un filtro de 0,22 μm. Humedezca previamente el filtro con DMEM-10 para maximizar la recuperación.</li>
		<li>Alícuota del sobrenadante filtrado en cantidades ideales para infectar una placa de 6 pozos bien.</li>
		<li>Congelar las alícuotas a-80 ° C para su uso posterior, o proceder inmediatamente con la transducción de señales.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transducción de señales y pruebas de horquillas individuales para luciferase reporter reactivación y reactivación del gen MeCP2 de tipo salvaje en el Xi.
	<ol>
<li>En la mañana, placa de 1 x 105 Xi células/pozo en placas bien 6.</li>
		<li>En la tarde, infectar a las placas mediante la sustitución de los medios de comunicación con 2 mL de DMEM fresco-10 que contiene 5-10 μg/mL de polibreno y el lentivirales sobrenadante. Infectar un control con sobrenadante viral producido a partir de un vector lentivirales vacíelo.</li>
		<li>Al día siguiente, reemplazar los medios de comunicación con 2 mL de DMEM-10 puromicina conteniendo de 1 mg/mL. Cultura durante cuatro días.</li>
		<li>Sustituir los medios de comunicación con 2 mL de DMEM fresco-10 y permiten 48-72 h para la recuperación.</li>
		<li>Movilizar las células con 150 μL de 0.05% tripsina-EDTA. Incubar durante 2-5 min a 37 ° C. Saciar con 1,5 mL de DMEM-10. Transferir las células a tubos cónicos de 15 ml y centrifugar a 500 x g durante 10 minutos a temperatura ambiente.</li>
		<li>Retire los medios de comunicación y resuspender las células en 100 μl de tampón de lisis en el kit de ensayo de luciferasa. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos. Transferencia de los lisados blanco placa de 96 pocillos y de análisis para la actividad de luciferasa usando el protocolo incluido en el kit. Utilizar células Xa como Xi células infectadas con un vector lentivirales vacío como control negativo y control positivo. Nota: Evite exponer las placas blanco para luz fluorescente antes del ensayo; Esto reducirá el fondo y aumentar la sensibilidad del ensayo. El protocolo que proporciona en el kit de ensayo fue encontrado para ser más eficaz si se realiza en la oscuridad siempre que sea posible.</li>
		<li>Para determinar si la horquilla tenía un efecto en el nivel de expresión de MeCP2 en el cromosoma x activo, aislar ARN de células de tranduced Xi y medir nivel MeCP2 mRNA mediante PCR cuantitativa con cebadores diseñados para amplificar sólo tipo MeCP2 (F: 5'-TTCCATGCCAAGGCCAAACAG-3', R: 5'-CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC-3').</li>
		<li>
Opcional: Aumentar la sensibilidad del ensayo agregando 5-AZA a una concentración final de 0.2 μm, después de que las células se han recuperado de la selección de puromicina. Cultura las células 72 h sin reemplazar los medios de comunicación y luego del análisis para la actividad de luciferasa utilizando el kit de ensayo de luciferasa comercial.</li>
		<li>Medida de reactivación de la MeCP2 silenciado de tipo salvaje. Infectar células Xa, que albergan el tipo salvaje MeCP2 en la Xi, con el vector que contiene reguladores individuales, siguiendo los pasos de protocolo 3.2.1. -3.2.4. Aislar ARN de las células y medir nivel MeCP2 mRNA mediante PCR cuantitativa con cebadores diseñados para amplificar sólo tipo MeCP2 (F: 5 '- TTCCATGCCAAGGCCAAACAG - 3', R: 5' - CCCATAAGGAGAAGAGACAACAGC - 3').</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Amir, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rett+syndrome+is+caused+by+mutations+in+X-linked+MECP2%2C+encoding+methyl-CpG-binding+protein+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Rett syndrome is caused by mutations in X-linked MECP2, encoding methyl-CpG-binding protein 2.</a> Nat Genet. 23, 185-188 (1999).</li>
<li>Guy, J., Gan, J., Selfridge, J., Cobb, S., Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversal+of+neurological+defects+in+a+mouse+model+of+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Reversal of neurological defects in a mouse model of Rett syndrome.</a> Science. 315, 1143-1147 (2007).</li>
<li>Maduro, C., de Hoon, B., Gribnau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitting+the+Puzzle+Pieces%3A+the+Bigger+Picture+of+XCI%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Fitting the Puzzle Pieces: the Bigger Picture of XCI.</a> Trends Biochem Sci. 41, 138-147 (2016).</li>
