Name: Diferenciación de megacariocitos y plaquetas formación de humanos CD34 derivadas de sangre de la cuerda+ de las células (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-12-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 46 s
Description: Aprenda a aislar células CD34+ de sangre de cordón umbilical humano para estudiar la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas. Este método permite investigar la megacariopoiesis con alta pureza celular.

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Los autores reconocen el apoyo de la salud australiano y el Consejo de investigación médica (proyecto grant 1012409 ligado a CSF).

Este protocolo fue aprobado por el Sur Oriental Sydney humano investigación Comité de ética y ratificado por el Comité de ética de investigación humana de la Universidad de New South Wales. Sangre del cordón umbilical obtenida de donantes sanos fue proporcionada por el Sydney cable de banco de sangre (Sydney, NSW, Australia). Se utilizaron volúmenes de 100 mL aproximadamente para este procedimiento.
Nota: Trabajo en un gabinete utilizando una técnica aséptica de bioseguridad clase II. Descontaminar el exterior de la bolsa de sangre de cordón con etanol al 70%. Utilizar instrumentos estériles (tijeras, pinzas) para este procedimiento.
1. cable de célula de sangre preparación y aislamiento de CD34 de las células+
<ol>
	<li>Preparar el tampón estéril separación (SB) con tampón fosfato salino (PBS), pH 7.2, y que contengan 0,5% bovino albúmina sérica y 2 mM EDTA.</li>
	<li>Pipetear 10 mL de SB en un tubo cónico de 50 mL (se requiere un tubo 10 mL de sangre). Utilizando una aguja Roma G18 montada en una jeringa de 10 mL, 10 mL de sangre de sacar de la bolsa y pipetear en los tubos de 50 mL que contiene 10 mL de SB.</li>
	<li>Añadir 15 mL de medio de separación de linfocitos (véase Tabla de materiales) a la parte inferior del tubo que contiene la sangre diluida, creando dos capas. Nota: Servir los medios de comunicación poco a poco en la parte inferior del tubo para evitar mezclar las diferentes capas.</li>
	<li>Centrifugar tubos a 1.200 × g durante 30 min a temperatura ambiente (RT) sin interrupción y sin aceleración.</li>
	<li>Transferir la capa cerca del centro del tubo que contiene las células mononucleares (aproximadamente 5-10 mL de cada tubo) en un nuevo tubo de 50 mL con una pipeta Pasteur. Añadir SB a cada tubo un volumen total de 50 mL.</li>
	<li>Centrifugar a 400 × g durante 10 min en RT. descartar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender el pellet celular cuidadosamente con una pipeta Pasteur en 5-10 mL de SB combinan las células suspendidas y volumen a 50 mL con SB.</li>
	<li>Cuenta las células utilizando tinción Trypan azul y un hemocitómetro o automatizado de la célula contra (véase Tabla de materiales). Para determinar el porcentaje de CD34+ las células en la muestra, resuspender 2.5 × 105 células en 100 μl de SB y la mancha mediante la adición de 10 μl de anticuerpo anti-CD34-PE 15-30 min a 4 ° C. Análisis por citometría de flujo (figura 1A).</li>
	<li>Tubos de centrífuga en 400 × g por 10 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante. Nota: Si no requiere inmediatamente, las células mononucleares se pueden congelar en este momento.</li>
