Name: Procesamiento de tejido cardiaco humano hacia la matriz extracelular autoensamblada hidrogel para aplicaciones In Vivo y In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Aprende a procesar matriz extracelular cardíaca humana en hidrogel autoensamblado para ensayos celulares in vitro e in vivo. Esta técnica de descelularización preserva componentes esenciales para estudios de ingeniería tisular cardiaca.

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El protocolo de estudio se ajusta a los principios éticos descritos en la declaración de Helsinki. Pacientes siempre el consentimiento informado para el uso del tejido para fines de investigación, y el proceso de recogida de tejido fue aprobado por la Junta de revisión institucional y Comité de ética de Charité - Universitätsmedizin Berlín (EA4/028/12).

El protocolo de estudio se ajusta a los principios éticos descritos en la declaración de Helsinki y fue aprobado por el Comité de ética y Junta de revisión institucional de la Charité Medical University. Todos los pacientes siempre por escrito, consentimiento informado para el uso de tejido cardíaco para estudios experimentales.
1. preparación del miocardio humano para seccionamiento
<ol><li>Obtener el miocardio ventricular izquierdo (el tamaño varía dependiendo del tipo de cirugía) directamente desde la sala de operaciones y transporte en PBS frío en un recipiente estéril.</li>
	<li>Eliminar todo el tejido graso con un bisturí estéril con cuchilla Nº 10 bajo condiciones estériles.</li>
	<li>Corte del miocardio en cubos de aproximadamente 1 x 1 x 1 cm con un bisturí.</li>
	<li>Coloque los cubos en tubos estériles de 50 mL. Nota: Para hacer una pausa, ejecutar el paso 1.5, de lo contrario continúe con el paso 2.2. Evitar ciclos de congelación y descongelación repetida para evitar la degradación de las proteínas y una disminución en la calidad del tejido.</li>
	<li>Almacenar los tubos que contienen los cubos a-80 ° C. Los tejidos pueden guardarse por varios meses.</li>
</ol>2. secciones de los cubos de miocardio en rodajas
<ol><li>Tome los tubos que contienen los cubos preparados fuera del congelador.</li>
	<li>Transporte en hielo al criostato.</li>
	<li>Ajustar la temperatura del objeto y la cámara de-15 ° C. Nota: La temperatura adecuada es crucial para garantizar el seccionamiento perfecto.</li>
	<li>Tubos de vacío frío 50 mL y sellos en la cámara o en hielo seco.</li>
	<li>Añadir una capa (aproximadamente 0.5 - 1.0 mL) de criosección medio sobre el sello frío y deje que congele hasta que esté blanca y sólida.</li>
	<li>Añadir una segunda capa de criosección mediano y coloque un cubo de miocardio en esta capa.</li>
	<li>Asegúrese de que el medio de criosección y miocardio se congelan completamente antes de continuar. Nota: Cuando el medio muestra y criosección no se congelan el seccionamiento se deteriorará. Medio de criosección completamente congelado da vuelta de fluida y transparente sólido, blanco y no transparente. Los cubos miocardio necesitan por lo menos 30 min hasta 1 h para congelar completamente si continuar inmediatamente en el paso 1.4. Cuando se congela el tejido no debe deformarse cuando tocó/manipulado con pinzas.</li>
	<li>Insertar sello con miocardio congelado en el soporte y apriete todos los tornillos.</li>
	<li>Recorte la superficie del tejido hasta obtener una superficie incluso seccionamiento.</li>
	<li>Sistema de seccionamiento a 300 μm de espesor.</li>
	<li>Sección del miocardio congelado con el seccionamiento automático. Esto garantiza que las secciones de corte uniforme. Pueden rebanar aproximadamente 30-40 secciones de un cubo.</li>
	<li>Coloque cada rebanada después de seccionar libremente en un tubo de 50 mL preenfriada. Nota: No presione el rodajas o el paquete firmemente. Aproximadamente 40 rebanadas pueden caber en un tubo.</li>