<li>Disteche, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosage+compensation+of+the+sex+chromosomes+and+autosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Dosage compensation of the sex chromosomes and autosomes.</a> Semin Cell Dev Biol. 56, 9-18 (2016).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wild-type+microglia+do+not+reverse+pathology+in+mouse+models+of+Rett+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Wild-type microglia do not reverse pathology in mouse models of Rett syndrome.</a> Nature. 521, E1-E4 (2015).</li>
<li>Sripathy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screen+for+reactivation+of+MeCP2+on+the+inactive+X+chromosome+identifies+the+BMP%2FTGF-beta+superfamily+as+a+regulator+of+XIST+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Screen for reactivation of MeCP2 on the inactive X chromosome identifies the BMP/TGF-beta superfamily as a regulator of XIST expression.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 114, 1619-1624 (2017).</li>
<li>Foster, S. A., Galloway, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+papillomavirus+type+16+E7+alleviates+a+proliferation+block+in+early+passage+human+mammary+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Human papillomavirus type 16 E7 alleviates a proliferation block in early passage human mammary epithelial cells.</a> Oncogene. 12, 1773-1779 (1996).</li>
<li>Hnasko, T. S., Hnasko, R. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26160567">The Western Blot.</a> Methods Mol Biol. 1318, 87-96 (2015).</li>
<li>Strezoska, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+PCR+conditions+and+increased+shRNA+fold+representation+improve+reproducibility+of+pooled+shRNA+screens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Optimized PCR conditions and increased shRNA fold representation improve reproducibility of pooled shRNA screens.</a> PLoS One. 7, e42341(2012).</li>
<li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+High-Molecular-Weight+DNA+from+Mammalian+Tissues+Using+Proteinase+K+and+Phenol%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of High-Molecular-Weight DNA from Mammalian Tissues Using Proteinase K and Phenol.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2017, (2017).</li>
<li>Goto, Y., Takagi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tetraploid+embryos+rescue+embryonic+lethality+caused+by+an+additional+maternally+inherited+X+chromosome+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tetraploid embryos rescue embryonic lethality caused by an additional maternally inherited X chromosome in the mouse.</a> Development. 125, 3353-3363 (1998).</li>
<li>Csankovszki, G., Nagy, A., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergism+of+Xist+RNA%2C+DNA+methylation%2C+and+histone+hypoacetylation+in+maintaining+X+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergism of Xist RNA, DNA methylation, and histone hypoacetylation in maintaining X chromosome inactivation.</a> J Cell Biol. 153, 773-784 (2001).</li>
<li>Minajigi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomes.+A+comprehensive+Xist+interactome+reveals+cohesin+repulsion+and+an+RNA-directed+chromosome+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromosomes. A comprehensive Xist interactome reveals cohesin repulsion and an RNA-directed chromosome conformation.</a> Science. 349, (2015).</li>
<li>McHugh, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Xist+lncRNA+interacts+directly+with+SHARP+to+silence+transcription+through+HDAC3%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3.</a> Nature. 521, 232-236 (2015).</li>
<li>Bhatnagar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+pharmacological+reactivation+of+the+mammalian+inactive+X+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic and pharmacological reactivation of the mammalian inactive X chromosome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 12591-12598 (2014).</li>
<li>Minkovsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mbd1-Atf7ip-Setdb1+pathway+contributes+to+the+maintenance+of+X+chromosome+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">The Mbd1-Atf7ip-Setdb1 pathway contributes to the maintenance of X chromosome inactivation.</a> Epigenetics Chromatin. 7, 12(2014).</li>
<li>Minkovsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+screen+of+inactive+X+chromosome+reactivation+identifies+the+enhancement+of+DNA+demethylation+by+5-aza-2%27-dC+upon+inhibition+of+ribonucleotide+reductase%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">A high-throughput screen of inactive X chromosome reactivation identifies the enhancement of DNA demethylation by 5-aza-2'-dC upon inhibition of ribonucleotide reductase.</a> Epigenetics Chromatin. 8, 42(2015).</li>
</ol>

