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Advanced Biology

Análisis del ciclo celular

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Cell Biology

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Cell Cycle Analysis

4.1: An Introduction to Cell Division

4.3: Live Cell Imaging of Mitosis

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09:32 min

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April 30, 2023

Overview

Ciclo celular se refiere al conjunto de eventos a través del cual una célula crece, replica su genoma y en última instancia, se divide en dos células hijas a través del proceso de la mitosis. Porque la cantidad de ADN en una célula muestra cambios característicos en todo el ciclo, conocidas como análisis de ciclo celular pueden ser usado para separar una población de células según las diferentes fases del ciclo celular en que se encuentran las técnicas, basado en su contenido de ADN diferente.

Este video cubre los principios del análisis del ciclo celular mediante tinción de ADN. Vamos a revisar un protocolo generalizado para realizar esta tinción utilizando bromodeoxiuridina (BrdU, una análogo de la timidina que se incorpora en hebras de ADN recién sintetizados) y yoduro de propidio (PI, un tinte de ADN que tiñe todo ADN), seguido por el análisis de las células teñidas con citometría de flujo. En citometría de flujo, una suspensión unicelular de células fluorescencia etiquetadas se pasa a través de un instrumento con un haz de láser y se lee la fluorescencia de cada célula. Luego discutir cómo interpretar los datos de parcelas de dispersión de citometría de flujo y finalmente, mirar unas cuantas aplicaciones de esta técnica.

Procedure

Ciclo celular se refiere al conjunto de procesos celulares y bioquímicos que ocurren dentro de una célula a su división. Una célula pasa a través de diferentes etapas del ciclo, y el tiempo necesario para completar este proceso es casi constante para un tipo de células. Cualquier desviación de esta duración es indicativo de la división celular anormal. Por lo tanto, análisis del ciclo de la célula se convierte en una herramienta muy útil para los biólogos interesados en el estudio de los mecanismos de división celular, que en última instancia, ayudará en el tratamiento de pacientes con enfermedades como el cáncer, en el que se interrumpe el ciclo celular.

Este video será discutir el principio y un protocolo generalizado de análisis de ciclo celular. Por último, te mostramos que algunas aplicaciones de este método de uso general.

Vamos a aprender lo que el análisis de ciclo celular es y cómo funciona este ensayo.

Esencialmente, análisis de ciclo celular de una población mixta nos dice cuántas células en cada una de las diferentes fases. Esto se hace comúnmente mediante la evaluación de contenido de ADN de la célula. Usted puede pensar: ¿por qué el contenido de ADN? Para entender esto, brevemente repasemos qué sucede con el ADN cromosómico como una progresa de la célula a través del ciclo.

Durante la fase G1, no cambia el contenido de ADN en una célula. A través de la fase S, la replicación del ADN lleva a cabo, y al final de esta fase ADN contenido se duplica. En la fase G2, las células Compruebe que no hay ningún error en la duplicación del ADN y finalmente, al final de la etapa M, este ADN obtiene dividido igualmente en dos células hijas. Por lo tanto, etiquetado ADN puede ayudar a un científico determinar la etapa del ciclo celular.

Una consideración importante para este etiquetado es la elección del tinte de unión de ADN. Bromodeoxiuridina y BrdU, es un análogo de ácido nucleico y estructuralmente imita timidina. Esto permite BrdU incorporar a la cadena creciente durante la replicación del ADN. Por lo tanto, este colorante etiquetas de células en fase S solamente. Tras la incorporación de BrdU, las hebras de ADN se separan y BrdU se detecta con la ayuda de anticuerpos fluorescente etiquetados.

Otros compuestos como el yoduro de propidio PI, que es intrínsecamente fluorescente, intercalar entre trenzados doble los ácidos nucleicos, y por lo tanto en todas etapas de tinción de las células. Sin embargo, la cantidad de PI de tinción es proporcional a la cantidad de ADN.

Aunque la selección de una mancha depende de la experiencia a la mano, los investigadores utilizan a menudo procedimientos de tinción duales. Moléculas como PI que se unen proporcionalmente a todas las células se puede diferencian las células G1 G2 o células en fase M. Sin embargo, células en fase S todavía están en transición. Por lo tanto, además de moléculas como el BrdU que sólo etiqueta S fase células aumentan la especificidad de la detección de fase del ciclo celular. Por último, las células se analizan mediante citometría de flujo para enumerar las células en ciclo celular diferentes etapas.

Ahora que usted entiende los principios del ciclo celular tinción, vamos a discutir un procedimiento con BrdU y PI.

Set platos de cultivo celular: uno para el experimento y un tres adicionales como controles. En aproximadamente el 60% confluency, BrdU disuelto en medios de cultivo se agrega a las células vivas, seguidas por la incubación. En esta etapa, se incorpora BrdU dentro del ADN replicación.

Tras la incubación, las células son centrifugadas y resuspendió en solución salina amortiguadora de fosfatos o PBS. A continuación, las células se fijan agregando suspensión celular gota a gota helada 70% de etanol mientras que Vortex suavemente. Esto cesa la división celular y evita la aglutinación.