	<li>Cierre los tubos de llenado y coloque en hielo. Nota: Para poner en pausa ir con paso 2.14, de lo contrario continúe con el paso 3.2.</li>
	<li>Segmentos de miocardio tienda a-80 ° C. Las rebanadas se pueden almacenar durante varios meses.</li>
</ol>3. descelularización de miocardio humano rebanadas
<ol><li>Tomar el número necesario de tubos de 50 mL que contiene secciones de miocardio en el congelador de-80 ° C y el transporte en hielo.</li>
	<li>Transferencia de las secciones congeladas de todos los tubos de 50 mL del paso 3.1 en un vaso estéril. Aproximadamente 40 rebanadas se agregan en el vaso por el tubo de 50 mL. El vaso debe ser tres veces el volumen de los tubos de 50 mL; por ejemplo, de descelularización de un tubo de 50 mL, utilizar un vaso de precipitados de 150 mL.</li>
	<li>Añadir 50 mL de solución de lisis (10 mM de Tris, 0.1% peso/volumen de EDTA, pH 7,4 en H2O) por el tubo de 50 mL con divisiones de miocardio.</li>
	<li>Sacuda las rebanadas del miocardio en un vaso estéril de 100-150 RPM continuamente por 2 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Colar el líquido con las rebanadas de tejido a través de un colador grueso. Transferir los trozos de tejido con una pinza Roma a un vaso de precipitados estéril nuevo. Añadir 50 mL de SDS 0,5% en PBS por el tubo de 50 mL iniciales de rebanadas del miocardio (p. ej., 100 mL SDS solución cuando son ser decellularized dos tubos de 50 mL de secciones miocardio).</li>
	<li>Agitar continuamente durante 6 h a 100-150 rpm a temperatura ambiente.</li>
	<li>Colar el líquido con las rebanadas de tejido a través de un colador grueso. Transferir los trozos de tejido con una pinza Roma un nuevo vaso de precipitados estéril y lavar 3 veces con 50 mL de PBS durante 10 minutos agitando a 150 rpm. A continuación, Lave toda la noche en PBS con 1% de penicilina/estreptomicina y 1% nistatina (PBS-P/S-N) a 100-150 rpm y 4 º C agitando. Nota: Lavar bien es crucial para eliminar por completo cualquier SDS residual. Resto de SDS es tóxico cuando el ECM se utiliza en combinación con las células.</li>
	<li>Eliminar la solución de lavado y añadir 25 mL precalentado FBS (37 ° C) y 1% de penicilina/estreptomicina 1% nistatina a las rodajas de decellularized por el tubo de 50 mL iniciales de rebanadas de miocardio.</li>
	<li>Incubar durante 3 h a 37 ° C. En este paso, se elimina cualquier ADN restante de la matriz debido a la intrínseca actividad DNasa de la FBS.</li>
	<li>Transferir las rebanadas en un nuevo vaso estéril y lavar 3 veces con 50 mL de PBS durante 10 minutos agitando a 150 rpm. Nota: Las rodajas de ECM pueden guardarse en PBS-P/S-N a 4 ° C por varios días. Sin embargo, se recomienda proceder inmediatamente.</li>
</ol>4. procesamiento del cECM Decellularized a un polvo
<ol><li>Coloque las rebanadas de ECM libremente en una placa de 6 pozos estéril nuevo. Congelar el ECM a-80 ° C y liofilizar durante 2 días en un liofilizador. Nota: se puede colocar más de una rebanada por pozo. Arregle las rebanadas para cubrir totalmente la superficie del pozo. Superposición de las rebanadas no afecta el éxito de la posterior pulverización.</li>
	<li>Para la pulverización de la rebanada de ECM, fresado específicos uso tubos (véase Tabla de materiales) que contienen granos de 1,4 mm de cerámica. Llene los tubos libremente con ECM liofilizado con estériles pinzas embotadas. Para obtener resultados óptimos, se recomienda un peso total de ECM entre 10-20 mg. Nota: Si el ECM está lleno apretadamente en los tubos de fresado el proceso de pulverización se verán negativamente afectado.</li>
	<li>Rápido-congele los tubos en nitrógeno líquido. PRECAUCIÓN: nitrógeno líquido es extremadamente baja temperatura, utilice protección personal adecuada.</li>
