Name: Determinar tasas de decaimiento de transcripción del genoma en quietos y proliferación de fibroblastos humanos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-02T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprende a determinar tasas de decaimiento de transcripción en fibroblastos humanos proliferantes y quiescentes. Este método permite identificar genes con decaimiento diferencial y comprender la dinámica de expresión génica.

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HAC fue la Milton E. Cassel de la Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Este trabajo fue financiado por subvenciones para HAC (P.I. David Botstein), Instituto Nacional de Ciencias de Medicina General del centro de la beca de excelencia P50 GM071508 PhRMA Foundation grant 2007RSGl9572, ciencia nacional Fundación beca OCI-1047879 David agosto, Nacional Institute of General Medical Ciencias R01 GM081686, Instituto Nacional de ciencias médicas General R01 GM0866465, Eli &#38; Edythe Broad Center de medicina regenerativa &#38; investigación con células madre, centro de salud/UCLA CTSI NIH de la mujer Iris Cantor Grant UL1TR000124 y la sociedad de la leucemia linfoma. Investigación en esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional del cáncer de los institutos nacionales de salud bajo la concesión número P50CA092131. Los fundadores no tenían ningún papel en el diseño del estudio, recopilación de datos y análisis, publicación o preparación del manuscrito. HAC es un miembro del Eli &#38; Edythe amplia centro de medicina regenerativa &#38; investigación con células madre, el Instituto de Biología Molecular de la UCLA y el programa interdepartamental de Bioinformática de UCLA.

