Name: Alta resolución imagen Confocal de la barrera hemato - encefálica: proyección de imagen, reconstrucción 3D y cuantificación de transcitosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprende a realizar imagen confocal de alta resolución de la barrera hematoencefálica en ratón mediante secciones flotantes libres. Este protocolo permite la reconstrucción 3D y cuantificación de orgánulos subcelulares en células endoteliales cerebrales.

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R.V. trabajo fue apoyado por una Beca Postdoctoral de la Roche (2014-2017).

<ol><li>Blanchette, M., Daneman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+maintenance+of+the+BBB%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Formation and maintenance of the BBB.</a> Mech Dev. 138, Pt 1 8-16 (2015).</li>
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<li>Sade, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+blood-brain+barrier+transcytosis+assay+reveals+antibody+transcytosis+influenced+by+pH-dependent+receptor+binding%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A human blood-brain barrier transcytosis assay reveals antibody transcytosis influenced by pH-dependent receptor binding.</a> PLoS One. 9 (4), 96340(2014).</li>
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<li>Hsu, J., Rappaport, J., Muro, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+binding%2C+uptake%2C+and+transport+of+ICAM-1-targeted+nanocarriers+across+endothelial+and+subendothelial+cell+components+of+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm+Res%22%5BJournal%5D)">Specific binding, uptake, and transport of ICAM-1-targeted nanocarriers across endothelial and subendothelial cell components of the blood-brain barrier.</a> Pharm Res. 31 (7), 1855-1866 (2014).</li>
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<li>Cabezon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+applied+to+study+the+trafficking+of+8D3-coated+gold+nanoparticles+at+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Serial block-face scanning electron microscopy applied to study the trafficking of 8D3-coated gold nanoparticles at the blood-brain barrier.</a> Histochem Cell Biol. , (2017).</li>
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</ol>

Autores están bajo empleo remunerado por Roche.