	<li>Resuspender las células en 300 μL de SB 108 células. Añada 100 μl de FcR de IgG humana (bloqueo reactivo, véase Tabla de materiales) y 100 μl de granos magnéticos de CD34 por 108 células. Mezclar suavemente e incubar a 4 ° C durante 30-40 minutos. Nota: Se requiere que una suspensión unicelular (si es necesario, pasar las células aunque un filtro de 30 μm antes de añadir los reactivos). Utilizar volúmenes de reactivo descritos aquí para 108 células o menos. Para más de 108 células, escale los reactivos (SB, bloqueando la solución y bolas magnéticas CD34) en consecuencia.</li>
	<li>Preparar la columna de la separación de LS durante el período de la incubación colocando la columna LS en un soporte magnético y lavado con 3 mL de SB desechar el efluente. Nota: Las columnas de separación de LS se pueden cargar con hasta 2 × 108 células totales. Columnas más pequeñas y más grandes están disponibles.</li>
	<li>Añadir 5-10 mL de SB a la mezcla de células y centrifugar a 400 x g durante 10 minutos eliminar el sobrenadante.</li>
	<li>Resuspender las células en 1,5 mL de SB y carga la suspensión celular (1.5 mL) en la columna de LS. Recoge el flujo a través de las células sin etiqueta en un tubo de colección de 15 mL (fracción negativa #1). Deje que el líquido escurrir y lavar la columna con 1,5 mL de SB.</li>
	<li>Carga el flujo recogido a través de (3 mL) en la columna y recoge el flujo a través del mismo tubo de colección de 15 mL (fracción negativa #1). Lavar la columna LS 3 veces con 3 mL de SB. Nota: Si es necesario, las células de la fracción negativa (12 mL) pueden ser teñidas con anticuerpos anti-CD34 para determinar la captura de CD34 de las células+ por la columna de LS.</li>
	<li>Quitar columna de separador magnético y lave las células lentamente con el émbolo de una jeringa en un nuevo tubo de 15 mL con 2 mL de SB.</li>
	<li>Coloque la columna en separador magnético y 2 mL de células de carga en la columna. Recoge el flujo a través y lavar con 2 mL SB. Se trata de la fracción negativa #2 (4 mL).</li>
	<li>Quitar LS columna de separador magnético y añadir 2 mL de SB ras células firmemente y constantemente con un émbolo de la jeringa para recoger el CD34+ fracción de la célula. Contar las células con tinción de azul de tripano y un hemocitómetro o contador de células automatizado.</li>
	<li>Tubo de centrífuga con la fracción positiva a 400 x g durante 15 min a 4 ° C. Deseche el sobrenadante. Resuspender las células en medios libres de suero para CD34+ las células (SFM, véase Tabla de materiales). Nota: Si no requiere inmediatamente, las células pueden ser congeladas en nitrógeno líquido en esta etapa.</li>
</ol>
2. Check pureza de CD34 aisladas células+
<ol>
	<li>2 x 104 células de la fracción positiva con 10 μl anti-CD34-PE y el anticuerpo 20 μl anti-CD45 PerCP durante 15 min a 4 ° C (uso tubo separado para los controles de isotipo) de la mancha (figura 1B).</li>
	<li>Añadir 1 mL de SB para lavar. Centrifugar a 400 x g durante 10 minutos pellet resuspender en 200 μL de SB.</li>
	<li>Realizar análisis cytometric del flujo y la población de células vivas para excluir los residuos (figura 1B) de la puerta. La puerta para PE y PerCP poblaciones positivas usando los PE y PerCP isotipo (figura 1B) y determinar el porcentaje de CD34+/CD45+ las células.</li>
</ol>
3. diferenciación de megacariocitos
<ol>
	<li>Semilla 5 × 105 células/mL CD34+ de las células en 2 mL de SFM suplementado con 50 ng/mL trombopoyetina humana recombinante (rhTPO) por pozo en una placa de 12 pozos. Incube las células a 37 ° C, 5% CO2 en un ambiente humidificado. Si las células son confluentes, antes de que se requiere para el análisis, cosechar las células y dividir en varios pozos con medio fresco y rhTPO. Nota: Dos o tres pozos deben estar preparados específicamente para controlar la diferenciación en diferentes puntos temporales (por ejemplo, días 7, 9 y 10).</li>
