Determinar tasas de decaimiento de transcripción del genoma en quietos y proliferación de fibroblastos humanos
2 de enero de 2018
Se describe un protocolo para generar la proliferación y fibroblastos dérmicos humanos primarios quietos, seguimiento las tasas de decaimiento de transcripción y la identificación de genes diferencialmente decadentes.
El objetivo general de este procedimiento es monitorear las tasas de descomposición de la transcripción en fibroblastos proliferantes e inactivos. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología molecular, como si los cambios en la expresión génica son el resultado de cambios en la tasa de desintegración de la transcripción. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona información sobre la tasa de decaimiento de la transcripción, no solo sobre la abundancia de la transcripción.
Para iniciar el protocolo, establecer cultivos proliferantes y quiescentes de fibroblastos. Los fibroblastos en proliferación deben tripsinizarse regularmente. Los cultivos quiescentes se pueden establecer permitiendo que las placas alcancen la confluencia con cambios regulares de medio.
Agregue ActD 150 microlitros al medio precalentado 10 mililitros para todas las placas de cultivo celular biológicas replicadas. Agregue ActD a una concentración de 15 microgramos por mililitro de medio. Mezclar bien la solución.
Aspire el medio viejo y agregue medio que contenga ActD a las células. Para recolectar la muestra de punto de tiempo cero, aspire suavemente el medio ActD y pipetee entre cinco y 10 mililitros de PBS precalentado en una placa de 100 milímetros, cinco mililitros de solución para una placa de 100 milímetros, dos mililitros para un pocillo de una placa de seis pocillos y un mililitro para un pocillo de una placa de 12 pocillos. Aspire suavemente el PBS.
A continuación, añada la solución de isotiocianato de fenol-guanidina directamente a la placa de cultivo de tejidos. Pipetee la mezcla celular de la solución de isotiocianato de fenol y guanidina hacia arriba y hacia abajo varias veces para hacer una mezcla homogénea. Recopile cada punto de tiempo después de que haya pasado la cantidad de tiempo adecuada, utilizando el método descrito anteriormente.
Incubar las muestras a temperatura ambiente durante cinco minutos para asegurar la disolución completa de los complejos de proteínas de ARN. A continuación, presente las transcripciones controladas con picos que se pueden detectar con la metodología utilizada. Introduzca estos controles en cada muestra en una cantidad y concentración conocidas.
Con una pipeta, transfiera la mezcla de solución de isotiocianato de fenilguanidina a un tubo de microcentrífuga de 2,0 mililitros. A continuación, añada 0,2 mililitros de cloroformo a la mezcla de solución de isotiocianato de fenilguanidina por cada mililitro de solución de isotiocianato de fenilguanidina utilizada. Agite vigorosamente el tubo de la microcentrífuga durante 15 segundos y luego incube el isotiocianato de fenilguanidina con cloroformo.
Después de la incubación, centrifugar las muestras a 12.000 veces g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. La muestra debe separarse en tres capas. Transfiera la capa acuosa a un nuevo tubo de microcentrífuga de 2,0 mililitros con una micropipeta y tenga cuidado de no alterar la interfase durante este proceso.
Deseche la interfase y las fracciones orgánicas. A continuación, añada un volumen igual de 2-Propanol a la fracción acuosa e invierta el tubo 10 veces. Agregue hasta un microlitro de 20 miligramos por mililitro de glucógeno acuoso por cada 20 microlitros de muestra, especialmente si se espera que el rendimiento sea bajo.
Incubar las muestras a temperatura ambiente durante 10 minutos. Después de la incubación, centrifugar las muestras. Asegúrese de que al final del centrifugado, el ARN se haya precipitado para formar una bolita en el fondo del tubo.
Con una pipeta, retire y deseche el sobrenadante, teniendo especial cuidado de no alterar la bolita de ARN blanco. Agregue un mililitro de etanol al 75% por un mililitro de reactivo de solución de isotiocianato de fenilguanidina para lavar el pellet. Centrifugar las muestras a 12.000 veces g durante 10 minutos.
Después de eliminar la mayor parte del sobrenadante, use una pipeta para eliminar la mayor cantidad de etanol posible, pero no moleste la pellet. Gira las muestras para granular todo el exceso de etanol. La bolita de ARN es menos compacta en este paso y tiende a moverse.
Después del centrifugado, retire todo el exceso de etanol del tubo sin alterar el pellet. Deje que el gránulo de ARN se seque al aire durante cinco minutos. Agregue 50 microlitros de agua sin nucleasas al pellet de ARN y vuelva a suspender el pellet en agua sin nucleasas.