El protocolo descrito anteriormente describe la preparación de secciones del cerebro flotante, tinción inmunofluorescente, adquisición de imágenes y parámetros de análisis de microscopía de alta resolución de la BBB. Este método se ha utilizado recientemente para investigar la localización del anticuerpo entrega plataformas3, el transporte de IgG endógeno a través de la BBB17y la heterogeneidad de la BBB a pericyte pérdida18. Diferentes pasos en el protocolo pueden ser modificados para adaptarse al objetivo específico del experimento. En primer lugar, el uso de secciones gruesas (100 μm) facilita su manipulación durante el procedimiento de inmunotinción y montaje. También permite para reconstrucción 3D de la red capilar, de la unidad neurovascular y para la generación de capilar y cortes transversales NVU. Sin embargo, penetración de anticuerpos dentro de las secciones de tejido puede variar y algunas manchas del anticuerpo pueden ser restringido a la capa superficial del tejido cerca el cubreobjetos. El protocolo puede modificarse aumentando la concentración de detergente durante el paso de permeabilización o la longitud del paso de permeabilización para mejorar la penetración de anticuerpos en el tejido. En segundo lugar, la calidad de imagen puede verse comprometida cuando se trata de adquisición de imágenes más profundas dentro del tejido (generalmente de 20 a 30 μm por debajo de la superficie) debido a la dispersión de la luz así como aberraciones ópticas de índice de refracción de desajuste. Para superar este problema, nuevos métodos de tejido claro y anticuerpo activa penetración20 pueden combinarse con este protocolo a volúmenes más grandes de la imagen de los tejidos. En tercer lugar, la deconvolución se realiza después de la adquisición de imagen para mejorar la resolución axial de la imagen. La elección del algoritmo de deconvolución ciega utilizado en este protocolo se basó en (i) su facilidad de uso, ya que ningún cálculo previo de la función de punto de propagación se requiere, (ii) su robustez para mejorar la calidad de imagen21y (iii) la falta de artefactos en mIgG estructuras intracelulares después de la implementación. Dependiendo de las estructuras intracelulares visualizadas en la muestra, pueden resultar otros algoritmos de deconvolución en alta calidad de imagen. Las siguientes referencias21,22 proporciona una discusión extensa sobre las ventajas y limitaciones de los algoritmos adicionales para la deconvolución de la imagen. Finalmente, el uso de un paquete de software de análisis de imagen permitió la segmentación de los capilares y estructuras intracelulares en tres dimensiones. Claramente el análisis de imagen no se limita al software descrito en el protocolo y paquetes alternativos, por ejemplo las que se discuten en la referencia23, puede utilizarse para imágenes de segmento. La idoneidad de los programas de software diferentes para el análisis de las estructuras intracelulares a través de la BBB debe ser verificada empíricamente mediante la evaluación de la precisión de la segmentación de la imagen.
Debido a que este método se basa en muestras fijadas, proporciona información directa sobre la dinámica de transcitosis a través de la BBB. Sin embargo, se puede combinar con experimentos del curso del tiempo24, por ejemplo por vía intravenosa inyección de la molécula de interés y midiendo su acumulación dentro de BECs en diferentes momentos después de la inyección, para reconstruir la cinética de transporte intracelular. La ventaja de este enfoque es que permite el análisis de regiones profundas del cerebro, como se muestra en el18, que son actualmente inaccesibles para enfoques imagen vivo intravital. Un paso crítico durante el protocolo es el monitoreo cuidadoso de la fijación del tejido. Fijación con 4% PFA dramáticamente reduce la inmunogenicidad de los organelos intracelulares y de inmunoglobulinas endógenas o administrado periféricamente17 (figura 1B). Una limitación de este protocolo es su requisito de anticuerpos de alta calidad (es decir, bajo tinción inespecífica, baja reactividad cruzada) adecuados para inmunofluorescencia. Siempre que tales reactivos están disponibles, el método puede ser aplicado para investigar la localización intracelular de cualquier proteína de interés. Por ejemplo, el protocolo se utilizó para identificar los lisosomas en las células endoteliales de cerebro17. Debe señalarse también que, puesto que este protocolo se basa en microscopía confocal, la resolución lateral está limitado por difracción y no puede resolver las estructuras más pequeñas de aproximadamente 175 a 250 nm (figura 2).
Estudios previos han realizado un análisis detallado de la composición celular de la unidad neurovascular utilizando microscopía confocal25,26. Sin embargo, investigando el transporte intracelular en el BBB se basa principalmente en el uso de microscopia electrónica de transmisión19,27,28. Mientras que este método ofrece la máxima resolución lateral de estructuras intracelulares, microscopía sigue siendo una técnica difícil con bajo rendimiento. Por otra parte, el número de dianas moleculares diferentes que pueden ser visualizados de EM es muy limitado. Este protocolo ofrece una alternativa accesible para investigar el transporte intracelular en el BBB. El procedimiento completo de colección de cerebro para análisis de imágenes, puede realizarse en 5 a 6 días. Si se dispone de anticuerpos adecuados, inmunofluorescencia permite la detección simultánea de múltiples tipos de célula/moléculas dentro de la misma muestra. Por otra parte, este protocolo podría combinarse con técnicas de microscopía de superresolución para superar las limitaciones de resolución espacial29. En general, el protocolo descrito anteriormente permite la cuantificación de los cambios en la localización intracelular de proteínas de interés dentro de la unidad neurovascular. Su aplicación para diferentes perturbaciones genéticas o farmacológicas permitirá investigar las funciones de estructura y transporte intracelulares de la BBB en vivo.