	<li>
Inserte los tubos congelados en la máquina de moler y pulverizar el ECM.
	<ol>
<li>Establecer una duración de 30 s y un máximo de la velocidad e iniciar el dispositivo.</li>
		<li>Después de terminar, saque los tubos y snap-congelar de nuevo en nitrógeno líquido.</li>
		<li>Repita cinco veces.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave las micropartículas de los tubos mediante la adición de 1 mL ddH2O por el tubo y agitar o vórtice de solubilización completa. Filtrar la solución heterogénea a través de una malla de 200 μm en un tubo de 50 mL.</li>
	<li>Congelar el tubo de nitrógeno-80 ° C o líquido.</li>
	<li>Vuelva a colocar la tapa estándar del tubo con un filtro de 0,22 μm. Esta tapa de filtro evita que el polvo fluya fuera del tubo pero permite circulación de aire para la evaporación del agua.</li>
	<li>Insertar los tubos en el liofilizador y liofilizar otra vez para quitar el agua del paso (paso 4.5) Nota: Liofilización en este paso puede tardar hasta 3 días.</li>
	<li>Almacenar el polvo a-80 ° C hasta el procesamiento posterior o continúe con el paso 5.1.</li>
</ol>5. enzima basado homogeneización del cECM Micro-partículas
<ol><li>Disolver la pepsina porcina en 0.01 M HCl (pH 2.0) a una concentración de 1 mg/mL. Colocar en un agitador rotatorio a temperatura ambiente hasta que esté completamente disuelta.</li>
	<li>Disolver el polvo liofilizado de ECM humano (paso 4.8) en la solución de pepsina a una concentración final de 10 mg/mL. Mezclar bien mediante pipeteo. El volumen total depende de la cantidad de solución de ECM que necesita. Por ejemplo, disolver 10 mg de polvo de ECM en 1 mL de solución de pepsina. Nota: Disolución de las partículas puede apoyar a través de Vortex suave (1.000-1.500 RPM). Quedan grumos de micropartículas afectará negativamente la digestión.</li>
	<li>Transferir la solución a tubos de 2 mL con un volumen de 1 mL por tubo.</li>
	<li>Colocar los tubos en un agitador de tubos por 48 h a 27 ° C y 1.200 rpm.</li>
	<li>Sacar los tubos de la coctelera y coloque en hielo o en un soporte de tubo previamente enfriado.</li>
	<li>Mezcla 1/9 del volumen de la solución ECM de frío 10 x PBS (pH 7.4) con 1/10 del volumen de la solución ECM de frío 0,1 M NaOH en un lugar en el hielo y el tubo preenfriada. Esta mezcla se neutraliza la solución ECM digerida e inactivar irreversiblemente la pepsina.</li>
	<li>Añadir la solución de ECM a la neutralización mezcla y mezcla bien mediante pipeteo o vórtex.</li>
	<li>Establezca el ECM en la concentración deseada de 1 x PBS (pH 7.4). El pH de la solución puede comprobarse con papel pH. Nota: Ejemplo de cálculo para 10 mL había digerida solución ECM: Añadir 10 mg de pepsina porcina a 10 mL de HCl (pH 2.0). Añadir 100 mg ECM de polvo para solución de pepsina. Nota: Ejemplo de cálculo para neutralizar 10 mL había digerida solución ECM y ajustar la concentración a 8 mg/mL: VolFinal = cstart x Volstart / cFinal = 10 mg / mL x 10 mL / 8 mg/mL = 12,5 mL Vol10xPBS = VolInicio / 9 = 1/9 de 10 mL = 1,11 mL 10 x PBS Vol deNaOH = VolInicio / 10 = 1/10 de 10 mL = 1 mL Vol1xPBS = Vol VolFinal - Volstart -10xPBS - Vol deNaOH = 12,5 mL - 10 mL-.11 mL-1 mL = 0,39 mL</li>
</ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Al preparar el ECM miocardio humano, el objetivo es lograr lo siguiente: retiro de material celular inmunógenos relevante, preservación de la integridad de la ECM y bioactividad, esterilidad, no toxicidad del producto final, compatibilidad de procesos GMP, y idoneidad del producto para una aplicación determinada en términos de manejo. Combinando nuestro protocolo de descelularización de 3 pasos con tratamiento posterior en micropartículas o uno mismo-montaje de hidrogel, material humano de ECM cardiaca se obtiene que pos...