Dr. Leko contribuyó a este artículo como un empleado del Fred Hutchinson Cancer Research Center.  Las opiniones expresadas son sus propia y no necesariamente representan las opiniones de los institutos nacionales de salud o el gobierno de Estados Unidos

En nuestro estudio reciente6, hemos generado una línea celular murina con luciferasa y genes de resistencia a Higromicina fusionado a MeCP2 en el Xi y transduced con una biblioteca de > 60.000 shRNAs dirigidos a > 25.000 genes. Se encontraron 30 genes cuya ventaja en la supervivencia conferida precipitación en higromicina B selección, sugiriendo su papel en el control de MeCP2 y silenciamiento del cromosoma x. Estos resultados fueron validados por transducción de la línea celular...

Una las formas más comunes de deficiencia mental hereditaria en las mujeres, el síndrome de Rett, es causada por mutaciones heterozigóticas en MeCP2, un gen del cromosoma x que codifica una proteína esencial para la función neuronal normal1. Un enfoque potencial para el tratamiento de este trastorno sería la reactivación del alelo tipo salvaje de MeCP2 en la Xi, como restauración de expresión MeCP2 fue demostrado revertir déficits neurológicos en un modelo de ratón de esta enfermedad1, 2 , 4. sin embargo, silenciamiento epigenético de uno de los dos cromosomas en las células femeninas de X se mantiene bien durante toda la vida de un organismo3,4, y sólida reactivación de un gen Xi probablemente requeriría una mayor interrupción en múltiples vías de regulación epigenéticas.
Para identificar los factores necesarios para el mantenimiento del silenciamiento de MeCP2 , primero desarrollamos un modelo de ratón transgénico con una fusión de genes de resistencia MeCP2- luciferasa - Higromicina (MeCP2-LUC-HR) en uno de los dos cromosomas X (X MeCP2-LUC-HR/XMeCP2)5. Aunque el MeCP2 expresada desde la construcción de la fusión demostró para ser inestable y dio lugar a una pérdida de función, fenotípicamente mímico eliminación de MeCP2 en varones hemizygous (X /YMeCP2-LUC-HR), la expresión de los genes del reportero era fácilmente perceptible en un patrón consistente con la expresión endógena de MeCP25. A continuación genera clones del fibroblasto inmortalizado con el constructo en el cromosoma x inactivo o activo y confirmó que el ex expresó tipo MeCP2 y no la construcción de reportero; el inverso era verdad para estos últimos. Cuando se expone a un ADN desmetilantes agente conocido derogar silenciamiento génico, 5-azacitidina (5-AZA), las células con el reportero de la Xi ("células de reportero") ganaron la actividad en un ensayo de bioluminiscencia, que indica que la construcción podría ser reactivado y por lo tanto utilizado para la investigación genética.
A continuación desarrollamos una pantalla genética de alto rendimiento para los reguladores del silenciamiento de MeCP2 . La línea celular de reportero primero fue infectada con una biblioteca retroviral que contiene > 60.000 diferentes shRNAs dirigidos a > 25.000 genes en el genoma de ratón5,6y después sometida a higromicina B selección. Se comparó la frecuencia de horquilla en pre- y post selección muestras utilizando la siguiente secuencia de generación, como reportero de reactivación confiere ventaja del crecimiento en la selección de higromicina B y dio lugar a enriquecimiento de horquillas responsables. Usando este acercamiento, identificado 30 genes implicados en MeCP2 silenciamiento y posteriormente confirmó los resultados de medir su actividad de luciferasa y transducción de las células de reportero con reguladores individuales.