La barrera blood - brain (BBB) es una barrera celular continua formada por astrocitos, pericitos, las neuronas y las células endoteliales que separa el sistema nervioso central (SNC) de la circulación de la sangre1. La regulación del transporte a través de la BBB desempeña un papel crucial en el mantenimiento de la homeostasis del cerebro y está mediada por las características especializadas de las células endoteliales del cerebro (BECs). La presencia de uniones intercelulares estrechas entre BECs y una baja tasa basal de transcitosis limitar el transporte paracelular y transcelular de moléculas por la sangre, respectivamente2. Recientemente, la vía transcitosis en BECs ha sido aprovechada para mejorar la entrega de grandes moléculas terapéuticas al cerebro3,4. Sin embargo, los mecanismos de la transcitosis a través de la BBB aún no han sido completamente caracterizadas5,6.
Trabajo extenso se ha hecho en vitro para descifrar los mecanismos celulares y moleculares que regulan el transporte intracelular a través de BECs7,8,9,10, 11, pero estos sistemas no recapitular la compleja arquitectura y fisiología de la unidad neurovascular (NVU). Por otro lado, estudios en vivo12,13 proporcionar información cuantitativa detallada sobre las tarifas de transporte a través de la BBB, pero no proporcionan penetraciones en los mecanismos intracelulares de transporte. Por lo tanto, investigar los componentes celulares e intracelulares de la NVU in vivo y ex vivo sigue siendo muy difícil14. Sólo un número limitado de técnicas es susceptible de analizar estructuras subcelulares dentro de las células del NVU. Mayoría de los estudios utiliza la microscopia electrónica, pero esta técnica está limitada por los protocolos complejos necesarios para preparación de tejido adecuado y manejo de la muestra. Por lo tanto, hemos establecido una metodología basada en microscopía confocal de alta resolución que facilite el procesamiento de muestras de cerebro, el análisis y la cuantificación de compartimentos subcelulares dentro de las células del NVU.
Aquí, describimos un protocolo que utiliza secciones libre-flotante del cerebro de ratón para realizar la proyección de imagen cuantitativa de la BBB y NVU a nivel celular y subcelular. Había probado y validado una serie de anticuerpos de la imagen y reconstruir el NVU en tres dimensiones. Además, este protocolo permite la proyección de imagen en la resolución óptica máxima de difracción limitada de orgánulos dentro de los capilares del cerebro. Junto con análisis de imagen, este protocolo puede utilizarse para investigar el transporte intracelular de macromoléculas a través de la BBB bajo diferentes condiciones experimentales, por ejemplo, en modelos de ratón de la enfermedad de la neurodegeneración.

<table><tbody><tr><td>clon de anticuerpo monoclonal de rata ER-MP12 contra CD31/PECAM</td><td>Etiquetas de MCA2388 de Novus Biologicals</td><td></td><td>Células endoteliales cerebrales Uso en la dilución 1:100 detectar con burro policlonal anti-rata IgG (H+L) junto con el colorante AlexaFluor adecuado, utilizado en la dilución 1:400</td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal de rata contra Podocalyxin</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1556</td><td>Etiquetas Lumen de los capilares Uso en la dilución 1:100 detectar con burro policlonal anti-rata IgG (H+L) junto con el colorante AlexaFluor adecuado, utilizado en la dilución 1:400</td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal de conejo contra CollagenIV</td><td>Biotrend</td><td>BT21-5014-70</td><td>Etiquetas Membrana basal de los capilares Uso en la dilución 1:100 detectar con burro policlonal anti-conejo IgG (H+L) junto con el colorante AlexaFluor adecuado, utilizado en la dilución 1:400</td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal de cabra contra CD13</td><td>R& D Systems</td><td>AF2335</td><td>Etiquetas pericitos Uso en dilución 1:100 detectar con burro policlonal anti-cabra IgG (H+L) acoplado con colorante AlexaFluor adecuado, utilizado en dilución 1:400</td></tr><tr><td>Clon de anticuerpo monoclonal de ratón G-A-5 contra GFAP acoplado a Cy3</td><td>Abcam</td><td>ab49874</td><td>Etiquetas Astrocitos Uso en dilución 1:100</td></tr><tr><td>Anticuerpo policlonal de conejo contra Iba-1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td>Etiquetas Microglia Uso en dilución 1:100 detectar con IgG policlonal anti-rata de burro (H+L) junto con colorante AlexaFluor adecuado, utilizado en la dilución 1:400</td></tr><tr><td>Anticuerpo monoclonal de rata ABL93 gainst LAMP2</td><td>Fitzgerald</td><td>10R-CD107BBMSP</td><td>Etiquetas Lysosomes Uso en dilución 1:100 detectar con IgG policlonal anti-rata de burro (H+L) junto con colorante AlexaFluor adecuado, utilizado en la dilución 1:400</td></tr><tr><td>anticuerpo policlonal de burro contra IgG de ratón (H+L) AlexaFluor594</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21203</td><td>Uso en la dilución 1:400</td></tr><tr><td>anticuerpo policlonal de burro contra IgG de ratón (H+L) AlexaFluor488</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21202</td><td>Uso en la dilución 1:400</td></tr><tr><td>anticuerpo policlonal de cabra contra IgG de ratón (H+L) AlexaFluor555</td><td>LifeTechnologies</td><td>A21422</td><td>Uso en la dilución 1:400</td></tr><tr><td>Papel</td><td>de filtro Sigma-Aldrich</td><td>WHA10334347</td><td>Whatman Papel de filtro cualitativo preplelado Grado 0858 1/2, granulado</td></tr><tr><td>Pegamento de cianoacrilato</td><td>Roth Carl</td><td>258.1</td><td>Roti Coll 1</td></tr><tr><td>Fluorescente Medio de montaje</td><td>Dako</td><td>S3023</td><td>Medio de montaje fluorescente Dako</td></tr><tr><td>Ratones adultos</td><td>The Jackson Laboratory 000664</td><td></td><td>C57BL/6J macho o hembra ratones entre 9 y 19 meses de edad</td></tr><tr><td>Vibratomo</td><td>Leica Biosystems</td><td>14047235612</td><td>Leica VT100S micrótomo de cuchilla vibratoria Microscopio</td></tr> de <tr><td>escaneo láser</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Leica TCS SP8 X con detectores HyD y láser de luz blanca</td></tr><tr><td>Software de procesamiento de imágenes</td><td>Leica Microsystems</td><td>NA</td><td>Leica Application Suite AF versión 3.1.0 build 8587</td></tr><tr><td>Software de análisis de imágenes</td><td>Bitplane software científico</td><td>NA</td><td>Imaris versión 7.6.5 build 31770 para x64</td></tr><tr><td>Fluorescence SpectraViewer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NA</td><td>https://www.thermofisher.com/ch/en/home/life-science /cell-analysis/labeling-chemistry/fluorescence-spectraviewer.html</td></tr></tbody></table>