La matriz extracelular (ECM) proporciona no sólo estructural de apoyo pero también es importante para la célula biológica y función de tejidos1. En el corazón, el ECM participa en la regulación de las respuestas fisiopatológicas tales como fibrosis, inflamación, angiogénesis, función contráctil del cardiomiocito y viabilidad y destino de la célula del progenitor residente. Además de sus principales componentes fibrosos glicoproteínas, glicosaminoglicanos y proteoglicanos - contiene una serie de vesículas membranosas que contienen ácidos nucleicos y proteínas2,3, secretadas factores de crecimiento y citoquinas.
Recientemente ha quedado claro que preparados acelulares de ECM no sólo son inestimables para el estudio de las interacciones célula-matriz, sino también para posibles aplicaciones terapéuticas basadas en células. Ahora es ampliamente reconocida la importancia de proporcionar un entorno adecuado para productos celulares terapéuticos o ingeniería de tejidos. Ha habido intentos para combinar suspensiones celulares o compuestos activos con hidrogeles biopolímeros definido4,5,6 o con cócteles de proteína secretadas por las células del sarcoma murino (es decir, Matrigel, Geltrex) 7. sin embargo, los primeros son limitadas bioactividad, estos últimos son problemáticos en los procesos de calidad GMP y ambos carecen de la bioactividad específica de tejido cardiaco ECM (cECM)8,9,10, 11,12,13.
Descelularización del miocardio se ha realizado previamente por la perfusión del corazón entero a través de la vasculatura coronaria14,15. Mientras que esto es posible en animales corazones, corazones humanos intactos están raramente disponibles. Por lo tanto, fue favorecido un proceso de inmersión que permite la manipulación de las muestras de tejido obtenidas en la sala de operaciones. Nuestro protocolo "3 pasos" contiene 3 separado incubación pasos a saber: lisis, solubilización y extracción de ADN. Produce la ECM miocardio humana con en gran parte conservadas proteínas y glicosaminoglicanos composición16,17. Estas rebanadas cECM permiten estudios en vitro de las interacciones célula-matriz pero están mal adaptados para posibles aplicaciones terapéuticas de la escala humana. El proceso de fabricación se amplió entonces para producir micropartículas cECM liofilizado o un hidrogel cECM del18.
Este protocolo permite la descelularización de miocardio humano Obtenido de muestras quirúrgicas, preservación de los componentes principales de la matriz extracelular miocárdica (ECM) y su actividad biológica. Este protocolo se recomienda cuando ECM cardiaca humana con bioactividad específica de tejido conservada se requiere para estudios experimentales de las interacciones célula-matriz, o cuando se necesita un ambiente adecuado para regeneración miocárdica celular enfoques. En principio, también es posible adaptar este protocolo a las condiciones GMP-grado, para que el uso del cECM procesado debería ser factibles aplicaciones terapéuticas en el futuro.

