Imágenes en vivo de la proteína GLUT4 trata de ratón las neuronas hipotalámica primaria utilizando microscopía de deconvolución

El objetivo general de este experimento es observar el tráfico de proteínas en tiempo real en células neuronales primarias como GLUT4 en neuronas hipotalámicas con un daño mínimo. Este método puede explicar cuestiones clave relacionadas con la regulación neuronal de la señalización de la insulina y el metabolismo, como en el caso de la diabetes mellitus tipo 2. La principal ventaja de esta técnica es que los investigadores pueden aislar cultivos celulares primarios y observar el efecto inducido por el fármaco en tiempo real.

La implicación de esta técnica es elegir una terapia para la diabetes tipo 2 o la resistencia a la insulina relacionada con el cerebro, ya que ahora sabemos cómo esta señal de insulina está siendo alterada por la quimiocina CCL5 en las neuronas hipotalámicas. Para comenzar este procedimiento, cubra las placas de cultivo con lisina poli-D un día antes del cultivo. Para un plato de seis pocillos, agregue 1.5 mL de lisina poli-D a 0.05 mg/mL a cada pocillo.

Al día siguiente, retire la lisina poli-D y lave los platos dos veces con 2 mL de ddH2O. A continuación, llene las placas de Petri de 10 cm con 20 ml de medio de lavado y manténgalas en hielo. Llene los tubos de 15 ml con medio de lavado y manténgalos en hielo.

Para el aislamiento del tejido cerebral, esterilice la plataforma, el microscopio de disección y las herramientas quirúrgicas con etanol al 75% para evitar la contaminación. Después de eso, corte alrededor del área del cordón umbilical para aislar a los cachorros sin dañarlos. A continuación, retire la cabeza de cada cachorro y asegúrela en su lugar con las pinzas rectas de punta fina.

Use otra pinza curva de punta fina para quitar la piel exterior y el cráneo de ambos lados y despegarlos desde la dirección anterior hasta la dorsal. Luego, mantenga los cerebros aislados en una placa de Petri limpia con un medio de lavado helado. Voltea el cerebro y mantén el lado ventral hacia arriba.

Posteriormente, aislar el tejido hipotalámico con pinzas curvas de punta fina. Sujete el lóbulo olfativo con las pinzas afiladas y retire las meninges delgadas que rodean todo el cerebro con las pinzas curvas. Voltea hacia la parte inferior de la corteza y separa el hipocampo de la corteza tirando de él hacia un lado.

Cuando se hayan aislado todas las regiones del cerebro, pique estos tejidos en los tubos de 15 ml que contienen medio de lavado helado. En este procedimiento, enjuague los tejidos invirtiendo el tubo que contiene el tejido dos o tres veces. Luego, mantenga el tubo recto para permitir que los tejidos se asienten.

Retire el medio superior con la pipeta Pasteur de vidrio conectada a un sistema de vacío. Para lavar el pañuelo, agregue 15 ml de medio de lavado con agua fría e invierta el tubo dos o tres veces. Después del lavado final, retire el medio de lavado con la ayuda de una pipeta de 1 mL.

Incubar los tejidos con tampón de digestión de papaína-tripsina en un baño de agua a 37 grados centígrados durante siete a 14 minutos. A continuación, neutralizar la actividad de las enzimas añadiendo un volumen de suero fetal bovino. Mantenga el tubo en la rejilla y espere uno o dos minutos para permitir que los pañuelos se asienten.

A continuación, retire el sobrenadante con cuidado con una pipeta de 1 ml. Añada 6 ml de medio de recubrimiento en el tubo de ensayo y pipetee el tejido hacia arriba y hacia abajo 50 veces suavemente con una pipeta de 5 ml. Mantenga el tubo en la rejilla y espere uno o dos minutos para permitir que los tejidos gruesos y no disociados se asienten.