<table><tbody><tr><td>293FT Línea celular</td><td>Invitrogen</td><td>R700-07</td><td></td></tr><tr><td>5-Azacitidina</td><td>Sigma</td><td>A2385-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-MECP2</td><td>Millipore</td><td>07-013</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa</td><td>Sigma</td><td>C2674-1G</td><td></td></tr><tr><td>Corning Microplacas de poliestireno blanco sólido de 96 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-336</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Detención de la expresión Vector retroviral adaptado al microARN (pMSCV)</td><td>Open Biosystems</td><td>EAV4679</td><td></td></tr><tr><td>Detención de la expresión pSM2 Biblioteca de shRNAmir Open</td><td>Biosystems</td><td>RMM3796</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Fisherbrand</td><td>03-600-511</td><td></td></tr><tr><td>HiSeq 2500</td><td>Illumina</td><td>SY&ndash; 401 y ndash; 2501</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Higromicina B</td><td>Calbiochem</td><td>400051-1MU</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de ensayo de luciferasa Bright-Glo</td><td>Promega</td><td>E2610</td><td>Ensayo homogéneo para el cribado de colonias</td></tr> Sistema <tr>de<td>ensayo de luciferasa</td><td>Promega</td><td>E4530</td><td>Ensayo no homogéneo para el ensayo de horquillas individuales</td></tr><tr><td>Luminómetro TopCount NXT</td><td>Perkin Elmer</td><td>N/A</td><td>O luminómetro similar</td></tr><tr><td>MiSeq Reactivo Kit v2</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2001</td><td>Kit de uso compatible con su equipo</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td>VSV-G vector de envoltura</td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina</td><td>Polysciences</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2</td><td>Addgene</td><td>#12260</td><td>Vector de embalaje</td></tr><tr><td>Puromicina</td><td>Gibco</td><td>A11138-02</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,05%), rojo fenol</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr></tbody></table>

shrnas combinados pantalla para reactivación de mecp2 en el cromosoma de x inactivo

Pooled shRNA Screen for Reactivation of MeCP2 on the Inactive X Chromosome

Avance genéticos pantallas usando genes del reportero insertados en la heterocromatina se han utilizado para investigar los mecanismos de control epigenético en organismos modelo. Tecnologías incluyendo horquilla corta RNAs (shRNAs) y agrupadas regularmente otro corto palindrómico repeticiones (CRISPR) han permitido que tales pantallas en células de mamíferos diploides. Aquí describimos una pantalla shRNA a gran escala de los reguladores de la inactivación del X-cromosoma (XCI), utilizando una línea celular murina con luciferasa de luciérnaga y genes de resistencia a Higromicina golpeó en el c-término de la proteína de unión a CpG de metilo 2 (MeCP2) gene en el cromosoma x inactivo (Xi). Reactivación de la construcción en la línea celular de reportero confiere ventaja de supervivencia en selección de higromicina B, lo que nos permite una biblioteca grande de shRNA y identificar reguladores que reactivaron el reportero midiendo su selección posterior enriquecimiento utilizando secuenciación de próxima generación. Las horquillas enriquecidas entonces fueron validadas individualmente por prueba de su capacidad para activar el reportero de luciferasa en Xi.

Fibroblastos de ratón del tendón se cosecharon de descrita X /XMeCP2-LUC-HRratón hembra deMeCP2 , inmortalizado por transducción retroviral de oncogenes E6 y E7 de HPV-16 virus7, clonado usando dilución limitante y probados para actividad de luciferasa y expresión del salvaje-tipo proteína MeCP2 (figura 1A y 1B). Actividad de luciferasa fue robusto si el reportero estaba en Xa e imperceptibles si en Xi; la expresión nativa de MeCP2 exhibieron un patrón ...

Divulgamos una pequeña horquilla RNA (shRNA) y el siguiente protocolo basado en la secuencia de generación para la identificación de reguladores de la inactivación del cromosoma x en una línea celular murina con luciferasa de luciérnaga y genes de resistencia a Higromicina fusionado a la metil CpG Unión proteína 2 ( MeCP2) gen en el cromosoma X inactivo.

ShRNAs combinados pantalla para reactivación de MeCP2 en el cromosoma de X inactivo

Forward genetic screens using reporter genes inserted into the heterochromatin have been extensively used to investigate mechanisms of epigenetic control ...

