Alta resolución imagen Confocal de la barrera hemato - encefálica: proyección de imagen, reconstrucción 3D y cuantificación de transcitosis
16 de noviembre de 2017
Aquí presentamos un protocolo basado en la microscopía para la proyección de imagen de alta resolución y una reconstrucción tridimensional del ratón unidad neurovascular y barrera blood - brain con secciones libres del cerebro. Este método permite la visualización, análisis y cuantificación de los organelos intracelulares en el BBB.
El objetivo general de este método es proporcionar un protocolo basado en microscopía para la obtención de imágenes de alta resolución y la reconstrucción tridimensional de la barrera hematoencefálica del ratón. Combina la inmunofluorescencia de secciones flotantes con microscopía confocal para analizar orgánulos subcelulares dentro de las células endoteliales del cerebro. Este método aprende la preparación de secciones de flotación libre del cerebro, la tinción de inmunofluorescencia, la adquisición de imágenes y los parámetros de análisis para la microscopía de alta resolución de la barrera hematoencefálica. La principal ventaja de la técnica es que permite la cuantificación de orgánulos subcelulares dentro de las células de la unidad neurovascular. El encargado de demostrar el procedimiento será Roberto Villase
Resumen
Este estudio presenta un protocolo basado en microscopía para la obtención de imágenes de alta resolución y la reconstrucción tridimensional de la unidad neurovascular del ratón y de la barrera hematoencefálica (BHE). Mediante el uso de secciones cerebrales libres flotantes, el método permite la visualización, el análisis y la cuantificación de orgánulos intracelulares en la BHE.
Componentes Principales del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Técnicas de microscopía
- Unidad neurovascular
Antecedentes
- La barrera hematoencefálica es crucial para mantener la homeostasis cerebral.
- Comprender su estructura y función puede proporcionar información sobre las enfermedades neurológicas.
- Las técnicas de imagen de alta resolución permiten la observación detallada de la BHE.
- Los métodos anteriores podrían no permitir un análisis exhaustivo de las estructuras subcelulares.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo para la obtención de imágenes de la BHE en ratón utilizando secciones cerebrales libres flotantes.
- Permitir la cuantificación de orgánulos subcelulares dentro de las células endoteliales cerebrales.
- Mejorar la comprensión de la anatomía y funcionalidad de la unidad neurovascular.
Métodos Utilizados
- Este estudio utiliza una plataforma de imágenes basada en microscopía combinada con inmunofluorescencia.
- El modelo biológico clave es el cerebro de ratón, centrándose en la unidad neurovascular.
- Los pasos principales incluyen la preparación de secciones cerebrales libres flotantes y la obtención de imágenes mediante microscopía confocal.
- El protocolo detalla la adquisición y el análisis de imágenes para mejorar el rendimiento de la microscopía.
- La cuantificación de orgánulos ayuda a elucidar los procesos celulares dentro de la BHE.
Resultados Principales
- El método facilita con éxito la reconstrucción tridimensional de la arquitectura de la BHE.
- El análisis cuantitativo revela conocimientos sobre la organización de los orgánulos intracelulares.
- Los resultados mejoran la comprensión de las características de las células endoteliales dentro de la unidad neurovascular.
- Esta técnica podría apoyar además investigaciones sobre defectos en la integridad de la BHE.
Conclusiones
- Este estudio demuestra una metodología robusta para la obtención de imágenes de alta resolución de la BHE en ratones.
- El proceso permite análisis detallados que pueden orientar la investigación sobre afecciones neurológicas.
- Los conocimientos obtenidos podrían contribuir a comprender los mecanismos neuronales y la plasticidad.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La imagen confocal de alta resolución de la barrera hematoencefálica permite la visualización y cuantificación precisas de orgánulos intracelulares en células endoteliales cerebrales, lo que apoya la reducción mecanicista de riesgos en estrategias de administración terapéutica. Este enfoque proporciona una confianza predictiva al evaluar los mecanismos de transcitosis de biológicos dirigidos al SNC, informando decisiones tempranas de avance o interrupción en el desarrollo de anticuerpos y terapias proteicas. Al generar datos cuantitativos sobre la ultraestructura capilar y la dinámica de vesículas, el método fortalece la validación del blanco y reduce la incertidumbre biológica en las etapas preclínicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la investigación de las vías de transcitosis y la validación funcional de dianas endoteliales implicadas en el transporte de fármacos al SNC.
- Valor operativo: Apoya la reducción de riesgos biológicos mediante la cuantificación de la dinámica de vesículas intracelulares y la distribución de orgánulos en condiciones fisiológicas.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Genera lecturas cuantitativas estandarizadas del volumen capilar, área superficial e intensidad de orgánulos para la estandarización de ensayos.
- Valor operativo: Facilita flujos de trabajo de imagen reproducibles, adecuados para evaluar la modulación de la transcitosis de la BHE por fármacos candidatos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Proporciona información relevante sobre sistemas de enfermedad al vincular la ultraestructura endotelial con la capacidad funcional de transporte in vivo.
- Valor operativo: Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante biomarcadores cuantificables, basados en imágenes, de la integridad de la barrera.
Integración de la Secuencia y Flujo de Trabajo
Este método se integra en el continuo de descubrimiento al apoyar la validación de dianas mediante imágenes mecanísticas, permitir el desarrollo de ensayos a través del análisis cuantitativo de orgánulos y orientar las decisiones traslacionales con datos de correlación estructural-funcional.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre los mecanismos de transcitosis y la aclaración de vías en las unidades neurovasculares.
- Selección: Facilita la preparación del ensayo mediante la cuantificación estandarizada de orgánulos endoteliales y de la morfología capilar.
- Análisis: Proporciona mediciones cuantitativas del número, intensidad y localización subcelular de orgánulos para el análisis comparativo entre condiciones.
- Investigación Traducional: Conecta los datos de imagen con la continuidad preclínica mediante biomarcadores estructurales de la función de la BHE relevantes para la administración de terapias.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de imagen reutilizable para la evaluación transversal de biológicos dirigidos al SNC y sistemas de administración.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la validación de objetivos, reducción de la ambigüedad mecanicista en las vías de transcitosis.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de los flujos de trabajo de imágenes de alta resolución y cuantificación tridimensional.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance/no avance, eficiencia del capital y reducción del riesgo de fracaso en fases tardías del desarrollo de fármacos para el sistema nervioso central.
- Impacto en la cartera: Priorización ajustada al riesgo de terapéuticos basada en mecanismos validados de transporte a través de la barrera hematoencefálica.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos especializados necesarios en microscopía confocal, tinción por inmunofluorescencia y análisis de imágenes 3D.
- Los equipos necesarios incluyen microscopio confocal de barrido láser y software de análisis de imágenes compatible para segmentación y cuantificación.
- La estandarización entre equipos requiere protocolos de tinción, parámetros de imagen y tuberías de análisis armonizados en todos los sitios.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen la calidad de la fijación del tejido, la penetración de los anticuerpos en secciones libres y los marcadores endoteliales específicos de la especie.
- Las limitaciones prácticas incluyen los efectos del grosor de la sección sobre la resolución en z y las posibles restricciones de acceso de los anticuerpos en redes capilares densas.
Preguntas frecuentes sobre biofármacos
Chapters in this video
0:05
Title
0:53
Generation of Brain Free-floating Sections
2:19
Cell or Organelle Labeling by Immunofluorescence Staining
4:27
High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier
6:21
Image Processing and 3D Reconstruction of the Neurovascular Unit
9:04
Results: Three-dimensional Rendering of Capillaries and Intracellular Vesicles at the Blood-brain Barrier
9:57
Conclusion