	<li>Cosechar las células de los pozos para monitorear la diferenciación sin molestar a las células en los otros pozos.</li>
	<li>Tinción de las células con el anticuerpo de anti-GPIIb/CD41-FITC de 20 μl y 10 μl anti-GPIX/CD42a-Alexa Fluor 647 el anticuerpo en un volumen final de 100 μl. establecer un control tubo usando los anticuerpos de control respectivo isotipo. Incube durante 15-30 min a 4 ° C.</li>
	<li>Añadir 1 mL de SB para lavar.</li></ol>Centrifugar a 400 x g durante 10 minutos, descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 200-300 μL de SB analizar mediante citometría de flujo.
	<li>Para cada fluoróforo, analizar los controles de isotipo para la compuerta para FITC y Alexa harina 647 poblaciones positivo. Analizar las muestras de células teñidas para determinar el porcentaje de CD41+/CD42a+ doble las células positivas, que representan el MK maduro (figura 1).</li>
	<li>Para la visualización microscópica de la célula marcadores de superficie manchan las células como se describe en 3.3.<ol>
		<li>Añadir 1 mL de SB para lavar. Centrifugar a 400 x g durante 10 minutos Resuspender el precipitado en 100 μl de SB y centrifugado sobre un portaobjetos de vidrio a 1.000 x g por 5 min fijar las células en la diapositiva por inmersión en metanol por 30 s. aire seco, añadir 20 μl de montaje multimedia con DAPI (véase Tabla de materiales) , cubrir con un cubreobjetos y visualizar utilizando un microscopio de fluorescencia (figura 2A).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para la visualización de antígenos intracelulares, resuspender las células en PBS y se fijan con paraformaldehído (concentración final de 1%) durante 15 min a temperatura ambiente. Para permeabilizar las células, agregar triton-X 100 (0.1%) e incubar durante 15 minutos las células de lavado con 2 mL PBS/0.1% triton-X 100. Resuspender en 100 μl de PBS/0.1% triton-X 100, añadir anti vWf y anti anticuerpos CD62p (dilución 1: 200) e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.<ol>
		<li>Lavar con 2 mL PBS/0.1% triton-X 100 centrifugar a 400 x g durante 10 min, resuspender en 100 μl de la solución de la misma y añadir anti-mouse IgG-Alexa 594 y anti-rabbit IgG-Alexa 488 (1: 100). Incubar durante 30 min a temperatura ambiente, lavar con 2 mL PBS/0.1% triton-X 100, resuspender en 100 μl de la solución de la misma y añadir 20 μl de anti CD42b-APC. Luego girar las células en portaobjetos, como se describe en el paso 3.6.1 y preparar muestras para visualización microscópica como se describe en el paso 3.6.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para la determinación de la ploidía, cosechar las células a los días 12 y 13 de la diferenciación. Añadir 1 mL de SB para lavar. Centrifugar a 400 x g por 10 min y tinción con anticuerpos de anti-GPIIb/CD41-FITC de 20 μl en un volumen final de 100 μl. incubar a 4 ° C durante 30 minutos.<ol>
		<li>Lavar una vez con 1 mL de SB y resuspender el precipitado en 300 μL de hipotónica citrato buffer (citrato de sodio 1,25 mM, 2,5 mM cloruro sódico, dextrosa 3,5 mM) que contiene 20 μg/ml propidio y 0.05% Triton-X 100. Incubar por 15 min a 4 ° C protegido de la luz.</li>
		<li>Añadir Rnasa a una concentración final de 20 μg/mL e incubar durante 30 min a 4 ° C protegido de la luz. Determinar la intensidad de yoduro de propidio por citometría de flujo por la recogida de 30.000 a 50.000 eventos de la población de CD41-FITC+ (figura 2).</li>
	</ol>
	</li>