Todos los experimentos descritos fueron aprobados por comités de revisión institucional en la Universidad de Princeton y la Universidad de California, Los Ángeles.
1. preparar los fibroblastos proliferantes y contacto-inhibido para ActD tiempo curso
Nota: Este protocolo usa una timecourse con cuatro puntos de tiempo. Pueden recogerse tres muestras biológicamente independientes por punto por la recogida de las placas de cultivo de tejidos diferentes en un experimento, o el experimento puede repetirse varias veces con diferentes culturas de las células. En nuestra experiencia, un plato de cultivo de tejidos de 10 cm (diámetro) (una placa) proporciona suficiente RNA para el análisis. Si es necesario, pueden combinarse múltiples platos de cultivo de tejidos para que cada muestra incrementar el número de células en cada punto. Además, se puede realizar el mismo experimento con fibroblastos aislados de diferentes individuos como Replica biológica verdaderamente independiente.
<ol>
	<li>Establecer culturas quietas y proliferación de células para el análisis de descomposición de la transcripción. Para las células proliferantes, dividir las células cada tres días mientras que las células inhibición de contacto están llegando a ser inhibida por el contacto.
	<ol>
		<li>Para las células inhibición de contacto, cambiar el medio cada 2 días durante 7 días. Dividir las células proliferantes 2 días antes de los fibroblastos de la inhibición de contacto están listos para la colección. En la figura 1se muestra un ejemplo de un esquema de cultura de célula. Los pasos restantes de esta sección proporcionan un protocolo detallado para el establecimiento y división de las células.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Fibroblastos dérmicos primarios aislados de la piel neonatal según protocolos establecidos13. Fibroblastos de pasaje para una población homogénea. Nota: Fibroblastos pueden ser congelados y descongelados, si es necesario.</li>
	<li>Descongelar o replate fibroblastos, si es necesario. Crecer fibroblastos en DMEM con 10% de suero bajo condiciones estériles en una incubadora de cultivo de tejidos a 37 ° C y 5% CO2. Utilice los fibroblastos que han crecido de menos de 10 pasos. Fibroblastos deben ser &#60; 80% confluente en el día de la división de las células formando poblaciones proliferación y quietas.</li>
	<li>Para dividir una placa de cultivo de tejidos en múltiples placas, precalentamiento PBS, tripsina y medio con suero en un baño de agua de 37 ° C por 20 min.</li>
	<li>Aspirar o utilice una pipeta para extraer el medio de cada placa de cultivo de tejidos con células para ser replated.</li>
	<li>Pipeta PBS caliente en cada plato (10 mL de solución para una placa de 150 mm, 5 mL de solución para una placa de 100 mm, 2 mL para un pozo de una placa bien 6) y 1 mL para un pozo de una placa bien 12.</li>
	<li>Aspirado o pipeta para extraer PBS de cada placa de cultivo de tejidos.</li>
	<li>Suavemente la pipeta 1 x tripsina-EDTA en cada plato (8 mL de solución para una placa de 150 mm, 3 mL de solución para una placa de 100 mm, 2 mL para un pozo de una placa bien 6 y 1 mL para un pozo de una placa bien 12). Nota: Hacer 1 x tripsina-EDTA diluyendo estéril 10 x tripsina-EDTA en PBS estéril. La solución final 1 x debe ser 0,05% 0,02% y tripsina EDTA.</li>
	<li>Incubar tripsina con células durante 5 minutos.</li>
	<li>Golpear suavemente la placa para desalojar las células de la placa.</li>
	<li>Pipeta para resuspender las células en una suspensión unicelular.</li>
	<li>Transferencia de células en solución de tripsina a un tubo cónico que contiene el mismo volumen de DMEM con 10% de suero (8 mL de solución para una placa de 150 mm, 3 mL de solución para una placa de 100 mm, 2 mL para un pozo de una placa de la pozo 6 y 1 mL para un pozo de 12 bien la placa).</li>
	<li>Desactivación de las células a 4 ° C durante 5 minutos a 1.000 x g para eliminar tripsina.</li>
	<li>Resuspender las células en un volumen adecuado de medio y cuentan con un hemacitómetro para determinar la concentración de la célula.</li>
	<li>5 x 105 células por placa de cultivo de tejidos de 100 mm para la proliferación y células inhibidas por el contacto de la semilla.</li>
	<li>Usando este método, establecer las muestras proliferación e inhibida de contacto requeridas para el análisis (figura 1).</li>
</ol>
2. ActD tiempo curso
<ol>
	<li>Resuspender ActD a una concentración stock de 1 mg/mL (1 mg de ActD, uso 950 μl de PBS estéril y 50 μl de DMSO estéril). Nota: Soluciones congeladas del ActD deben ser estables durante un mes a-20 ° C. Soluciones diluidas deben ser descartadas y no almacenadas para su uso posterior.</li>
	<li>Añadir ActD al volumen adecuado de medio precalentado para cultura biológica celular replicar todas las placas que fueron fijados por el 0, 120, 240 y 480 min horarios (figura 2). Añadir ActD a una concentración de 15 μg por mL de medio. Mezcla bien aspirar apagado el medio viejo y añadir medio ActD-que contiene a las células.
	<ol>
		<li>Para un stock de 1 mg/mL, añadir 15 μl ActD por cada mL de medio, por ejemplo, para 10 mL de medio por placa de 100 mm, añadir 150 μL ActD.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Para recolectar la muestra de punto cero, aspirar suavemente el medio ActD y pipeta precalentada PBS en las células. Pipeta 10 mL de solución para una placa de 150 mm, 5 mL de solución para una placa de 100 mm, 2 mL para un pozo de una placa bien 6 y 1 mL para un pozo de una placa bien 12.</li>
	<li>Aspirar suavemente o pipeta de PBS. Nota: Todos los pasos que implica aislamiento de RNA deben realizarse con agua libre de ARNasa, libre de ARNasa tubos de microcentrífuga y pipetas libres de Rnasa. Guantes deben ser usados y cambiados con frecuencia cuando se trabaja con el ARN.</li>