<table><tbody><tr><td>Balanza</td><td>DR Precisa, Dietikon, Suiza</td><td>Cuchillas Precisa XR 205SM</td><td></td></tr><tr><td>Nr.10 Skalpell Nr.3</td><td>InstrumenteNRW, Erftstadt, Alemania</td><td>SK-10-004</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo celular (6 pocillos)</td><td>Greiner, Frickenhausen, Alemania</td><td>657160</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat CM</td><td>Leica, Wetzlar, Alemania</td><td>3050S</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>8043.3</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de reacción Eppendorf (1,5 o 2 ml)</td><td>Greiner, Frickenhausen, Alemania</td><td>616201, 623201</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml, 50 ml</td><td>Greiner, Frickenhausen, Alemania</td><td>188271, 227270</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Biochrome, Berlín, Alemania</td><td>S 0115</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de liofilización</td><td>Labconco, Kansas City, EE. UU</td>. <td>7670520</td><td></td></tr><tr><td>Congelador (-80 ° C; C)</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU</td>. <td>Forma 900 Series</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>281.1</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas de micrótomo tipo 819</td><td>Leica, Wetzlar, Alemania</td><td>14035838925</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de minilys</td><td>PEQLAB Biotechnologie GmbH, Erlangen, Alemania</td><td>91-PCSM</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>K021.1</td><td></td></tr><tr><td>Nistatina</td><td>PAN Biotech, Aidenbach, Alemania</td><td>P06-07800</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Scientific, Waltham, MA, EE. UU.</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/estreptomicina</td><td>Life Technologies, Darmstadt, Alemania</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania</td><td>P6887-1G</td><td></td></tr><tr><td>Precellys Keramik-Kit 1,4 mm</td><td>Peqlab Biotechnolgie, Erlangen, Alemania</td><td>91-PCS-CK14</td><td></td></tr><tr><td>Rotamax 120 Agitador de placas</td><td>Heidolph, Schwabach, Alemania</td><td>544-41200-00</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>CN30.3</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica, Wetzlar, Alemania</td><td>M125</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip-GP, 0,22 &micro; m</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Alemania</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Stuart mezcladores analógicos de balancín y rodillos</td><td>Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemania</td><td>Z675113-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek O.C.T compound</td><td>Hartenstein, Würzburg, Alemania</td><td>TTEK</td><td></td></tr><tr><td>Set de transfusión 200&micro; m</td><td>Sarstedt, N&uuml; mbrecht, Alemania</td><td>798.200.500</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Carl Roth, Karlsruhe, Alemania</td><td>5429.3</td><td></td></tr><tr><td>vedena Skalpellgriff Fig. 3, estándar, 125 mm</td><td>Aspectos médicos destacados, Rohrdorf, Alemania</td><td>CV102-003</td><td></td></tr><tr><td>Vortex-Genie2</td><td>Scientific Industry, Nueva York, EE. UU</td>. <td>SI-0256</td><td></td></tr></tbody></table>