4. proplatelet contando enumeración plaquetaria y activación de las plaquetas
<ol>
	<li>Las células (del paso 3.1) la cosecha en días 8 o 9 de la diferenciación y la semilla a 1 × 104 células/pozo en placas de 48 pocillos en 200 μL de fresco SFM suplementado con 50 ng/mL rhTPO. Cultura durante 5 días a 37 ° C, 5% CO2. Nota: Para efectos de cuantificación, semilla pozos por triplicado. Esta baja densidad es necesaria para la visualización y contando del proplatelet-cojinete MK. Proplatelets generalmente comienzan a aparecer después de 2 días de la cultura. El pico es entre los días 4 y 5.</li>
	<li>Contar el número de proplatelet-rodamiento de MK en el pozo todo en un microscopio de luz invertido usando 10 X o 20 X objetivos. Nota: Una platina caliente (37 ° C) del microscopio es preferible, puesto que mantiene las células a temperatura ambiente durante períodos prolongados causa contracción de las extensiones proplatelet. Proplatelets se observan largas extensiones del cuerpo de MK. Cada MK tenga varias protuberancias proplatelet. Como desarrollar el proplatelets, el cuerpo del MK disminuye en tamaño.</li>
	<li>Cosecha de las células y centrifugar a 400 x g durante 10 min a temperatura ambiente. Mancha las células con 20 μl anti-FITC CD41 anticuerpo, como se describe en los pasos 3.3 y 3.4. Calcular el porcentaje de MK proplatelet rodamiento (pbMK): pbMK (%) = [(Proplatelet-cojinete MKs/well) / (CD41 Total+ células / pozo)] x 100</li>
	<li>Para contar plaquetas liberadas en el medio de cultivo, las células se mezclan con una pipeta Pasteur y recoger 100 μl a los días 14 o 15 de la cultura.<ol>
		<li>La mancha con 20 μl anti-FITC CD41 anticuerpo para 20-30 min a 4 ° C. Configurar un tubo de control utilizando el anticuerpo control de isotipo correspondiente.</li>
		<li>Añadir 150 μL de SB y 50 μl de contar los granos.</li>
		<li>Para el análisis cytometric del flujo, establece el FSC y SSC conectarse escala. Plaquetas sanguíneas humanas normales del uso de plasma rico en plaquetas teñidas con FITC CD41 como se describe en la sección 4.4.1 establecer la sincronización de las plaquetas (Figura 3A).</li>
		<li>Analizar las plaquetas manchadas con perlas de conteo por citometría de flujo. Recoger 1.000 eventos de contar cuentas usando el FSC frente a diagrama de dispersión SSC (Figura 3A). Calcular el número de plaquetas basado en CD41-FITC eventos positivos (figura 3B) utilizando la fórmula: Plaquetas por μl = [(número de sucesos positivos CD41-FITC)/1,000 beads)] x [(number of beads in 50 µL)/volumen de la muestra)]</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Analizar la activación plaquetaria, suavemente las células se mezclan con una pipeta Pasteur y recoger 100 μl a los días 14 o 15 de la cultura. Añadir 1 mL de tampón (NaCl 137 mM, 2,7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1,8 mM CaCl2, 0,2 mM Na2HPO4, 12 mM NaHCO3, 5,5 mM D-glucosa, pH 6,5) y centrifugadora de Tyrode a 200 x g durante 5 minutos para que sedimenten las células.<ol>
		<li>Recoger el sobrenadante y centrifugue a 800 x g durante 10 minutos para que sedimenten las partículas de tamaño de plaquetas.</li>
		<li>Deseche el sobrenadante y resuspender en 100 μl de buffer de Tyrode. Añadir 20 μl del anticuerpo PAC1-FITC y Adenosín difosfato (ADP) a una concentración final de 20 μm. incubar a temperatura ambiente durante 20 minutos analizar mediante citometría de flujo para determinar el porcentaje de sucesos positivos FITC. Uso de plaquetas humanas frescas tratadas en la misma forma que un control positivo (figura 3).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Nakeff, A., Maat, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+of+megakaryocytes+from+mouse+bone+marrow+by+velocity+sedimentation%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Separation of megakaryocytes from mouse bone marrow by velocity sedimentation.</a> Blood. 43 (4), 591-595 (1974).</li>
<li>Zeigler, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+megakaryocytopoietic+and+thrombopoietic+activity+of+c-mpl+ligand+%28TPO%29+on+purified+murine+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">In vitro megakaryocytopoietic and thrombopoietic activity of c-mpl ligand (TPO) on purified murine hematopoietic stem cells.</a> Blood. 84 (12), 4045-4052 (1994).</li>
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<li>Feng, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+generation+of+universal+platelets+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+cell+reports%22%5BJournal%5D)">Scalable generation of universal platelets from human induced pluripotent stem cells.</a> Stem cell reports. 3 (5), 817-831 (2014).</li>
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<li>Iraqi, M., Perdomo, J., Yan, F., Choi, P. Y. I., Chong, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+thrombocytopenia%3A+antiplatelet+autoantibodies+inhibit+proplatelet+formation+by+megakaryocytes+and+impair+platelet+production+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Immune thrombocytopenia: antiplatelet autoantibodies inhibit proplatelet formation by megakaryocytes and impair platelet production in vitro.</a> Haematologica. 100 (5), 623-632 (2015).</li>
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<li>Chong, B. H., Choi, P. Y. I., Khachigian, L., Perdomo, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23714310">Drug-induced Immune Thrombocytopenia.</a> Hematol Oncol Clin North Am. 27 (3), (2013).</li>
<li>Stasi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Idiopathic+thrombocytopenic+purpura%3A+Current+concepts+in+pathophysiology+and+management%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Idiopathic thrombocytopenic purpura: Current concepts in pathophysiology and management.</a> Thromb Haemost. 99 (1), 4-13 (2008).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito aquí es conveniente para la producción constante de MK y plaquetas en la cultura de la sangre del cordón umbilical. Estas células se pueden utilizar para estudiar varios procesos tales como el efecto de drogas o actividades biológicas sobre la proliferación de MK, diferenciación, formación proplatelet y producción de plaquetas.
Una variedad de medios de cultivo y combinaciones de citoquinas se han presentado en la literatura. Además de las citoquinas como el factor de cél...