	<li>Añadir solución de isotiocianato de guanidina fenol (1 mL/10 cm placa con 4 x 105 a 4 x 107 células) directamente a la placa de cultivo de tejidos. Nota: Solución de isotiocianato de guanidina fenol es una solución monofásica que mantiene la calidad del RNA durante la lisis de las células y separación de RNA, DNA y proteínas entre sí. PRECAUCIÓN: El fenol con isotiocianato de guanidina son corrosivos. Usar protección adecuada.</li>
	<li>Pipeta el fenol-guanidina isotiocianato solución celular la mezcla arriba y abajo varias veces para hacer una mezcla homogénea. Nota: La solución de isotiocianato de guanidina fenol lisado puede guardarse a 4 ° C durante la noche o a-20 ° C por hasta un año.</li>
	<li>Recoger cada momento transcurrido la cantidad apropiada de tiempo utilizando el método descrito en pasos 2.3-2.6.</li>
</ol>
3. aislamiento de ARN Total de isotiocianato de guanidina fenol solución lisado
<ol>
	<li>Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 5 minutos asegurar la completa disolución de complejos RNA-proteína. Nota: Los pasos del Protocolo de solución de isotiocianato de guanidina fenol pueden realizarse a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario.</li>
	<li>Introducir transcripciones de spike en el control que pueden ser detectadas con la metodología utilizada.</li></ol>Introducir estos controles en cada muestra en una cantidad conocida y concentración. Nota: El externo RNA control consortium (ERCC) spike en control mix14 ha sido específicamente diseñado como un punto de control para RNA-seq. También puede usarse para Norte Blot o qPCR en tiempo real. Spike en controles diseñados específicamente para tecnologías de microarrays están también disponible (véase Tabla de materiales).
	<li>Transferir la mezcla de solución de isotiocianato de guanidina de fenol a un tubo de microcentrífuga de 2.0 mL con una pipeta. Añadir 0,2 mL de cloroformo a la mezcla de solución de isotiocianato de guanidina fenol por cada 1 mL de solución de isotiocianato de guanidina fenol utilizada (por ejemplo, Añadir 0.3 mL cloroformo a 1,5 mL fenol-guanidina isotiocianato solución de una mezcla).</li>
	<li>Agitar el tubo de microcentrífuga vigorosamente durante 15 s y luego incubar la mezcla isotiocianato de guanidina-fenol-cloroformo a temperatura ambiente durante 3 minutos.</li>
	<li>Centrifugado de muestras a 12.000 x g durante 20 minutos a 4 ° C. Nota: Después de la vuelta inicial, la muestra debe separar en 3 capas - una capa orgánica roja en la parte inferior, una interfase de blanco/color de rosa en el centro y una capa clara acuosa en la parte superior (figura 3).</li>
	<li>Transferir la capa acuosa a un tubo nuevo de microcentrífuga 2.0 mL usando una micropipeta. Nota: Tenga cuidado de no alterar la interfase durante este proceso. Está bien dejar parte de la fracción acuosa. Es mejor dejar a parte de la fracción acuosa que para también incluir algunas de las capas de interfase, como la interfase capa contaminaría el ARN con el ADN. La capa acuosa será aproximadamente la mitad del volumen inicial, hasta cerca de 0,9 mL de la mezcla de solución/cloroformo isotiocianato de guanidina de fenol fue de 1,8 mL.</li>
	<li>Deseche la interfase y la fracción orgánica.</li>
	<li>Añadir un volumen igual de 2-propanol a la fracción acuosa e invertir el tubo 10 veces. Añadir hasta 1 μl de solución acuosa de 20 mg/mL de glucógeno por 20 μl de muestra, especialmente si la producción se espera que sea baja porque obtuvieron menos de 106 células. Nota: Esto resultará en un pellet denso, sólido que es fácil de controlar tras los pasos de la vuelta que seguirán.</li>
	<li>Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos.</li>
	<li>Centrifugado de muestras a 12.000 x g durante 20 minutos a 4 ° C. Asegurarse de que, al final de esta vuelta, el ARN se precipitó para formar una pelotilla blanca en la parte inferior del tubo.</li>
	<li>Con una pipeta, retire y descarte el sobrenadante teniendo especial cuidado de no perturbar el pellet de RNA blanco. Nota: Una punta de la pipeta sueltas sostenida en la mano se puede utilizar para quitar exceso etanol. Si el pellet de RNA está perturbado, pero no descarta, el investigador puede repetir la vuelta y quitar el sobrenadante nuevamente. Evitar desechar el precipitado como esto exigirá al investigador a repetir todo el procedimiento.</li>
	<li>Preparar una solución de 75% etanol y 25% agua libre de nucleasa. Añadir 1 mL de etanol al 75% por 1 mL de reactivo de solución de isotiocianato de guanidina fenol para lavar el pellet.</li>
	<li>Centrifugado de muestras a 12.000 x g durante 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Después de quitar la mayor parte del sobrenadante, utilice una pipeta para extraer tanto etanol como sea posible, mientras que todavía teniendo cuidado de no perturbar el sedimento. Nota: El pellet de RNA es menos compacto en este paso y tiende a moverse. Ser muy cuidadoso al manipular el diábolo en este punto para evitar perder el ARN.</li>
	<li>Hacer girar muestras 12.000 x g durante 2 min a temperatura ambiente para que sedimenten todas etanol exceso.</li>
	<li>Retire todo exceso etanol el tubo usando una micropipeta teniendo cuidado para no perturbar el sedimento.</li>
	<li>Deje que el RNA pellets aire seco durante 5 minutos.</li>
	<li>Añadir 50 μl de agua libre de nucleasa para el pellet de RNA y resuspender el precipitado en el agua libre de nucleasa.</li>
	<li>Tratar las muestras con 1 μl de DNasa (2 unidades/μL) para eliminar el ADN y luego inactivar DNasa y cationes (véase Tabla de materiales).</li>
	<li>Almacenar las muestras de RNA en tubos de microcentrífuga de 2,0 mL a-80 ° C.</li>

