Procesamiento de tejido cardiaco humano hacia la matriz extracelular autoensamblada hidrogel para aplicaciones In Vivo y In Vitro

El objetivo general de este procedimiento es procesar la matriz extracelular cardíaca en un hidrogel, lo que permite estudiar el efecto de la matriz en varios ensayos basados en células. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo cardíaco, como cómo la matriz extracelular afecta el comportamiento celular. La principal ventaja de esta técnica es que facilita el uso de la matriz extracelular para hacer experimentos a gran escala in vitro o in vivo.

Las aplicaciones de esta técnica pueden extenderse hacia una terapia para el infarto de miocardio porque la matriz puede proporcionar señales esenciales de supervivencia. Para comenzar el experimento, utilice un bisturí estéril con una hoja número diez, para eliminar el tejido graso de un miocardio ventricular izquierdo obtenido previamente. Corta el miocardio en cubos de aproximadamente 1 por 1 por 1 cm, usando un bisturí.

A continuación, coloque los cubos en un tubo estéril de 50 ml. Guarde los tubos que contienen los cubos a 80 grados centígrados. Saque el tubo que contiene los cubos preparados del congelador y transpórtelo en hielo al criostato.

Ajuste la temperatura del objeto y de la cámara del criostato a 15 grados centígrados. Enfríe los tubos vacíos de 50 ml y los sellos en la cámara. Agregue una capa de medio de criosección sobre el sello frío y deje que se congele hasta que esté blanco y sólido.

Agregue una segunda capa de medio de criosección y coloque un tubo de miocardio en la segunda capa. Asegúrese de que el medio de criosección y el miocardio estén completamente congelados. A continuación, inserte el sello con miocardio congelado en el soporte y apriete todos los tornillos.

Recorte la superficie del tejido hasta obtener una superficie de sección uniforme. Seccionar el miocardio congelado con corte automático para garantizar secciones de corte uniformes. Se pueden cortar aproximadamente de 30 a 40 secciones de un cubo.

Coloque cada rebanada, después de seccionarla, sin apretar en un tubo de 50 ml preenfriado. Cierre los tubos llenos y colóquelos sobre hielo. Transfiera las secciones congeladas de todos los tubos de 50 ml a un vaso de precipitados estéril.

Añadir 50 mL de solución de lisis por tubo de 50 mL que contenga rodajas de miocardio. A continuación, agite las rodajas de miocardio en un vaso de precipitados estéril. Cuela el líquido con las rodajas de pañuelo a través de un colador grueso.

A continuación, transfiera las rodajas de papel con una pinza sin filo a un nuevo vaso de precipitados estéril. Agregue 50 mL de SDS al 0.5% en PBS por tubo inicial de 50 mL de cortes de miocardio. Agite el vaso de precipitados continuamente durante seis horas a 100-150 rpm a temperatura ambiente.

Después de agitar, cuele el líquido con las rodajas de papel a través de un colador grueso. Con una pinza sin filo, transfiera las rodajas de pañuelos a un nuevo vaso de precipitados estéril y lave las rodajas tres veces con 50 ml de PBS. A continuación, lave las rodajas durante la noche en PBS, con 1% de penicilina estreptomicina y 1% de nistatina.

Al día siguiente, retire la solución de lavado y agregue 25 mL de FBS precalentado a 37 grados centígrados con estreptomicina de penicilina al 1% y nistatina al 1%, a las rodajas descelularizadas por tubo inicial de 50 mL de láminas de miocardio. Incubar las rodajas durante tres horas a 37 grados centígrados para eliminar cualquier resto de ADN de la matriz. A continuación, transfiera las rodajas a un nuevo vaso de precipitados estéril y lávelas tres veces con 50 ml de PBS.

Coloque las rebanadas de ECM sin apretar en una nueva placa estéril de seis pocillos. Congele el ECM a 80 grados centígrados y liofícelo durante dos días en un liofilizar. Para la pulverización de la loncha ECM, utilice tubos de fresado que contengan perlas cerámicas de 1,4 mm.

Llene los tubos sin apretar con ECM liofilizado, utilizando pinzas estériles y romas. Congele los tubos en nitrógeno líquido. Inserte los tubos congelados en la fresadora y pulverize el ECM.

Establezca la duración en 30 segundos, ajuste la velocidad máxima e inicie el dispositivo. Después de la pulverización, saque los tubos y congélelos nuevamente en nitrógeno líquido. Lave las micropartículas de los tubos, agregando 1 mL de ddH20 por tubo, y agite para una solubilización completa.

Luego, filtre la solución heterogénea a través de una malla de 200 micrómetros, en un tubo de 50 mL. Congele el tubo en nitrógeno líquido. Reemplace la tapa estándar del tubo con un filtro de 0,22 micrómetros para evitar que el polvo fluya fuera del tubo.

Inserte el tubo en el liofilizador y vuelva a liofilizar para eliminar el agua del paso de lavado. Disolver el polvo de MEC humana liofilizada previamente preparado en una solución de pepsina, hasta una concentración final de 10 mg por ml. Transfiera la solución a tubos de 2 mL con un volumen de 1 mL por tubo.

Pipetear la solución para mezclar bien. A continuación, coloque los tubos en el agitador y agite a 1200 rpm durante 48 horas a 27 grados centígrados. Saque los tubos de la coctelera y colóquelos sobre hielo o un soporte de tubo preenfriado.

Mezcle 1/9 del volumen de la solución de ECM de PBS 10X frío, con 1/10 de un volumen de solución de ECM de hidróxido de sodio frío 0,1 molar, en un tubo preenfriado y colóquelo en hielo para neutralizar la solución de ECM digerida e inactivar la pepsina. Finalmente, agregue la solución de ECM a la mezcla de neutralización y mezcle bien a través de pipeteo o vórtice. Los ensayos cuantitativos para los componentes individuales de la MEC revelaron una eliminación más completa del ADN y una mejor conservación del colágeno total, la elastina y los glicosominoglicanos en comparación con la descelularización por SDS sola.

La RT-PCR se utilizó para cuantificar la expresión de proteínas estructurales de cardiomiocito, factores de transcripción cardiomiogénica temprana y tardía y genes marcadores de superficie de células endoteliales en ESC murinos, en proceso de diferenciación espontánea. El contacto con cECM impulsa las células madre pluripotentes, preferiblemente hacia un fenotipo similar al cardiomiocito. La microscopía óptica de contraste de fase demuestra que la digestión enzimática del cECM durante 48 horas da como resultado una solución de ECM más homogeneizada.

La tinción viva/muerta de fibroblastos cardíacos humanos en hidrogel cECM, muestra una mayor viabilidad. Tanto las micropartículas de cECM como el hidrogel de cECM mejoran la actividad metabólica de las células contráctiles HL-1, en condiciones isquémicas, en comparación con las células en cultivo estándar. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una semana desde el tejido hasta el hidrogel, si se realiza correctamente.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la regeneración cardíaca exploraran los efectos de la matriz extracelular cardíaca, en sistemas modelo in vitro e in vivo.