procesamiento de tejido cardiaco humano hacia la matriz extracelular autoensamblada hidrogel para aplicaciones in vivo y in vitro

Processing of Human Cardiac Tissue Toward Extracellular Matrix Self-assembling Hydrogel for In Vitro and In Vivo Applications

Preparación de la matriz extracelular acelular es útiles para estudiar las interacciones célula-matriz y facilitar las aplicaciones de la terapia celular regenerativa. Varios productos comerciales matriz extracelular están disponibles como hidrogeles o membranas, pero estas no poseen actividad biológica específica de tejido. Porque descelularización de perfusión no es generalmente posible con tejido cardíaco humano, desarrollamos un proceso de descelularización de inmersión de 3 pasos. Rebanadas miocardio humanos adquiridos durante la cirugía se tratan primero con tampón de lisis hiperosmolar libre de detergente, seguido por la incubación con lo iónicos detergente, dodecil sulfato de sodio, y el proceso se completa mediante la explotación de la actividad de la ADNasa intrínseca de suero bovino fetal. Esta técnica resulta en hojas sin células de la matriz extracelular cardiaca con conserva en gran parte tejido fibroso arquitectura y Biopolímeros composición, que fueron demostradas para proporcionar señales ambientales específicos a poblaciones de la célula cardiaca y vástago de pluripotent células. Hojas de matriz extracelular cardiaca pueden entonces más procesadas en un polvo de micropartículas sin mayor modificación química, o, mediante digestión de pepsina a corto plazo, en un hidrogel uno mismo-montaje de la matriz extracelular cardiaca con conserva bioactividad.

El protocolo de 3 pasos de descelularización de miocardio humano presentamos resultados en la eliminación casi total de material celular, conservando los componentes clave del ECM y la estructura fibrilar del ECM. Después de descelularización, la extracción bruta de las células de los tejidos es evidente por el cambio de color (figura 1A). El análisis histológico con manchas de H &amp; E y TRICROMICA de Masson reveló la ausencia completa de células intactas r...

Este protocolo describe la descelularización completa del miocardio humano conservando sus componentes de matriz extracelular. Tratamiento posterior de los resultados de la matriz extracelular en la producción de micropartículas y un hidrogel de uno mismo-montaje de citoprotectores.