Aislamiento de suficiente número de megacariocitos primarias humanas (MK) para uso en laboratorio regular no es factible debido a su baja frecuencia en la médula ósea, donde representan el ~0.01% de las células nucleadas1. Una alternativa conveniente es la expansión ex vivo y diferenciación de vástago de hematopoietic y células progenitoras en la presencia de factores de crecimiento específicos. Un número de citoquinas como factor de la célula de vástago (SCF; ligando c-kit) y el interleukin (IL) -3 y IL-11 ha sido empleadas en sistemas de cultivo para producir MKs. Thrombopoietin (TPO) es el factor más eficaz de crecimiento y la diferenciación megakaryocytic culturas y es eficaz solo o con otras citoquinas, como SCF y IL-32. TPO puede actuar sobre las poblaciones de células madre para dar lugar a la proliferación y maduración de MKs2.
Plaquetas de productos MK de protuberancias citoplasmáticas llamadas proplatelets y, en vivo, aproximadamente 1 x 1011 plaquetas formado diariamente para mantener las cuentas de plaqueta de 150-400 x 109plaquetas /L. producción en vitro es hasta 1000 -pliegue más bajo que el en vivo estima3, y esto ha dado lugar a numerosas condiciones de cultivo usando CD34+ células progenitoras hematopoyéticas para mejorar MK y plaquetas producción en vitro. La fuente inicial de CD34+ las células utilizadas para diferenciación de MK era sangre periférica4. Otras fuentes de células incluyen médula ósea5,6, inducido células madre embrionarias pluripotentes células madre (ESC/iPSC)7y cordón umbilical sangre (UCB)8,9,10 . Médula ósea humana CD34+ 11 y ratón linaje negativo médula células5 productos MK y las plaquetas in vitro; sin embargo, la falta de disponibilidad de médula ósea humana limita su uso como fuente de CD34+ las células. Por el contrario, ESC y iPSC representan una fuente ilimitada de células para la producción de plaquetas en vitro . Plaquetas la producción de estas células requiere células de alimentador como células murinas de OP9 y períodos más largos de la cultura. Plaquetas en condiciones libres de alimentación parecen ser menos funcional12. iPSC-derivado de las plaquetas están probable que sean de uso en contextos clínicos puesto que puede ser ampliados a gran escala. Este proceso requiere transducción mediada por lentivirales de factores de transcripción y a largo plazo de la célula cultura13.
UCB es una fuente accesible de CD34+ las células que se pueden usar en ajustes de la investigación. TPO solo puede promover la diferenciación de cable derivadas de sangre CD34+ las células y esto da lugar a MKs altamente puro, maduro, sin la necesidad de suplementos de suero o cocultivo con células de alimentador. Otras citocinas tales como SCF puede disminuir la diferenciación de UCB CD34+ de las células, mientras que el ligando de Flt-3 y IL-11 promoción la producción de megacariocitos inmaduros14. Este protocolo describe la producción de cultivos altamente puros de MK de sangre CD34+ las células en condiciones libres de suero.