A continuación, transfiera la fase superior que contiene las células disociadas a un nuevo tubo y dilúyalo con medio de siembra. Luego, agregue 2 mL de medio de cultivo completo en cada pocillo del plato de seis pocillos. Para preparar las células para la obtención de imágenes en vivo, retire con cuidado los cubreobjetos con neuronas con pinzas y colóquelos en el portaobjetos de vidrio con precaución.

A continuación, elimine el exceso de medio con toallitas delicadas doblándolas dos veces y colocándolas con cuidado en el cubreobjetos sin moverlo. Es esencial eliminar el exceso de medio para evitar movimientos innecesarios en el cubreobjetos. A continuación, trate las muestras de células seleccionadas con CCL5 a 10 ng/mL o insulina a 10 unidades/mL durante un minuto.

A continuación, añada 1,5 mcL de insulina diluida en el borde de los cubreobjetos. A continuación, añada aceite de inmersión en un objetivo de 1,52 NA con un aumento de 60 veces. A continuación, coloque los cubreobjetos en la platina del microscopio de deconvolución con los cubreobjetos hacia abajo y asegurados correctamente.

Utilice iluminación de campo claro o fluorescencia para identificar las células objetivo. Después, ajuste el enfoque hasta que se puedan observar claramente las células objetivo. No mueva la lente del objetivo fuera del área de deslizamiento de la cubierta para evitar marcas de arañazos innecesarias.

A continuación, identifique GFP-GLUT4 por la señal GFP. A continuación, identifique las celdas objetivo deseadas para la adquisición de imágenes. Posteriormente, establezca los parámetros experimentales adecuados en cada celda objetivo, incluido el número de píxeles, la longitud de onda de excitación, el porcentaje de transmisión, el tiempo de exposición, el grosor de la pila, el intervalo de tiempo y el tiempo total de imagen.

Ajuste el parámetro de exposición a aproximadamente 2000 a 3000 recuentos para lograr la máxima intensidad de píxeles. Para minimizar el fotoblanqueo de fluorescencia, reduzca el porcentaje de transmisión de luz de excitación tanto como sea posible mientras mantiene el tiempo de exposición inferior a un segundo. Establezca el límite superior e inferior de la pila Z en cada celda objetivo moviendo la platina del microscopio hasta que la parte superior e inferior de la celda objetivo estén ligeramente desenfocadas.

Es muy importante minimizar el fotoblanqueo fluorescente en la muerte de las neuronas después de la imagen de luz. Esta figura muestra que las neuronas hipotalámicas primarias cultivadas se marcaron con el marcador neuronal MAP2. El marcador neuronal hipotalámico POMC y su co-expresión de CCR5.

La imagen colocalizada muestra que CCL5 se expresa en las neuronas hipotalámicas POMC positivas. Estas imágenes muestran la expresión de la proteína GFP-GLUT4 en neuronas hipotalámicas de tipo salvaje y neuronas hipotalámicas CCR5 doble negativas. Las neuronas fueron estimuladas con insulina o CCL5.

Las flechas señalan la puntuación GFP-GLUT4 en la neuritis antes o después de la estimulación con insulina o CCL5, y los asteriscos indican la superficie GLUT4-GFP antes o después de la estimulación CCL5. Una vez dominado, este registro de laboratorio de la técnica de células primarias se puede realizar entre una y cuatro horas, dependiendo de los requisitos del experimento y de si se realiza correctamente. Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la neurociencia exploraran la posibilidad de caracterizar el efecto inmediato inducido por el fármaco en el cultivo de células primarias.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo aislar una neurona hipotalámica primaria, una neurona del hipocampo y una neurona cortical. Además del laboratorio, también se puede saber cómo realizar una grabación en vivo de la molécula en serie sobre diferentes estimulaciones. No olvide ponerse la bata de laboratorio y los guantes y utilizar etanol con frecuencia para evitar la contaminación por bacterias y hongos de los animales.

También hay que tener mucho cuidado al tratar con los cubreobjetos y las neuronas a lo largo de este procedimiento.