Células fijas otra vez son centrifugadas y resuspendió en PBS. Entonces, una solución de ácido concentrada que contiene un detergente, como Triton-X, se añade gota a gota a las células. El detergente permeabilizes las células para permitir la entrada de compuestos membrana impermeable, y ácido disminuye el pH y desnaturaliza el DNA, exponiendo BrdU. Las células son centrifugadas luego se descarta el sobrenadante y el pellet se resuspendió en una solución alcalina para restablecer el pH.

Finalmente, las células se lavaron con PBS e incubadas con un anticuerpo de BrdU conjugado a una etiqueta fluorescente a temperatura ambiente. Después de este paso, las muestras deben protegerse de la luz para evitar el fotoblanqueo.

Cuando doble tinción, las células se incuban con PI y Rnasa. Rnasa es necesario extraer ARN-ARN o RNA-DNA filamentos dobles, que también se unen a PI y pueden producir resultados falsos positivos. Las células entonces se pasan a través de un tamiz celular hacer suspensión unicelular, que es necesario para el análisis cytometric del flujo.

Ahora que ha aprendido el protocolo para la tinción, revisemos cómo analizar los datos obtenidos.

Brevemente, en flujo citometría de que un rayo láser brilla sobre una estrecha corriente de suspensión de células individuales y la emisión en longitudes de onda particulares de los tintes en cada celda se detecta como un solo evento en un terreno de dispersión.

Aquí, el diagrama de dispersión del PI teñidas células mostrar dos distintos grupos, uno con casi el doble de PI que la otra. Después de la optimización de los detectores de PI, estos sistemas aparecen como dos picos en un análisis de histograma. El pico de mayor intensidad de PI representa células G2/M, y en menor intensidad representa células G1. Las áreas bajo estos picos representan el número de células en las fases correspondientes.

Del mismo modo, los eventos de BrdU-FITC pueden mostrarse en un análisis de histograma en escala logarítmica. Este diagrama muestra que puede verse BrdU positiva las células son claramente más brillantes que las células sin manchas y puesto que sólo una fracción de la población están en la fase S, un pico más grande de BrdU células sin manchas.

Puede mostrar el diagrama de dispersión de células teñidas con BrdU y PI con PI en el eje x lineal y BrdU en el eje logarítmico, y esto muestra un patrón de herradura que de G1, S, G2. La proporción de células en las áreas cerradas puede determina y muestra en un gráfico de barras.

Ahora que hemos pasado a través del protocolo básico para el análisis de ciclo celular, vamos a ver cómo puede utilizarse en diversas configuraciones experimentales.

A. mediante la combinación de manipulaciones genéticas con análisis de ciclo celular, los científicos estudian los roles de las proteínas específicas en la progresión del ciclo celular. En este estudio, los científicos sobre expresa una proteína llamada p27 en fibroblastos embrionarios de ratón. Los resultados demuestran que la sobreexpresión llevó a menor número de células en la fase S, lo que indica que esta proteína juega un papel fundamental en la regulación del ciclo celular.

Mediante el análisis de ciclo celular, los científicos pueden comparar cinética de progresión. Aquí, se compararon con cinética de evolución entre dos líneas celulares de cáncer colorrectal y una línea de células de cáncer de mama. Los resultados demostraron que las células de cáncer de mama avanzado a través del ciclo celular a un ritmo más lento en comparación con las líneas de células colorrectales, dado el mayor porcentaje de las células de cáncer de mama en el G1 con el tiempo.

Por último, para el análisis de ciclo celular en vivo , BrdU puede ser inyectado en los roedores y la población celular puede ser aislada para el análisis de ciclo celular. En este estudio, las células madre hematopoyéticas o inyección de HSCs de BrdU ratones fueron aislados por análisis cytometric del flujo. Los datos recogidos revelaron la distribución de HSCs entre etapas del ciclo celular diferente con predominio en la fase G1 y S.

Sólo has visto video de Zeus en el análisis de ciclo celular. Hemos revisado los principios detrás de este proceso, detalla un protocolo paso a paso y examinó cómo se utiliza este tipo de análisis en diversos ámbitos experimentales. ¡Como siempre, gracias por ver!

Transcript

Cell cycle refers to the set of cellular and biochemical processes occurring within a cell leading to its division. A cell passes through different stages of the cycle, and the time taken to complete this process is almost constant for a cell type. Any deviation from this duration is indicative of abnormal cell division. Therefore, cell cycle analysis becomes a very useful tool for biologists interested in studying mechanisms of cell division, which will ultimately help in treating patients with diseases like cancer, in which the cell cycle is disrupted.

This video will discuss the principle and a generalized protocol of cell cycle analysis. Lastly, we’ll show some applications of this commonly used method.

Let’s learn what cell cycle analysis is, and how this assay works.

Essentially, cell cycle analysis of a mixed population tells us how many cells are in each of the different phases. This is most commonly done by evaluating the cell’s DNA content. You may think: why DNA content? To understand this, let’s briefly review what happens to chromosomal DNA as a cell progresses through the cycle.