Procesamiento de tejido cardiaco humano hacia la matriz extracelular autoensamblada hidrogel para aplicaciones In Vivo y In Vitro

Acellular extracellular matrix preparations are useful for studying cell-matrix interactions and facilitate regenerative cell therapy applications. ...

El objetivo general de este procedimiento es procesar la matriz extracelular cardíaca en un hidrogel, lo que permite estudiar el efecto de la matriz en varios ensayos basados en células. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo cardíaco, como cómo la matriz extracelular afecta el comportamiento celular. La principal ventaja de esta técnica es que facilita el uso de la matriz extracelular para hacer experimentos a gran escala in vitro o in vivo.Las aplicaciones de esta técnica pueden extenderse hacia una terapia para el infarto de miocardio porque la matriz puede proporcionar señales esenciales de supervivencia. Para comenzar el experimento, utilice un bisturí estéril con una hoja número diez, para eliminar el tejido graso de un miocardio ventricular izquierdo obtenido previamente. Corta el miocardio en cubos de aproximadamente 1 por 1 por 1 cm, usando un bisturí.A continuación, coloque los cubos en un tubo estéril de 50 ml. Guarde los tubos que contienen los cubos a 80 grados centígrados. Saque el tubo que contiene los cubos preparados del congelador y transpórtelo en hielo al criostato.Ajuste la temperatura del objeto y de la cámara del criostato a 15 grados centígrados. Enfríe los tubos vacíos de 50 ml y los sellos en la cámara. Agregue una capa de medio de criosección sobre el sello frío y deje que se congele hasta que esté blanco y sólido.Agregue una segunda capa de medio de criosección y coloque un tubo de miocardio en la segunda capa. Asegúrese de que el medio de criosección y el miocardio estén completamente congelados. A continuación, inserte el sello con miocardio congelado en el soporte y apriete todos los tornillos.Recorte la superficie del tejido hasta obtener una superficie de sección uniforme. Seccionar el miocardio congelado con corte automático para garantizar secciones de corte uniformes. Se pueden cortar aproximadamente de 30 a 40 secciones de un cubo.Coloque cada rebanada, después de seccionarla, sin apretar en un tubo de 50 ml preenfriado. Cierre los tubos llenos y colóquelos sobre hielo. Transfiera las secciones congeladas de todos los tubos de 50 ml a un vaso de precipitados estéril.Añadir 50 mL de solución de lisis por tubo de 50 mL que contenga rodajas de miocardio. A continuación, agite las rodajas de miocardio en un vaso de precipitados estéril. Cuela el líquido con las rodajas de pañuelo a través de un colador grueso.A continuación, transfiera las rodajas de papel con una pinza sin filo a un nuevo vaso de precipitados estéril. Agregue 50 mL de SDS al 0.5% en PBS por tubo inicial de 50 mL de cortes de miocardio. Agite el vaso de precipitados continuamente durante seis horas a 100-150 rpm a temperatura ambiente.Después de agitar, cuele el líquido con las rodajas de papel a través de un colador grueso. Con una pinza sin filo, transfiera las rodajas de pañuelos a un nuevo vaso de precipitados estéril y lave las rodajas tres veces con 50 ml de PBS. A continuación, lave las rodajas durante la noche en PBS, con 1% de penicilina estreptomicina y 1% de nistatina.Al día siguiente, retire la solución de lavado y agregue 25 mL de FBS precalentado a 37 grados centígrados con estreptomicina de penicilina al 1% y nistatina al 1%, a las rodajas descelularizadas por tubo inicial de 50 mL de láminas de miocardio. Incubar las rodajas durante tres horas a 37 grados centígrados para eliminar cualquier resto de ADN de la matriz. A continuación, transfiera las rodajas a un nuevo vaso de precipitados estéril y lávelas tres veces con 50 ml de PBS.Coloque las rebanadas de ECM sin apretar en una nueva placa estéril de seis pocillos. Congele el ECM a 80 grados centígrados y liofícelo durante dos días en un liofilizar. Para la pulverización de la loncha ECM, utilice tubos de fresado que contengan perlas cerámicas de 1,4 mm.Llene los tubos sin apretar con ECM liofilizado, utilizando pinzas estériles y romas. Congele los tubos en nitrógeno líquido. Inserte los tubos congelados en la fresadora y pulverize el ECM.Establezca la duración en 30 segundos, ajuste la velocidad máxima e inicie el dispositivo. Después de la pulverización, saque los tubos y congélelos nuevamente en nitrógeno líquido. Lave las micropartículas de los tubos, agregando 1 mL de ddH20 por tubo, y agite para una solubilización completa.Luego, filtre la solución heterogénea a través de una malla de 200 micrómetros, en un tubo de 50 mL. Congele el tubo en nitrógeno líquido. Reemplace la tapa estándar del tubo con un filtro de 0,22 micrómetros para evitar que el polvo fluya fuera del tubo.Inserte el tubo en el liofilizador y vuelva a liofilizar para eliminar el agua del paso de lavado. Disolver el polvo de MEC humana liofilizada previamente preparado en una solución de pepsina, hasta una concentración final de 10 mg por ml. Transfiera la solución a tubos de 2 mL con un volumen de 1 mL por tubo.Pipetear la solución para mezclar bien. A continuación, coloque los tubos en el agitador y agite a 1200 rpm durante 48 horas a 27 grados centígrados. Saque los tubos de la coctelera y colóquelos sobre hielo o un soporte de tubo preenfriado.Mezcle 1/9 del volumen de la solución de ECM de PBS 10X frío, con 1/10 de un volumen de solución de ECM de hidróxido de sodio frío 0,1 molar, en un tubo preenfriado y colóquelo en hielo para neutralizar la solución de ECM digerida e inactivar la pepsina. Finalmente, agregue la solución de ECM a la mezcla de neutralización y mezcle bien a través de pipeteo o vórtice. Los ensayos cuantitativos para los componentes individuales de la MEC revelaron una eliminación más completa del ADN y una mejor conservación del colágeno total, la elastina y los glicosominoglicanos en comparación con la descelularización por SDS sola.La RT-PCR se utilizó para cuantificar la expresión de proteínas estructurales de cardiomiocito, factores de transcripción cardiomiogénica temprana y tardía y genes marcadores de superficie de células endoteliales en ESC murinos, en proceso de diferenciación espontánea. El contacto con cECM impulsa las células madre pluripotentes, preferiblemente hacia un fenotipo similar al cardiomiocito. La microscopía óptica de contraste de fase demuestra que la digestión enzimática del cECM durante 48 horas da como resultado una solución de ECM más homogeneizada.La tinción viva/muerta de fibroblastos cardíacos humanos en hidrogel cECM, muestra una mayor viabilidad. Tanto las micropartículas de cECM como el hidrogel de cECM mejoran la actividad metabólica de las células contráctiles HL-1, en condiciones isquémicas, en comparación con las células en cultivo estándar. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en una semana desde el tejido hasta el hidrogel, si se realiza correctamente.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la regeneración cardíaca exploraran los efectos de la matriz extracelular cardíaca, en sistemas modelo in vitro e in vivo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Los métodos para preparar una matriz de gel inyectable de tejidos descelularizada e inyectarlo en ratas...

