ShRNAs combinados pantalla para reactivación de MeCP2 en el cromosoma de X inactivo

Comience este procedimiento con la preparación de fibroblastos tendinosos de ratón, como se describe en el protocolo de texto. Recoja las células de una placa de 10 centímetros aspirando primero el medio. A continuación, añada un mililitro de EDTA al 0,05% de tripsina e incube durante dos a cinco minutos a 37 grados centígrados.

Después de la incubación, enfríe la tripsina con nueve mililitros de DMEM-10 y recoja las células resuspendidas en un tubo cónico de 15 mililitros. Diluir las células con DMEM-10 hasta una concentración final de una célula por cada 100 microlitros. A continuación, transfiera las celdas a placas de 96 pocillos pipeteando 100 microlitros de la suspensión en cada pocillo.

Incubar las celdas a 37 grados centígrados hasta que los pocillos confluyan, lo que puede tardar hasta dos o tres semanas. Reemplace el medio con DMEM-10 nuevo cada tres a cinco días. Cuando confluyan, movilice las células con 20 microlitros de tripsina EDTA al 0,05% por pocillo y divídalas en dos conjuntos duplicados de placas de 96 pocillos.

Ensayo de la actividad de la luciferasa en un juego de placas. Utilice un ensayo de luciferasa de luciferasa de luciérnaga homogéneo que no requiera extracción de medios, siguiendo el protocolo incluido con el kit de ensayo de luciferasa. Utilice los resultados del ensayo para seleccionar clones sin actividad de luciferasa detectable del conjunto restante de placas.

Expanda estos clones primero a una placa de 24 pocillos y luego a una placa de seis pocillos. Realice lo mismo para un clon con la mayor actividad de luciferasa. Esto se utilizará como control positivo con fines de validación.

Después de la expansión en la placa de seis pozos, coseche una alícuota de cada pozo para una mancha occidental. Movilizar las células con 200 microlitros de 0,05% de tripsina EDTA. Incubar las células durante dos a cinco minutos a 37 grados centígrados.

Apague las celdas con dos mililitros de DMEM-10 y transfiera la mitad de las celdas a otra placa de seis pocillos. Espere hasta que las celdas se adhieran a la parte inferior de la placa. A continuación, lave las células una vez con PBS antes de la lisis para la Western blot.

Coloque varios clones negativos a 0,2 millones de células por pocillo en una placa de seis pocillos. Tratar las células una vez con 5-azacitidina 10 micromolares. A continuación, incubar durante 72 horas sin cambiar el medio antes de analizar la actividad de la luciferasa, como antes.

A continuación, elija un clon negativo que haya obtenido actividad de luciferasa con 5-azacitidina para la pantalla y comience a expandirlo a múltiples placas de 10 centímetros. Congele los clones negativos restantes en nitrógeno líquido como respaldo. El clon positivo puede mantenerse en el cultivo de tejidos o congelarse hasta su uso posterior.

Por la mañana, coloque un millón de células X inactivas en placas de cultivo de tejidos de 10 centímetros. Por la tarde, infecte las placas reemplazando el medio con DMEM-10 fresco que contenga una cantidad predeterminada de sobrenadante viral y de cinco a 10 microgramos por mililitro de polibreno. Después de 18 a 24 horas, aspire el medio y agregue 10 mililitros de DMEM-10 fresco a cada placa.

Placas de cultivo durante otras 48 horas. Por la mañana, movilice las células con un mililitro de EDTA al 0,05% de tripsina por placa y enfríe las células con 9 mililitros de DMEM-10 por placa. Pase la suspensión a través de un filtro de malla de 100 micras.

Junte las suspensiones filtradas y siembre dos juegos de placas de 10 centímetros a un millón de células por placa. Por la tarde, reemplace el medio en un juego de placas con DMEM-10 que contiene 15 microgramos por mililitro de higromicina B.In el otro juego, reemplace el medio con DMEM-10 nuevo solamente. Después de 48 horas, movilice las células de las placas de higromicina B sin tratar utilizando un mililitro de tripsina EDTA al 0,05%.