alta resolución imagen confocal de la barrera hemato - encefálica: proyección de imagen, reconstrucción 3d y cuantificación de transcitosis

High-resolution Confocal Imaging of the Blood-brain Barrier: Imaging, 3D Reconstruction, and Quantification of Transcytosis

La barrera blood - brain (BBB) es una interfaz multicelular dinámica que regula el transporte de moléculas entre la circulación y el cerebro. Transcitosis a través de la BBB regula la entrega de hormonas, metabolitos y anticuerpos terapéuticos a la parenquimia del cerebro. Aquí, presentamos un protocolo que combina la inmunofluorescencia de secciones libre-flotante con láser de barrido, microscopia confocal y análisis de imágenes para visualizar organelos subcelulares dentro de las células endoteliales en el BBB. La combinación de este conjunto de datos con software de análisis de imagen en 3D permite la segmentación semiautomática y cuantificación de volumen capilar y superficie, así como el número y la intensidad de los organelos intracelulares en el BBB. La detección de mouse endógena de la inmunoglobulina (IgG) dentro de vesículas intracelulares y su cuantificación en el BBB se utiliza para ilustrar el método. Potencialmente, este protocolo puede aplicarse a la investigación de los mecanismos de control BBB transcitosis de diferentes moléculas en vivo.