<table><tbody><tr><td><reactivos > cultivo celular fuerte</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>recombinante TPO humano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-013</td><td></td></tr><tr><td>StemSpan SFEM II</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>9605</td><td>Medios sin suero para células CD34+</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</reactivos de</td></tr> <tr><td>aislamiento >strongCD34</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD34 MicroBead kit ultrapuro</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-453</td><td>Este kit incluye el reactivo bloqueante de IgG humana FcR y microperlas CD34. Estas perlas contienen el clon de anticuerpos anti-CD34 QBEND/10. Utilice un clon anti-CD34 diferente para comprobar la pureza (por ejemplo, el clon 8G12).</td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>Alere Technologies</td><td>1114545</td><td>Medio de separación de linfocitos (densidad 1,077 g/mL)</td></tr><tr><td>Tampón de separación estéril (SB)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td>Este tampón contiene solución salina tamponada con fosfato (PBS), pH 7,2 que contiene 0,5% de albúmina sérica bovina y 2 mM de EDTA. Se puede preparar utilizando componentes estériles de grado de cultivo celular. Desgasifique antes de usar porque las burbujas de aire pueden bloquear la columna.</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</strong</td><td>>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Citometría de flujo y reactivos de tinción celular</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PE Ratón anti-humano CD34</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>340669 Clon 8G12. Esto se puede utilizar para la verificación de pureza de CD34. Concentración final de anticuerpos: dilución 1:10.</td></tr><tr><td>Ratón PerCP anti-humano CD45 BD</td><td>Biosciences</td><td>347464</td><td>dilución 1:10</td></tr><tr><td>Control de isotipo PerCP</td><td>BD Biosciences</td><td>349044</td><td>dilución 1:10</td></tr><tr><td>FITC Ratón anti-humano CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>340929</td><td>Concentración final de anticuerpos dilución 1:5.</td></tr><tr><td>Ratón APC anti-humano CD42b</td><td>BD Biosciences</td><td>551061</td><td>Este anticuerpo también se puede utilizar para detectar MK maduras (el porcentaje de células positivas suele ser menor que con el anti CD42a). Concentración final de anticuerpos: dilución 1:10.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Ratón anti-humano CD42a</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA1227A647T</td><td>Actualmente distribuido por Bio-Rad. Concentración final de anticuerpos: dilución 1:10.</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Mouse Negative Control</td><td>AbD Serotec</td><td>MCA928A647</td><td>Actualmente distribuido por Bio-Rad. Anticuerpo de control de isotipo</td></tr><tr><td>Anti factor de Willebrand policlonal de conejo</td><td>Abcam</td><td>AB6994</td><td>dilución 1:200</td></tr><tr><td>ratón V450 anti-humna CD41a</td><td>BD Biosciences</td><td>58425</td><td>dilución 1:20</td></tr><tr><td>V450 control de isotipo</td><td>BD Biosciences</td><td>580373</td><td>dilución 1:20</td></tr><tr><td>anticuerpo PAC1-FITC</td><td>BD Biosciences</td><td>340507</td><td>dilución 1:10</td></tr><tr><td>Ratón anti CD62p monoclonal</td><td>Abcam</td><td>AB6632</td><td>dilución 1:200</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 cabra anti conejo IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td> dilución <td>1:100</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 cabra anti ratón IgG</td><td>Invitrogen</td><td>A11020</td><td>dilución 1:100</td></tr><tr><td>Ig Isotype Control cocktail-C</td><td>BD Biosciences</td><td>558659</td><td>Anticuerpo de control de isotipos</td></tr><tr><td>Yoduro de propidio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4864</td><td></td></tr><tr><td>CountBright Cuentas de conteo absolutas</td><td>Sondas moleculares, Invitrogen</td><td>C36950</td><td>Cuentas de conteo</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte</td></tr><tr><td><>fuerte>Materiales</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS</td> <td>columnasMiltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>También hay columnas más pequeñas y más grandes disponibles en el mercado</td></tr><tr><td>MidiMACS Imán separador</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5mL tubos de polipropileno FACS de fondo redondo, con tapón a presión,</td><td>tecnologías in vitro</td> estériles <td>352063</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de</td> <td>vidrioMenzel-Glaser</td><td>J3800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Medios de montaje con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td>Medio de montaje antidecoloración con DAPI</td></tr><<tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertido Microscopio</td><td></td>invertido <td>Leica</td><td>DMIRB</td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente</td><td>Zeiss</td><td>Vert.A1</td><td></td></tr><tr><td>Analizador de células</td><td>BD Biosciences</td><td>FACS Canto II</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Cytospin</td><td>ThermoScientific</td><td>Cytospin 4</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catálogo Número</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Software</td>Cell software BD <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biosciences</td><td>FACS Diva Software</td><td></td></tr><tr><td>Software de análisis de células individuales</td><td>Tree Star</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Software de microscopio fluorescente</td><td>Zeiss</td><td>Zen 2 edición azul</td><td></td></tr></tbody></table>