4. Análisis de la abundancia de transcripción
<ol>
	<li>Cuantificar RNA y RNA busque pureza utilizando un espectrofotómetro. Nota: La proporción de absorbancia a 260 nm y 280 nm debe ser aproximadamente de 2.0 para el ARN.</li>
	<li>Análisis RNA con un gel de agarosa al 1% o una tecnología equivalente a visualizar el grado de degradación. Nota: Dos claras bandas representando a 18S y 28S rRNA debe ser claramente visible (figura 4). Si estas bandas no son visibles, puede degradar el ARN. Consejos tiros problemas de degradación de RNA se encuentran en la discusión.</li>
	<li>Monitor la abundancia de transcripción en las alícuotas recogidas de ARN en comparación con el tacon de estándar interno utilizando microarrays15, RNA-Seq16, qPCR en tiempo real17, o Northern blots18.
	<ol>
		<li>Determinar la abundancia de cada transcripción en cada punto de tiempo en comparación con un tacon en el control de conocida abundancia. Nota: Para microarrays, los valores serán intensidades de fluorescencia. Para lacras norte, bandas en la película de rayos x se pueden cuantificar. Para qPCR en tiempo real, abundancia de transcripción puede determinarse por comparación con estándares conocidos con el 2- σσCT método19. Para RNA-Seq, valores normalizados pueden determinarse como FPKM o fragmentos por kilobase del exón por millones Lee asignados. Para las tasas de decaimiento de la isoforma específica, datos de RNA-Seq pueden analizarse utilizando metodologías isoform-consciente como DEXSeq20. Las tasas de decaimiento de la isoforma específica se determinan mejor con RNA-seq. Si han de determinarse con los datos de microarray, los datos deben ser analizados en una punta de prueba en lugar de una base de gen por gen. El analista debe tener cuidado al interpretar la información de un número limitado de sondeos. Por ejemplo, pueden ser 5 o menos las puntas de prueba que son de caracter informativos sobre una determinada isoforma. En este caso, el analista tendrá que determinar si el comportamiento de estas sondas es lo suficientemente consistente para que los resultados son confiables.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Realizar en tiempo real qPCR el RNA aislado17 en las muestras recolectadas para analizar genes rápidamente que se decae, como c-Myc y un gen lentamente que se decae como GAPDH, ganar la confianza eso decaimiento de transcripción las tasas fueron detectadas con precisión. Nota: Para más confirmación, sondas qPCR en tiempo real de la isoforma específica pueden ser desarrolladas y utilizadas para monitorear la abundancia de isoformas específicas por tiempo21.</li>
</ol>
5.Determinación del ritmo de decaimiento constante
<ol>
	<li>Para cada punto de tiempo, registro de transformación de los valores de abundancia de cada transcripción (gen-isoforma específica o). Nota: Transformación de registro de los valores convertirá curvas de decaimiento exponencial en líneas que se pueden caber con un decaimiento lineal modelo22.</li>
	<li>Encajan en el perfil de expresión de cada transcripción (gen-isoforma específica o) a un modelo de decaimiento lineal. La fórmula de este modelo es f (t) = C - r * t. En esta ecuación, C es una constante que representa la cantidad a partir de una transcripción, r es la tasa de disminución, y t es el tiempo desde el inicio del experimento. De esta ecuación, determinar la velocidad de descomposición como r*ln(10) (ver referencia11). Nota: El paquete de software maSigPro es un enfoque de regresión diseñado para detectar diferencias de Perfil de expresión genética significativa en tiempo curso datos23. Resultados para maSigPro y código de ejemplo están disponibles en: https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/vignettes/maSigPro/inst/doc/maSigProUsersGuide.pdf.</li>
	<li>Filtrar los genes que no ajustar un modelo log-lineal de la desintegración. Esto se puede lograr con una prueba F de ANOVA. Nota: la prueba F se basa en el estadístico F, que se define como la variación entre medias de la muestra dividida por la variación dentro de las muestras. Corregir los valores de p para las comparaciones múltiples mediante la aplicación de la lineal elevador Benjamini y Hochberg false discovery procedimiento24. Un valor de q mayor que 0.05 con el F-test puede utilizarse como un atajo para los genes que no ajustar un modelo log-lineal de la desintegración.</li>
	<li>Realizar una prueba F de ANOVA para determinar las transcripciones con un término de interacción significativa entre una condición categórica de ciclo celular y el tiempo (tasa de falso descubrimiento, FDR &#60; 0.05).</li>
</ol>