Como ejemplos representativos de las imágenes obtienen desde el protocolo descrito aquí, secciones de cerebro de ratón fueron teñidas con anticuerpos reconocer distintos componentes de NVU incluyendo la membrana basal, astrocitos, pericitos y células endoteliales (véase Tabla de materiales para anticuerpos específicos utilizados) (figura 1A, D y E). En esta resolución es posible distinguir los procesos astrocytic individuales y final-pies que están en contacto directo con los capilares.
Para resaltar la idoneidad de este protocolo para la detección de estructuras intracelulares, secciones del cerebro de animales inyectados periféricamente con el anticuerpo humano anti-Tau mAb86 de16 fueron teñidas con un anticuerpo antihumano marcado con fluorescencia ( Figura 1B). mAb86 es conocido específicamente las neuronas objetivo expresar de una forma patológica de Tau16. Utilizando el protocolo descrito en este documento, mAb86 fue detectado con la resolución de la difracción limitada dentro de estructuras vesiculares individuales dentro de las neuronas (figura 1B-C). Además, endógeno ratón IgG fue detectado en las estructuras intracelulares en las células endoteliales, pero no en pericitos (D-E de lafigura 1y figura 2).
La adquisición de alta resolución z-pila confocal de la vasculatura cerebral permite segmentación tridimensional de capilares y de vesículas intracelulares en el BBB. La figura 2 muestra un ejemplo del proceso de procesamiento y segmentación de un capilar con CollagenIV y ratón IgG positiva intracelular vesículas. Mediante la cuantificación de un conjunto completo de datos de imágenes segmentadas, por ejemplo midiendo el número de vesículas por volumen capilar, es posible estudiar los cambios en los procesos de transporte intracelular bajo diferentes condiciones. Figura 3 B-C muestra las diferencias en intensidad de número y de la fluorescencia de la vesícula de mIgG correspondientes a mIgG en el parénquima cerebral, respectivamente, sobre pericyte agotamiento en el modelo de ratón de pdgf-bret/ret como previamente divulgados 17. el mismo método fue utilizado recientemente para analizar cambios en el transporte intracelular en el BBB entre cerebro diferentes regiones18.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig1.jpg"> 
Figura 1: Etiquetado de múltiples tipos de células y estructuras subcelulares de la neurovascular unidad. Imágenes representativas de la unidad neurovascular (A y D) y vesículas intracelulares dentro de las neuronas (B) o las células endoteliales (E) obtenidas con este protocolo. La imagen de proyección de intensidad máxima en A (arriba) muestra la distribución de astrocitos GFAP-positivo (rojo) que rodean los capilares etiquetados por CollagenIV (verde). Las flechas apuntan hacia los procesos astrocytic. Barra de escala = 20 μm. En esta resolución, los procesos de los astrositos y final-pies son claramente visibles, como se muestra en la imagen ampliada de la región en caja (abajo). Puntas de flecha señalan al final-pies astrocíticos. Barra de escala = 10 μm. La imagen B muestra la acumulación de un anticuerpo inyectado periféricamente, mAb86 (verde), dentro de una neurona del hipocampo. Puntas de flecha señalan a vesículas mAb86-positivas individuales. Barra de escala = 10 μm. El gráfico c muestra la intensidad del perfil de línea de una sola vesícula. El tamaño de la vesícula se estimó de la anchura total en medio máximo de un ajuste gaussiano (línea continua negra) de la curva de intensidad (línea verde y círculos). Las imágenes en D muestran una reconstrucción tridimensional de una célula endotelial (verde) rodeada por un pericyte (rojo) dentro de la lámina basal (CollagenIV, gris). Los paneles inferiores muestran los canales individuales de la fluorescencia. Barra de escala = 10 μm. Las imágenes en E muestran la localización de mIgG (rojo) en vesículas intracelulares en las células endoteliales (panel, CD31 en verde a la izquierda) pero no en pericitos (panel de la derecha, CD13 en verde). En todas las imágenes, DAPI manchado núcleos aparecen en azul. Barra de escala = 5 μm. paneles D y E han sido modificados de la referencia17. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig2.jpg"> 
Figura 2 : Representación tridimensional de capilares y de vesículas intracelulares en la barrera blood - brain. Con el protocolo descrito, alta resolución imágenes confocales de capilares CollagenIV-positiva (verde) y el ratón IgG vesículas intracelulares (rojo) fueron adquirieron (A). El panel izquierdo muestra una sola sección óptica con cortes transversales. Las flechas señalan individuales positivo mIgG vesículas dentro de las células endoteliales del cerebro. El panel sobre la reconstrucción de la derecha muestra el 3D de la z-stack completo utilizando software de procesamiento de la imagen (véase Tabla de materiales). El volumen capilar (B) y vesículas individuales (C) se representa en tres dimensiones y cuantificado utilizando software de procesamiento de imagen (véase Tabla de materiales). En todas las imágenes, DAPI manchado núcleos aparecen en azul. Barras de la escala = 5 μm. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig2large.jpg" target="_blank">haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56407/56407fig3.jpg"> 
Figura 3 : Cuantificación de localización intracelular mIgG en el BBB. Imágenes representativas que muestran (A) reconstrucción tridimensional de capilares (etiquetados con collagenIV, verde) y la distribución de mIgG (rojo) en ratones C57BL/6 y el pdgf-bret/ret pericyte agotan ratones descrito previamente en19. Barras de la escala = 10 μm. Las imágenes en B muestran la segmentación de vesículas intracelulares dentro de la máscara de CollagenIV. THe el gráfico b muestra la cuantificación y comparación de número de vesícula mIgG por volumen del tubo capilar. Cada punto representa las medidas de los segmentos capilares individuales. La línea continua muestra la media y las barras de error representan el desvío estándar de los datos. Las imágenes de ver C el señal de fluorescencia mIgG fuera de la máscara de CollagenIV. Asimismo, el gráfico en C muestra la cuantificación y comparación de la intensidad de fluorescencia mIgG en el parénquima cerebral entre ratones C57BL/6 y pdgf-bret/ret ratones pericyte agotado. Unidades de intensidad de fluorescencia se normalizaron por la intensidad de parénquima mIgG promedio medida en todos los ratones C57BL/6. Esta figura se ha modificado de la referencia17. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56407/56407fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Aquí presentamos un protocolo basado en la microscopía para la proyección de imagen de alta resolución y una reconstrucción tridimensional del ratón unidad neurovascular y barrera blood - brain con secciones libres del cerebro. Este método permite la visualización, análisis y cuantificación de los organelos intracelulares en el BBB.