During the G1 phase, DNA content within a cell does not change. Through the S phase, DNA replication takes place, and by the end of this phase DNA content is doubled. In G2 phase, the cells check that there are no errors in DNA duplication, and finally—at the end of M stage—this DNA gets equally divided into two daughter cells. Therefore, labeling DNA can help a scientist determine the cell cycle stage.

One important consideration for this labeling is the choice of DNA binding dye. Bromodeoxyuridine, or BrdU, is a nucleic acid analog and structurally mimics thymidine. This allows BrdU to incorporate into the growing strand during DNA replication. Therefore, this dye labels cells in S phase only. Following BrdU incorporation, the DNA strands are separated, and BrdU is detected with the help of fluorescently tagged antibodies.

Other compounds, such as propidium iodide or PI, which is inherently fluorescent, intercalate between double stranded nucleic acids, and therefore stain cells at all stages. However, the amount of PI staining is proportional to the DNA amount.

Although selection of a stain depends on the experiment at hand, researchers often use dual staining procedures. Molecules like PI that proportionally bind to all cells can easily differentiate G1 cells from G2 or M phase cells. However, S phase cells are still in transition. Therefore, addition of molecules like BrdU that only label S phase cells increase the specificity of cell cycle stage detection. Finally, cells are analyzed using flow cytometry to enumerate cells in different cell cycle stages.

Now that you understand the principles behind cell cycle staining, let’s discuss a procedure using BrdU and PI.

Set up cell culture dishes: one for the experiment, and an additional three as controls. At about 60% confluency, BrdU dissolved in culture media is added to the live cells, followed by incubation. At this stage, BrdU is incorporated within the replicating DNA.

Following incubation, cells are centrifuged and resuspended in phosphate buffered saline, or PBS. Next, cells are fixed by adding cell suspension dropwise to ice-cold 70% ethanol while vortexing gently. This ceases cell division and prevents clumping.

Fixed cells are again centrifuged and resuspended in PBS. Then, a concentrated acid solution containing a detergent, such as Triton-X, is added to the cells dropwise. The detergent permeabilizes the cells to permit entry of membrane-impermeable compounds, and acid decreases the pH and denatures DNA, exposing BrdU. Cells are then centrifuged, supernatant is discarded, and the pellet is resuspended in alkaline solution to restore pH.

Lastly, cells are washed with PBS and incubated with a BrdU antibody conjugated to a fluorescent tag at room temperature. After this step, samples should be protected from light to avoid photobleaching.

When dual staining, cells are incubated with PI and RNase. RNase is necessary to remove RNA-RNA or RNA-DNA double strands, which also bind to PI and can yield false positive results. Cells are then passed through a cell strainer to make single cell suspension, which is necessary for flow cytometric analysis.

Now that you’ve learned the protocol for staining, let’s review how to analyze the data obtained.

Briefly, in flow cytometry a laser beam shines on a narrow stream of single cell suspension, and the emission at particular wavelengths from the dyes in each cell is detected as a single event on a scatter plot.

Here, the scatter plot of PI stained cells show two distinct clusters, one with almost twice the amount of PI than the other. Following optimization of the PI detector, these sets appear as two peaks in a histogram analysis. The peak at greater PI intensity represents G2/M cells, and the one at lower intensity represents G1 cells. Areas under these peaks represent the number of cells in the corresponding phases.

Similarly, the BrdU-FITC events can be displayed in a histogram analysis on a logarithmic scale. This plot shows that BrdU positive cells are distinctly brighter than the unstained cells, and since only a fraction of population are in the S phase, a larger peak of BrdU unstained cells can be seen.

The scatter plot of cells stained with BrdU and PI can be displayed with PI on the linear X-axis and BrdU on the logarithmic Y-axis, and this shows a horseshoe pattern going from G1, S, to G2. The proportion of cells in the gated areas can be determined and displayed on a bar graph.

Now that we’ve gone through the basic protocol for cell cycle analysis, let’s look at how it can be used in various experimental setups.

A. By combining genetic manipulations with cell cycle analysis, scientists study roles of specific proteins in cell cycle progression. In this study, scientists overexpressed a protein called p27 in mouse embryonic fibroblasts. The results demonstrate that overexpression led to lower numbers of cells in the S phase, indicating that this protein plays a critical role in cell cycle regulation.

Using cell cycle analysis, scientists can compare progression kinetics. Here, progression kinetics between two colorectal cancer cell lines and a breast cancer cell line were compared. Results demonstrated that the breast cancer cells progressed through cell cycle at a slower rate compared to the colorectal cell lines, given the higher percentage of breast cancer cells in the G1 over time.

Lastly, for in vivo cell cycle analysis, BrdU can be injected in rodents and the target cell population can be isolated for cell cycle analysis. In this study, hematopoietic stem cells or HSCs of BrdU-injected mice were isolated for flow cytometric analysis. Data collected revealed the distribution of HSCs amongst different cell cycle stages with predominance in G1 and S phase.

You’ve just watched JoVE’s video on cell cycle analysis. We’ve reviewed the principles behind this process, detailed a step-by-step protocol, and reviewed how this type of analysis is used in various experimental settings. As always, thanks for watching!

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