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</ol>

Los autores tienen intereses que compiten a revelar.

Quietud puede ser inducida por señales externas, incluyendo retiro de mitógenos o suero, falta de adhesión celular y la inhibición de contacto. Inhibición de contacto, uno de varios posibles métodos para inducir la quietud, es un proceso altamente evolutionarily conservado en el que las células de salida ciclo celular proliferativo en respuesta a contacto de célula a célula. Nos centramos aquí en inhibición de contacto como un ejemplo de un método para inducir la quietud. Estudios previos han reportado que contacto célul...

Niveles de estado estacionario de transcripciones reflejan la contribución de síntesis transcripción y decaimiento de la transcripción. Regulado y coordinado de la transcripción es un importante mecanismo de control de procesos biológicos1,2,3,4. Por ejemplo, tasas de decaimiento de transcripción han demostrado para contribuir a la serie temporal de acontecimientos después de la activación por el factor de necrosis tumoral citoquinas inflamatorias del5.
Previamente hemos demostrado que la transición entre la proliferación y quietud en fibroblastos humanos primarios se asocia con cambios en los niveles de transcripción de muchos genes6. Algunos de estos cambios reflejan las diferencias en la actividad de factores de transcripción entre estos dos Estados.
Cambios en la tasa de decaimiento de una transcripción también pueden contribuir a cambios en el nivel de expresión de una transcripción en dos diferentes Estados7,8. Basado en los resultados anteriores que la transición entre la proliferación y la inactividad se asocia con cambios en los niveles de varios microRNAs9, le preguntamos si también hay una contribución de la descomposición de la transcripción diferencial de los cambios expresión génica en proliferación contra fibroblastos quiescentes.
Para monitorear la estabilidad de la transcripción, se determinó la tasa de decaimiento de las transcripciones genoma en proliferación versus células quiescentes. Para lograr esto, supervisamos las tasas de decaimiento en proliferación contra fibroblastos quiescentes introduciendo un inhibidor de la transcripción nueva y monitoreo de la tasa en que desaparecieron expedientes individuales con el tiempo. La ventaja de este enfoque es que, en comparación con los métodos que simplemente controlar la expresión génica global, por inhibición de la síntesis nueva de transcripción, seremos capaces de determinar la tasa de decaimiento de estas transcripciones por separado de la tasa a la que son transcrito.
ActD tratamiento para inhibir transcripción nueva y para determinar las tasas de decaimiento de transcripción se ha aplicado con éxito en múltiples estudios anteriores. ActD se ha utilizado para disecar la importancia de la estabilidad del RNA en los cambios en la abundancia de transcripción que resultan del tratamiento con citoquinas proinflamatorias5. Un enfoque similar también se ha utilizado para disecar las diferencias en la tasa de decaimiento de transcripción en proliferación versus células C2C12 diferenciadas como adoptan un fenotipo muscular diferenciado del10. Otro ejemplo, global mRNA vida media también se han detectado en pluripotentes y11de las células madre embrionarias de ratón distinguido. En estos ejemplos, decaimiento del mRNA se ha demostrado para ser importante para la regulación de la abundancia de transcripción y para la transición de células a células diferentes Estados.
Aplicación de los métodos descritos a continuación, descubrimos cambios en las tasas de decaimiento de la transcripción en aproximadamente 500 genes cuando se comparan los fibroblastos en proliferación y quieto Estados12. En particular, hemos descubierto que los objetivos del microRNA miR-29, que es regulada en células quiescentes, se estabilizan cuando las células de transición a la inactividad. Aquí describimos la metodología que se utilizó para determinar las tasas de decaimiento en las células proliferantes y quietas. Esta metodología es útil para comparar las tasas de decaimiento mRNA mundiales en dos distintos pero similares condiciones cuando se busca información sobre genes el decaerse rápidamente. También podría utilizarse para abordar otras cuestiones como el efecto de las condiciones de cultivo celular en decaimiento de la transcripción, por ejemplo, en dos dimensiones versus tres culturas dimensionales. Las tasas de decaimiento pueden ser genoma determinado con métodos tales como microarrays o RNA-seq. alternativamente, qPCR en tiempo real o el borrar norteño puede utilizarse para determinar las tasas de decaimiento en una base de gen por gen o isoforma de la isoforma. Estas tasas pueden utilizarse para calcular la vida media de cada gen supervisada y para identificar genes con índices de caries que son diferentes en dos condiciones.

<table><tbody><tr><td>Centrífugas para tubos de microcentrífuga capaces de alcanzar 12.000 x g y 4&°; C</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipos para la circulación de geles de</td><td></td><td></td><td></td>agarosa</tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos estériles y tubos</td><td></td><td></td><td></td>cónicos</tr><tr><td>Eagle Modified Eagle Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11965-118</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>VWR</td><td>35-010-CV</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas serológicas estériles, pipetas y puntas de pipeta para el cultivo de tejidos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipetas, puntas de pipeta y tubos desechables sin ARNasa envueltos individualmente para el aislamiento y el análisis</td><td></td><td></td><td></td>de ARN</tr><tr><td>Guantes desechables para usar cuando se manipulan reactivos y muestras</td><td></td><td></td><td></td>de ARN</tr><tr><td>RNaseZap</td><td>Invitrogen</td><td>AM9780</td><td>Para descontaminar superficies de trabajo de RNasa Tubos</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>Eppendorf de 2,0 ml</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA&nbsp; Solución 10X</td><td>Millipore Sigma</td><td>9002-07-07</td><td></td></tr><tr><td>Estéril PBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>Actinomicina D</td><td>Millipore Sigma</td><td>A1410-2 mg</td><td>inhibe la transcripción</td></tr><tr><td>DMSO estéril</td><td>Fisher Scientific</td><td>31-761-00ML</td><td>disolvente para actinomicina D</td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ICN19400225</td><td>MP Biomedicals, Inc</td></tr><tr><td>producto Isopropanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2618500</td><td>grado de biología molecular</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>BP28184 grado de biología molecular</td></tr><tr><td>Glucógeno libre de ARNasa (solución acuosa de 20 mg/ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0551</td><td>portador para precipitación de ARN</td></tr><tr><td>Kit sin ADN TURBO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM1907</td><td>elimina el ADN con DNasa y, a continuación, en un paso posterior,&nbsp; inactiva el ADN y elimina los cationes divalentes</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ICN820721</td><td>MP Biomedicals, Inc</td></tr><tr><td>producto Colorante de carga para gel de ARN</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0641</td><td>adecuado incluso para la electroforesis desnaturalizante</td></tr><tr><td>Marcadores de ARN del</td> <td>milenioEscalera</td> de <td>ARN</td><td>Thermo Fisher Scientific AM7150</td></tr><tr><td>Kit de espiga de ARN de un solo color</td><td>Agilent Technology</td><td>5188-5282</td><td>Ejemplo de control de picos para el análisis de microarrays Agient</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1 grado de</td><td>biología molecular, para tampón TAE</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Fisher Scientific</td><td>A38-500</td><td>para tampón TAE</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500 grado de</td><td>electroforesis, para geles</td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7637</td><td>para biología molecular</td></tr><tr><td>Controles externos de ARN Consorcio Mezcla de ARN con picos Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>4456740 Control de picos para RNA Seq</td></tr><tr><td>TruSeq Biblioteca de ARNm trenzado TruSeq Kit de preparación A (48 muestras, 12 índices)</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2101</td><td>para RNA Seq</td></tr><tr><td>Placa de PCR de 0,3 ml de 96 pocillos</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0600</td><td>para qPCR en tiempo real</td></tr><tr><td>Sellos adhesivos Microseal B</td><td>Bio-Rad</td><td>MSB1001</td><td>para qPCR en tiempo real</td></tr><tr><td>Depósitos de reactivos sin RNASA/Dnasa</td><td>VWR</td><td>89094-662</td><td>para qPCR en tiempo real</td></tr><tr><td>Sin RNASA/Dnasa Ocho tiras de tubo y tapones Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM12230</td><td>para qPCR</td></tr> <tr><td>en tiempo realSuperScript Transcriptasa inversa</td><td>Invitrogen</td><td>18090010</td><td>para qPCR en tiempo real</td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>para qPCR en tiempo real</td></tr></tbody></table>