Fabricación de materiales de origen biológico inyectable para ingeniería de tejidos del miocardio

Se describe el aislamiento de los cardiomiocitos neonatales y la preparación de las células para la encapsulación en las construcciones de hidrogel de fibrina para ingeniería de tejidos. Se describen los métodos para el análisis de la ingeniería tisular miocardio después del período de la cultura como fuerza activa generada a la estimulación eléctrica y la viabilidad celular y tinción inmunohistoquímica.

La encapsulación de los cardiomiocitos en un hidrogel de fibrina para ingeniería de tejidos cardíacos

Este manuscrito describe la creación de tejidos cardíacos de ingeniería definidos utilizando la expresión de marcadores de superficie y la clasificación de células. Los tejidos definidos se pueden utilizar en un biorreactor multitejido para investigar los mecanismos de la terapia celular cardíaca con el fin de proporcionar un sistema modelo funcional, pero controlado, del corazón humano.

Construcción de Engineered Definido Humanos cardíacos tejidos para estudiar los mecanismos de la terapia celular cardiaca

Aquí, se muestra la generación de tejido del corazón ingeniería humana a partir de células madre pluripotentes inducidas (hiPSC) derivada de los cardiomiocitos. Se presenta un método para analizar la fuerza de contracción y la alteración ejemplar de patrón de contracción por el hERG inhibidor del canal E-4031. Este método muestra alto nivel de robustez y la idoneidad para la detección de drogas cardíaco.

Análisis automatizado contracción de ingeniería tisular para la Detección del Corazón Humano cardíaca Drug Safety

Este método permite la descelularización de un órgano sólido complejo utilizando un protocolo simple basado en choque osmótico y perfusión de detergente iónico con una interrupción mínima del órgano matriz. Se compone de una técnica de descelularización novela para los corazones humanos dentro de una bolsa presurizada con monitoreo en tiempo real de flujo dinámica y celulares residuos de la salida.

Descelularización de todo humano corazón dentro de una bolsa presurizada en una orientación invertida

El presente protocolo genera tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla que contienen células cardiovasculares derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el hombre para permitir la investigación de la terapia de implantación celular para enfermedades del corazón.

Preparación de tejidos cardíacos de ingeniería en forma de malla derivados de células iPS humanas para la reparación del miocardio In Vivo

La terapia basada en células madre ha surgido como una estrategia eficiente para reparar los tejidos cardíacos lesionados después del infarto de miocardio. Proporcionamos una aplicación in vivo óptima para el trasplante de células madre utilizando hidrogeles de gelatina que son capaces de ser enzimáticamente cruzados.

Trasplante intramiocardio de hidrogeles inyectables msc-loading después de infarto de miocardio en un modelo murino

El objetivo de este protocolo es explicar y demostrar el desarrollo de un modelo microfluídico tridimensional (3D) de tejido cardíaco humano altamente alineado, compuesto por cardiomiocitos derivados de células madre co-cultivados con fibroblastos cardíacos (CF) dentro de un hidrogel biomimético a base de colágeno, para aplicaciones en ingeniería de tejido cardíaco, detección de fármacos y modelado de enfermedades.

Desarrollo de tejido cardíaco humano organizado en 3D dentro de una plataforma microfluídica

Aquí se presenta un conjunto de protocolos para la generación y criopreservación de esferoides cardíacos (CS) a partir de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos cultivados en un formato multidimensional de alto rendimiento. Este modelo tridimensional funciona como una plataforma robusta para el modelado de enfermedades, exámenes de detección de alto rendimiento y mantiene su funcionalidad después de la criopreservación.

Generación, detección de alto rendimiento y biobancos de esferoides cardíacos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos

Los fibroblastos aislados del corazón humano adulto se cultivaron para confluir en placas recubiertas de gelatina para producir la matriz extracelular específica del miocardio. Después de la descelularización, este sustrato se puede utilizar para el cultivo y estudio de otras células cardíacas y las interacciones célula-matriz.

Producción de Matriz Extracelular Cardíaca a partir de Fibroblastos Humanos Adultos para el Recubrimiento de Placas de Cultivo

Se presenta un método reproducible para generar tejidos miocárdicos en 3D combinando andamios de escritura por electrohilatura por fusión (MEW), policaprolactona (PCL) e hidrogeles de fibrina con cardiomiocitos y fibroblastos derivados de hiPSC. Esta técnica ofrece un control preciso sobre la arquitectura del andamio y se puede aplicar en pruebas preclínicas de medicamentos y modelado de enfermedades cardíacas.

Generación de tejido miocárdico humano en 3D mediante escritura por electrohilado de fusión de andamios de policaprolactona y células cardíacas derivadas de hiPSC

Aprende a procesar matriz extracelular cardíaca humana en hidrogel autoensamblado para ensayos celulares in vitro e in vivo. Esta técnica de descelularización preserva componentes esenciales para estudios de ingeniería tisular cardiaca.

Procesamiento de tejido cardiaco humano hacia la matriz extracelular autoensamblada hidrogel para aplicaciones In Vivo y In Vitro (Video) | JoVE Journal

Procesamiento de tejido cardiaco humano hacia la matriz extracelular autoensamblada hidrogel para aplicaciones In Vivo y In Vitro

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