diferenciación de megacariocitos y plaquetas formación de humanos cd34 derivadas de sangre de la cuerda+ de las células

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Producción de plaquetas se produce principalmente en la médula ósea en un proceso denominado Trombopoyesis. En la Trombopoyesis, células progenitoras hematopoyéticas distinguen a precursores de plaquetas de forma llamados megacariocitos, que terminal para liberar las plaquetas de procesos citoplásmicos largo denominados proplatelets. Megacariocitos son las células raras que limitan a la médula ósea y por lo tanto son difíciles de cosechar en número suficiente para uso en laboratorio. Producción eficiente de megakaryocytes humanos puede ser alcanzado en vitro por cultivo CD34+ de las células bajo condiciones convenientes. El protocolo detallado aquí describe el aislamiento de CD34 de las células+ por célula magnética clasificación de muestras de sangre de cordón umbilical. Se describen los pasos necesarios para producir los megakaryocytes altamente puros y maduros en condiciones libres de suero. También se proporcionan detalles de análisis fenotípico de la diferenciación de megacariocitos y determinación de la producción proplatelet de formación y de la plaqueta. Determinantes que influyen en la diferenciación de megacariocitos o formación de proplatelet, tales como anticuerpos antiplaquetarios o miméticos de la trombopoyetina, se pueden agregar a las células cultivadas para examinar la función biológica.

Este protocolo permite la preparación de cultivos altamente puros de MK de cable derivadas de sangre CD34+ las células. El porcentaje de CD34+ las células de cordón de sangre es de aproximadamente 1,3%15 (figura 1A) y el número total de las gamas de células mononucleares (paso 1.8) de 90-300 x 106 por unidad UCB. La pureza de CD34 + / CD45 + células después de rangos aislamiento de 90 a 99% (<strong cla...

Una población altamente pura de megacariocitos puede obtenerse de cable derivadas de sangre CD34+ las células. Un método para CD34+ aislamiento y del megakaryocyte diferenciación se describe aquí.

Diferenciación de megacariocitos y plaquetas formación de humanos CD34 derivadas de sangre de la cuerda+ de las células

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...

El objetivo general de este procedimiento es utilizar muestras de sangre de cordón umbilical humano para aislar células puras CD34 positivas para estudiar los efectos de fármacos específicos de interés en la diferenciación de megacariocitos, la formación de proplaquetas y la producción de plaquetas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los megacariocitos y las plaquetas, como cuáles son los efectos de un tratamiento específico sobre la diferenciación de los megacariocitos y la producción y función de plaquetas. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona un método para el aislamiento consistente de células CD34 positivas viables de la sangre fresca del cordón umbilical.A través de este método puede proporcionar información sobre la megacariopoiesis, también se pueden estudiar otros tipos de células como linfocitos, eritrocitos y macrófagos. Comience agregando 10 mililitros de tampón de separación en un tubo cónico de 150 mililitros por cada 10 mililitros de sangre del cordón umbilical. Usando una aguja roma de calibre 18 montada en una jeringa de 10 mililitros, transfiera 10 mililitros de sangre a cada tubo, seguido de la adición de 15 mil

megakaryocyte-differentiation-platelet-formation-from-human-cord

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video muestra una técnica para la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas. Las células progenitoras madre hematopoyéticas, aisladas de la sangre del cordón umbilical humano, se diferencian en megacariocitos maduros en presencia de trombopoyetina. Los megacariocitos maduros producen extensiones citoplasmáticas denominadas proplaquetas, que dan lugar a plaquetas individuales.

Un método in vitro para la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas

Aquí, presentamos pluripotentes humanas protocolos de cultura de la célula de vástago (hPSC), solía diferenciarse hPSCs a CD34+ de progenitores hematopoyéticos. Este método utiliza la manipulación de la fase específica de canónica WNT de señalización especificar las células exclusivamente ya sea definitivo o primitiva hematopoyética programa.