Incubar de dos a cinco minutos a 37 grados centígrados. A continuación, apague las células con 9 mililitros de DMEM-10. Extraiga las muestras individuales y proceda inmediatamente con la extracción del ADN.

Continúe cultivando el set de selección de higromicina B durante seis días más, reponiendo los medios de selección con DMEM-10 fresco que contenga higromicina B cada dos días. En el sexto día, reemplace el medio de selección solo con DMEM-10 nuevo. Espere cuatro días para la recuperación y luego coseche el ADN de la muestra posterior a la selección como antes.

Proceda a identificar las horquillas enriquecidas en las muestras posteriores a la selección, como se describe en el protocolo de texto. Para validar los resultados, primero siembre ocho millones de células de 293 pies por placa en placas de 10 centímetros. Al día siguiente, reemplace el medio con nueve mililitros de DMEM-10 sin antibióticos por placa 30 minutos antes de la transección.

A continuación, agregue 0,5 mililitros de mezcla de transfección uno a cada alícuota de mezcla de transfección dos, y mezcle suavemente mediante pipeteo. Luego incube la mezcla a temperatura ambiente durante 20 minutos. Aplique la mezcla en cada plato gota a gota y gire el plato suavemente para mezclar.

Al día siguiente, reemplace el medio con cinco mililitros de DMEM-fresco 10.48 horas después de la transfección inicial, recoja el sobrenadante lentiviral y páselo a través de un filtro de 0.22 micrones que ha sido prehumedecido con DMEM-10 para maximizar la recuperación. A la mañana siguiente, coloque 0,1 millones de células X inactivas por pocillo en seis placas de pocillos. Por la tarde, infecte las placas reemplazando el medio con dos mililitros de DMEM-10 fresco que contenga sobrenadante lentiviral y de cinco a 10 microgramos por mililitro de polibreno.

Infectar un pozo de control con sobrenadante viral producido a partir de un vector lentiviral vacío. Al día siguiente, reemplace el medio con dos mililitros de DMEM-10 que contengan un miligramo por mililitro de puromicina. Utilice la selección durante cuatro días.

Después de cuatro días, reemplace el medio con dos mililitros de DMEM-10 nuevo y espere de 48 a 72 horas para la recuperación. Después de movilizar las células con 150 microlitros de 0,05% de tripsina EDTA, incubarlas durante dos a cinco minutos a 37 grados centígrados. Apague las células con 1,5 mililitros de DMEM-10 antes de transferirlas a tubos cónicos y centrifugar las células a temperatura ambiente a 500 veces G durante 10 minutos.

Retire el medio y vuelva a suspender las células en 100 microlitros de tampón de lisis provisto en el kit de ensayo de luciferasa. Incuba la suspensión a temperatura ambiente durante cinco minutos. Después de cinco minutos, transfiera la suspensión a una placa blanca de 96 pocillos.

Realice el ensayo en el cuarto oscuro, siguiendo el protocolo incluido en el kit. Utilice las células X activas como control positivo y las células X negativas infectadas con un vector lentiviral vacío como control negativo. Los clones de fibroblastos de tendones de ratón inmortalizados muestran una actividad luciferasa de luciferasa de luciérnaga positiva o negativa, consistente con la ubicación del reportero en el cromosoma X activo o inactivo, respectivamente.

La expresión de MeCP2, determinada por el Western blot, exhibe el patrón recíproco. Nótese que la actividad de la luciferasa luciérnaga puede ser inducida en clones negativos con la administración de 5-azacitidina. Si está presente en el cromosoma X activo, el gen de resistencia a la higromicina confiere una ventaja de supervivencia bajo la selección de higromicina, en comparación con las células con el gen en el cromosoma X inactivo.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar y realizar una pantalla para reguladores de la inactivación del cromosoma X utilizando reporteros insertados selectivamente en el cromosoma X inactivo. Mi laboratorio ha llevado a cabo previamente cribados de bases para reguladores de cromatina en levaduras, y nuestro éxito con este enfoque me inspiró a diseñar este cribado para reguladores de la inactivación del cromosoma X en células de mamíferos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el uso de pequeños ARN interferentes, CRISPR, moléculas pequeñas para ayudar a responder preguntas adicionales sobre la inactivación del cromosoma X en células de mamíferos.