Comience este procedimiento con la preparación de fibroblastos tendinosos de ratón, como se describe en el protocolo de texto. Recoja las células de una placa de 10 centímetros aspirando primero el medio. A continuación, añada un mililitro de EDTA al 0,05% de tripsina e incube durante dos a cinco minutos a 37 grados centígrados.Después de la incubación, enfríe la tripsina con nueve mililitros de DMEM-10 y recoja las células resuspendidas en un tubo cónico de 15 mililitros. Diluir las células con DMEM-10 hasta una concentración final de una célula por cada 100 microlitros. A continuación, transfiera las celdas a placas de 96 pocillos pipeteando 100 microlitros de la suspensión en cada pocillo.Incubar las celdas a 37 grados centígrados hasta que los pocillos confluyan, lo que puede tardar hasta dos o tres semanas. Reemplace el medio con DMEM-10 nuevo cada tres a cinco días. Cuando confluyan, movilice las células con 20 microlitros de tripsina EDTA al 0,05% por pocillo y divídalas en dos conjuntos duplicados de placas de 96 pocillos.Ensayo de la actividad de la luciferasa en un juego de placas. Utilice un ensayo de luciferasa de luciferasa de luciérnaga homogéneo que no requiera extra

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Aquí se utiliza una biblioteca LentiPlex humano común y tradicionales métodos de secuenciación de genes para identificar los objetivos de promover la supervivencia celular. Demostramos cómo configurar y deconvolute una pantalla LentiPlex y validar los resultados.

LentiPlex MISIÓN combinados de detección del shRNA biblioteca en células de mamífero

Heterotopia nodular periventricular (PNH) es la forma más común de malformación del desarrollo cortical (MCD) en la edad adulta, pero su base genética sigue siendo desconocido en los casos más esporádicos. Recientemente hemos desarrollado una estrategia para identificar genes candidatos novela de MCDs y confirmar directamente su papel causativo en vivo.

Una nueva estrategia Array-CGH, secuenciación del exoma todo y electroporación en el útero en roedores para identificar los Genes causales de las malformaciones del cerebro

Aquí, presentamos un protocolo detallado para la identificación de eventos de recombinación homóloga que se produjeron en células madre embrionarias del ratón mediante Southern blot o PCR. Este método es ejemplificado por la generación de modelos UROLOGICAL miosina II reemplazo genético ratón tecnología tradicional embrionario basada en células madre homólogo mediada por la recombinación dirigida a.

Identificación de eventos de recombinación homóloga en células madre embrionarias del ratón mediante Southern blot y reacción en cadena de polimerasa

Aquí describimos un protocolo para generar un modelo murino femenino viable con inactivación cromosómica no aleatoria, es decir, el cromosoma X de herencia maternalmente está inactivo en el 100% de las células. También describimos un protocolo para probar la viabilidad, la tolerabilidad y la seguridad de la reactivación farmacológica del cromosoma X inactivo in vivo.

Un modelo de ratón no aleatorio para la reactivación farmacológica de Mecp2 en el cromosoma X inactivo

Un ensayo preciso y robusto basado en la reacción en cadena de la polimerasa para cuantificar las repeticiones de trinucleótido de citosina-guanina-guanina en el gen frágil X de retraso mental-1 facilita el diagnóstico molecular y el cribado del síndrome de X frágil y las repeticiones X frágiles trastornos con menor tiempo de respuesta e inversión en equipos.

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El inmunoensayo de electroquimioluminiscencia (ECLIA) es un enfoque novedoso para la detección cuantitativa de variantes de proteína MeCP2 endógenas y aplicadas exógenamente, que produce mediciones reproducibles altamente cuantitativas, precisas y ibles con un error bajo de intra e interensayo en un amplio rango de trabajo. Aquí, se describe el protocolo para el MeCP2-ECLIA en un formato de 96 pozos.

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Los errores meióticos en las sinapsis y la recombinación son comunes en los ovocitos de mamíferos. El análisis riguroso de las proteínas involucradas en estos procesos es esencial para comprender cómo y por qué la ovogénesis a menudo sale mal. Las técnicas aquí presentadas permiten un seguimiento exhaustivo de la recombinación y las sinapsis para evaluar la calidad de los ovocitos en ratones.

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Aprende a identificar reguladores de la inactivación del cromosoma X utilizando shRNA y secuenciación de próxima generación en fibroblastos de tendón de ratón. Este protocolo permite estudiar el papel de MeCP2 en la regulación génica.

ShRNAs combinados pantalla para reactivación de MeCP2 en el cromosoma de X inactivo

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