Dirige la diferenciación de progenitores hematopoyéticos primitivo y definitivo de las células madre Pluripotent humanas

Aquí, presentamos un protocolo para la caracterización inmunophenotípica y la diferenciación inducida por citoquinas de la sangre de cordón umbilical derivada CD34+ células madre hematopoyéticas y células progenitoras a los cuatro linajes mieloides. Las aplicaciones de este protocolo incluyen investigaciones sobre el efecto de mutaciones de la enfermedad mieloide o moléculas pequeñas en la diferenciación mieloide de las células CD34+.

Diferenciación panmieloide de la sangre de cordón humano derivada CD34+ Células hematopoyéticas del tallo y progenitor

Este método describe la purificación por citometría de flujo de MEP y MKp de fémures, tibias y huesos pélvicos de ratones.

Aislamiento de progenitores de megacariocitos de ratón

Este protocolo describe en detalle todos los pasos implicados en la obtención de progenitores hematopoyéticos CD34+ derivados de leucofiltros y su diferenciación y maduración in vitro en megacariocitos portadores de proplatlet que son capaces de liberar plaquetas en el medio de cultivo. Este procedimiento es útil para el análisis en profundidad de los mecanismos celulares y moleculares que controlan la megacaripoyesis.

Los filtros de leucodepleción derivan de células CD34+ como fuente celular para estudiar la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas

Aquí, presentamos una estrategia de inmunofenotipificación para la caracterización de la diferenciación de megacariocitos, y mostrar cómo esa estrategia permite la clasificación de megacariocitos en diferentes etapas con un clasificador de células activado por fluorescencia. La metodología se puede aplicar a tejidos primarios humanos, pero también a megacariocitos generados en cultivo in vitro.

Inmunofenotipado Y Clasificación Celular De MKs Humanos De Fuentes Primarias Humanas O Diferenciados In Vitro De Progenitores Hematopoyéticos

El modelado de la eritropoyesis proporciona una valiosa oportunidad para comprender la importancia biológica de los actores en este proceso y para evaluar nuevos enfoques terapéuticos que puedan aliviar los defectos de diferenciación. Aquí, describimos un método simple y confiable para diferenciar de manera eficiente las células madre y progenitoras hematopoyéticas CD34+ ex vivo.

Un proyecto exhaustivo para evaluar la eficacia de la eritropoyesis humana in vitro y ex vivo

Se describe un método para la generación de regulación, la memoria y el ingenuo células T de un donante de sangre humana única. Polarizada Tregs puede ser entonces en comparación con otros subconjuntos en una variedad de aplicaciones genéticas y funcionales con homogeneidad genética, incluyendo un ensayo de supresión también detallan aquí.

La generación de células T reguladoras inducidas de células humanas primarias T vírgenes y de memoria

Las células T que expresan un receptor CD19 específico de antígeno quimérico (CAR) se infunden como tratamiento de investigación de células B malignas en nuestros primero en humanos ensayos de terapia génica. Se describe la modificación genética de las células T utilizando...

Aplicación clínica de<em&gt; La Bella Durmiente</em&gt; Artificial y células presentadoras de antígenos para modificar genéticamente las células T de la sangre del cordón umbilical y periférica

Aquí se presenta una técnica experimental de microscopía intravital de fluorescencia para visualizar heterotípicas plaquetas neutrófilos interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos. Esta tecnología microscópica será valiosa para estudiar el mecanismo molecular de la enfermedad vascular y para poner a prueba los agentes farmacológicos bajo condiciones fisiopatológicas.

Imágenes en tiempo real de heterotypic plaquetas neutrófilos Interacciones en el endotelio activado durante la inflamación vascular y la formación de trombos en ratones vivos

Aprenda a aislar células CD34+ de sangre de cordón umbilical humano para estudiar la diferenciación de megacariocitos y la formación de plaquetas. Este método permite investigar la megacariopoiesis con alta pureza celular.

Diferenciación de megacariocitos y plaquetas formación de humanos CD34 derivadas de sangre de la cuerda⁺ de las células

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