determinar tasas de decaimiento de transcripción del genoma en quietos y proliferación de fibroblastos humanos

Determining Genome-wide Transcript Decay Rates in Proliferating and Quiescent Human Fibroblasts

Quietud es un estado temporal, reversible en el que las células han dejado de división celular, pero conservan la capacidad de proliferar. Varios estudios, incluido el nuestro, han demostrado que la quietud se asocia con cambios generalizados en la expresión génica. Algunos de estos cambios se producen a través de cambios en el nivel o la actividad asociada a la proliferación de factores de transcripción, como E2F y MYC. Hemos demostrado que el decaimiento del mRNA también puede contribuir a cambios en la expresión génica entre células proliferantes y quietas. En este protocolo, se describe el procedimiento para el establecimiento de culturas quietas y proliferación de fibroblastos humanos de prepucio cutáneo. A continuación describimos los procedimientos para inhibir la nueva transcripción en las células proliferantes y quietas con actinomicina D (ActD). ActD tratamiento representa un enfoque sencillo y reproducible a disociar la nueva transcripción de la descomposición de la transcripción. Una desventaja del ActD tratamiento es que el curso del tiempo debe ser limitado a un corto plazo porque ActD afecta la viabilidad celular. Niveles de transcripción son monitoreados en el tiempo para determinar las tasas de decaimiento de transcripción. Este procedimiento permite la identificación de genes y de isoformas que exhiben decaimiento diferencial en proliferación contra fibroblastos quiescentes.

Hemos divulgado previamente los resultados de análisis de microarray de las tasas de decaimiento de transcripción en fibroblastos humanos primarios proliferación e inhibida por el contacto durante un tiempo de 8 horas curso12. Se proporciona una lista de genes con un cambio significativo en la estabilidad de la transcripción comparación de fibroblastos proliferantes y contacto-inhibida en la tabla adicional 1. Se proporcionan las intensidades de fl...

Se describe un protocolo para generar la proliferación y fibroblastos dérmicos humanos primarios quietos, seguimiento las tasas de decaimiento de transcripción y la identificación de genes diferencialmente decadentes.

Determinar tasas de decaimiento de transcripción del genoma en quietos y proliferación de fibroblastos humanos

Quiescence is a temporary, reversible state in which cells have ceased cell division, but retain the capacity to proliferate. Multiple studies, including ...