Alta resolución imagen Confocal de la barrera hemato - encefálica: proyección de imagen, reconstrucción 3D y cuantificación de transcitosis

The blood-brain barrier (BBB) is a dynamic multicellular interface that regulates the transport of molecules between the circulation and the brain. ...

El objetivo general de este método es proporcionar un protocolo basado en microscopía para la obtención de imágenes de alta resolución y la reconstrucción tridimensional de la barrera hematoencefálica del ratón. Combina la inmunofluorescencia de secciones flotantes con microscopía confocal para analizar orgánulos subcelulares dentro de las células endoteliales del cerebro. Este método aprende la preparación de secciones de flotación libre del cerebro, la tinción de inmunofluorescencia, la adquisición de imágenes y los parámetros de análisis para la microscopía de alta resolución de la barrera hematoencefálica. La principal ventaja de la técnica es que permite la cuantificación de orgánulos subcelulares dentro de las células de la unidad neurovascular. El encargado de demostrar el procedimiento será Roberto Villase

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Fuente: Villaseñor, R y Collin. L. Imágenes confocales de alta resolución de la barrera hematoencefálica: imágenes, reconstrucción 3D y cuantificación de la transcitosis. J. Vis. Exp. (2017)Este video muestra imágenes 3D de alta resolución de la barrera hematoencefálica (BBB) utilizando microscopía confocal, mostrando secciones de cerebro de ratón teñidas con anticuerpos para analizar los componentes de BBB y las estructuras intracelulares, aplicables para estudiar la homeostasis cerebral, las...

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Fuente: Bagheri, M., et. al. Protocolo para el Análisis Morfométrico Confocal Tridimensional de Astrocitos. J. Vis. Exp. (2015).Este video muestra la obtención de imágenes de astrocitos marcados con fluorescencia en una sección de cerebro de ratón utilizando un microscopio confocal. La sección del cerebro se coloca debajo de la lente del objetivo apropiado y se seleccionan los fluoróforos y filtros adecuados. Después de optimizar la exposición automáticamente, se definen los parámetros de...

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Alta resolución imagen Confocal de la barrera hemato - encefálica: proyección de imagen, reconstrucción 3D y cuantificación de transcitosis

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