El objetivo general de este procedimiento es monitorear las tasas de descomposición de la transcripción en fibroblastos proliferantes e inactivos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología molecular, como si los cambios en la expresión génica son el resultado de cambios en la tasa de desintegración de la transcripción. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona información sobre la tasa de decaimiento de la transcripción, no solo sobre la abundancia de la transcripción.Para iniciar el protocolo, establecer cultivos proliferantes y quiescentes de fibroblastos. Los fibroblastos en proliferación deben tripsinizarse regularmente. Los cultivos quiescentes se pueden establecer permitiendo que las placas alcancen la confluencia con cambios regulares de medio.Agregue ActD 150 microlitros al medio precalentado 10 mililitros para todas las placas de cultivo celular biológicas replicadas. Agregue ActD a una concentración de 15 microgramos por mililitro de medio. Mezclar bien la solución.Aspire el medio viejo y agregue medio que contenga ActD a las células. Para recolectar la muestra de punto de tiempo cero, aspire suavemente el medio ActD y pipetee entre cinco y 10 mililitros de PBS precalentado en una placa de 100 milímetros, cinco mililitros de solución para una placa de 100 milímetros, dos mililitros para un pocillo de una placa de seis pocillos y un mililitro para un pocillo de una placa de 12 pocillos. Aspire suavemente el PBS.A continuación, añada la solución de isotiocianato de fenol-guanidina directamente a la placa de cultivo de tejidos. Pipetee la mezcla celular de la solución de isotiocianato de fenol y guanidina hacia arriba y hacia abajo varias veces para hacer una mezcla homogénea. Recopile cada punto de tiempo después de que haya pasado la cantidad de tiempo adecuada, utilizando el método descrito anteriormente.Incubar las muestras a temperatura ambiente durante cinco minutos para asegurar la disolución completa de los complejos de proteínas de ARN. A continuación, presente las transcripciones controladas con picos que se pueden detectar con la metodología utilizada. Introduzca estos controles en cada muestra en una cantidad y concentración conocidas.Con una pipeta, transfiera la mezcla de solución de isotiocianato de fenilguanidina a un tubo de microcentrífuga de 2,0 mililitros. A continuación, añada 0,2 mililitros de cloroformo a la mezcla de solución de isotiocianato de fenilguanidina por cada mililitro de solución de isotiocianato de fenilguanidina utilizada. Agite vigorosamente el tubo de la microcentrífuga durante 15 segundos y luego incube el isotiocianato de fenilguanidina con cloroformo.Después de la incubación, centrifugar las muestras a 12.000 veces g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. La muestra debe separarse en tres capas. Transfiera la capa acuosa a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2,0 mililitros con una micropipeta y tenga cuidado de no alterar la interfase durante este proceso.Deseche la interfase y las fracciones orgánicas. A continuación, añada un volumen igual de 2-Propanol a la fracción acuosa e invierta el tubo 10 veces. Agregue hasta un microlitro de 20 miligramos por mililitro de glucógeno acuoso por cada 20 microlitros de muestra, especialmente si se espera que el rendimiento sea bajo.Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la incubación, centrifugar las muestras. Asegúrese de que al final del centrifugado, el ARN se haya precipitado para formar una bolita en el fondo del tubo.Con una pipeta, retire y deseche el sobrenadante, teniendo especial cuidado de no alterar la bolita de ARN blanco. Agregue un mililitro de etanol al 75% por un mililitro de reactivo de solución de isotiocianato de fenilguanidina para lavar el pellet. Centrifugar las muestras a 12.000 veces g durante 10 minutos.Después de eliminar la mayor parte del sobrenadante, use una pipeta para eliminar la mayor cantidad de etanol posible, pero no moleste la pellet. Gira las muestras para granular todo el exceso de etanol. La bolita de ARN es menos compacta en este paso y tiende a moverse.Después del centrifugado, retire todo el exceso de etanol del tubo sin alterar el pellet. Deje que el gránulo de ARN se seque al aire durante cinco minutos. Agregue 50 microlitros de agua sin nucleasas al pellet de ARN y vuelva a suspender el pellet en agua sin nucleasas.Tratar las muestras de un microlitro de Deanase para eliminar el ADN y luego inactivar la Deanase y los cationes. Almacene las muestras de ARN en tubos de microcentrífuga de 2,0 mililitros a menos 80 grados Celsius. Cuantifique el ARN y verifique la pureza del ARN con un espectrofotómetro.Después de verificar la pureza, analice el ARN con un gel de agarosa al 1% para visualizar el grado de degradación. Dos bandas transparentes que representan el ARNr 18S y 28S deben ser claramente visibles. Si estas bandas no son visibles, el ARN puede degradarse.A continuación, supervise la abundancia de transcripciones en las alícuotas de recolección de ARN en comparación con el estándar interno con picos mediante qPCR en tiempo real. También se pueden utilizar microarrays, secuenciación de ARN o Northern blots. Las intensidades de fluorescencia a lo largo del tiempo corresponden a la expresión génica.Mientras que los fibroblastos se inhiben por contacto, el colágeno 3A1 que codifica la transcripción, un gen muy importante para la creación de la matriz extracelular depositada durante la cicatrización de heridas, se vuelve más estable y no se desintegra tan rápidamente. No olvides que trabajar con fenol puede ser extremadamente peligroso y es importante no dejar que toque tu piel. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo monitorear las tasas de descomposición de la transcripción en fibroblastos proliferantes y quiescentes.Los cambios en la tasa de desintegración de la transcripción pueden ser un mecanismo importante de la triangulación de genes.

determining-genome-wide-transcript-decay-rates-proliferating

Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

Se describen los métodos de photobleaching incluyendo recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP) y la pérdida de fluorescencia en photobleaching (FLIP) para controlar la dinámica de la cromatina de proteínas en células madre embrionarias (ES) las células. Dinámica de la cromatina proteína, que es considerado como uno de los medios para estudiar la plasticidad de la cromatina, es mayor en las células pluripotentes.

Photobleaching ensayos (FRAP y FLIP) para medir la dinámica de la cromatina de proteínas en células vivas madre embrionarias

ARN polimerasa II cinética de transcripción se miden en genes específicos en células vivas. ARNm transcrito a partir del gen de interés están marcados con fluorescencia y el uso de recuperación de fluorescencia después de photobleaching (FRAP), la vivo en la cinética de la elongación de la transcripción se obtienen.

La medición de la cinética de la transcripción de ARNm en las células vivas solo

El ARN celular total proporciona una plantilla pobres para el estudio de los cambios a corto plazo en la síntesis de ARN y la descomposición, así como la cinética de procesamiento del ARN. A continuación, describimos marcaje metabólico de ARN recién transcrito con 4-tiouridina seguido por biotinilación específico de tiol y la purificación de ARN recién transcrito que permiten superar estas limitaciones.

Marcaje metabólico del ARN recién transcrito para alta resolución Gene perfiles de expresión de la síntesis de RNA, producción y descomposición en cultivo celular

El nivel de estado estacionario de ARNm específicos se determina por la velocidad de síntesis y la descomposición del ARNm. Las tasas de degradación de ARNm de todo el genoma o las tasas de descomposición de ARNm específicos se pueden medir mediante la determinación de ARNm de vida media. Este protocolo se centra en la medición de las tasas de descomposición de ARNm en Saccharomyces cerevisiae.

La medición de mRNA decadencia Tarifas en<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt; Uso<em&gt; Rpb1-1</em&gt; Cepas

Este protocolo describe un método para determinar proteína vida media en las células adherentes vivas sola, con pulso de etiquetado e imagen Time-lapse de fluorescencia complemento etiqueta de proteínas de fusión.

Sola célula cuantificación de las tasas de degradación de proteína por microscopia de fluorescencia Time-lapse en cultivo de células adherentes

Desarrollo neurológico procesos como proliferación, migración y consecuencia del neurite son a menudo perturbados en enfermedades neuropsiquiátricas. Así, presentamos protocolos evaluar rápida y reproducible estos procesos del neurodesarrollo en NPCs humanos derivado de iPSC. Estos protocolos permiten la evaluación de los efectos relevantes factores de crecimiento y terapias en desarrollo de NPC.

Rápida detección de los fenotipos del neurodesarrollo en las células precursoras neuronales humanos (PNJ)

Este protocolo describe el uso combinatorio de ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq y perfiles para las líneas celulares y células primarias del ribosoma. Permite el seguimiento de cambios en el factor de transcripción vinculante, novo de transcripción, procesamiento de RNA, rotación y traducción con el tiempo y viendo el curso general de los acontecimientos en las células activadas o cambiantes.

Análisis en tiempo real del Factor de transcripción vinculante, transcripción, traducción y rotación para mostrar los eventos globales durante la activación celular

Aquí, presentamos una herramienta que se puede utilizar para estudiar la modulación posttranscripcional de una transcripción en células epiteliales alveolares primarias mediante el uso de un sistema de expresión inducible acoplado a una técnica de electroporación de pipeta.

Sistema eficiente de expresión de plásmido controlado por transcripción para la investigación de la estabilidad de las transcripciones de ARNm en células epiteliales alveolares primarias

Este protocolo describe el flujo de trabajo para el etiquetado metabólico de células senescentes y no en división con SILAC pulsado, análisis de espectrometría de masas no dirigido y un cálculo simplificado de las vidas medias de las proteínas.

Medición de las tasas de recambio de proteínas en células cultivadas senescentes y no divisorias con etiquetado metabólico y espectrometría de masas

Este protocolo mide cuantitativamente la estabilidad y la vida media de ARN potenciadores intergénicos e intragénicos en células madre embrionarias de ratón mediante tratamiento con Actinomicina D, RT-qPCR y análisis de regresión no lineal. Se incorporan estrategias de normalización específicas por posición para modelar con precisión la dinámica de desintegración del ARNe de manera dependiente del contexto.

Evaluación cuantitativa optimizada de la estabilidad del ARN potenciador en células madre embrionarias de ratón

Este artículo presenta un protocolo LysoTracker de células vivas para medir la remodelación lisosomal durante la senescencia en fibroblastos humanos IMR-90.

Perfilado lisosomal con LysoTracker para la evaluación cuantitativa de la senescencia celular en fibroblastos humanos

Aprende a determinar tasas de decaimiento de transcripción en fibroblastos humanos proliferantes y quiescentes. Este método permite identificar genes con decaimiento diferencial y comprender la dinámica de expresión génica.

Determinar tasas de decaimiento de transcripción del genoma en quietos y proliferación de fibroblastos humanos

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