Tratar las muestras de un microlitro de Deanase para eliminar el ADN y luego inactivar la Deanase y los cationes. Almacene las muestras de ARN en tubos de microcentrífuga de 2,0 mililitros a menos 80 grados Celsius. Cuantifique el ARN y verifique la pureza del ARN con un espectrofotómetro.
Después de verificar la pureza, analice el ARN con un gel de agarosa al 1% para visualizar el grado de degradación. Dos bandas transparentes que representan el ARNr 18S y 28S deben ser claramente visibles. Si estas bandas no son visibles, el ARN puede degradarse.
A continuación, supervise la abundancia de transcripciones en las alícuotas de recolección de ARN en comparación con el estándar interno con picos mediante qPCR en tiempo real. También se pueden utilizar microarrays, secuenciación de ARN o Northern blots. Las intensidades de fluorescencia a lo largo del tiempo corresponden a la expresión génica.
Mientras que los fibroblastos se inhiben por contacto, el colágeno 3A1 que codifica la transcripción, un gen muy importante para la creación de la matriz extracelular depositada durante la cicatrización de heridas, se vuelve más estable y no se desintegra tan rápidamente. No olvides que trabajar con fenol puede ser extremadamente peligroso y es importante no dejar que toque tu piel. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo monitorear las tasas de descomposición de la transcripción en fibroblastos proliferantes y quiescentes.
Los cambios en la tasa de desintegración de la transcripción pueden ser un mecanismo importante de la triangulación de genes.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Visión general
Este artículo describe un protocolo para generar fibroblastos dérmicos humanos primarios tanto proliferantes como inactivos. Se centra en monitorear las tasas de decaimiento de transcritos e identificar genes que decaen de manera diferencial, proporcionando información sobre la dinámica de la expresión génica.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Biología Molecular
- Biología Celular
- Expresión Génica
Antecedentes
- Entender las tasas de decaimiento de transcritos es crucial para dilucidar la regulación de la expresión génica.
- Los fibroblastos sirven como modelo para estudiar procesos celulares en tejidos humanos.
- Los estados proliferantes e inactivos de los fibroblastos pueden influir en los resultados de la expresión génica.
- Este protocolo tiene como objetivo diferenciar los efectos del decaimiento de transcritos de la mera abundancia de transcritos.
Propósito del estudio
- Monitorear las tasas de decaimiento de transcritos en diferentes estados de cultivos de fibroblastos.
- Investigar cómo los cambios en la expresión génica se relacionan con las tasas de decaimiento de transcritos.
- Proporcionar un método confiable para estudiar la dinámica de la expresión génica en fibroblastos.
Métodos utilizados
- Establecimiento de cultivos de fibroblastos proliferantes e inactivos.
- Tripsinización regular de fibroblastos proliferantes.
- Establecimiento de cultivos inactivos basados en confluencia con cambios de medio.
- Monitoreo de las tasas de decaimiento de transcritos a través de protocolos experimentales.
Principales resultados
- Identificación de genes que decaen de manera diferencial entre estados proliferantes e inactivos.
- Información sobre la relación entre el decaimiento de transcritos y los cambios en la expresión génica.
- Demostración de las ventajas de medir las tasas de decaimiento de transcritos.
- Provisión de un protocolo detallado para estudios futuros en biología molecular.
Conclusiones
- El protocolo distingue eficazmente entre la abundancia de transcritos y las tasas de decaimiento.
- Los hallazgos contribuyen a una comprensión más profunda de la regulación de la expresión génica.
- Este método puede aplicarse a varios estudios en biología molecular y celular.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Genome-wide measurement of transcript decay rates in proliferating and quiescent human fibroblasts enables biopharma teams to distinguish regulatory mechanisms driving gene expression changes beyond transcriptional control. This approach supports mechanistic de-risking and enhances predictive confidence in target validation by clarifying whether observed gene expression differences are due to altered mRNA stability or transcriptional activity. Integrating transcript decay profiling at early discovery inflection points informs portfolio triage and prioritization of disease-relevant targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of gene expression regulation by separating transcriptional and post-transcriptional effects.
- Supports functional target validation by identifying genes with altered mRNA stability in disease-relevant states.
- Facilitates mechanistic de-risking by clarifying the contribution of transcript decay to phenotype.
- Improves predictive confidence for advancing targets with robust regulatory profiles.
Screening & Assay Development
- Establishes validated biological systems for downstream transcriptomic and functional assays.
- Provides quantitative decay rate measurements for assay standardization and reproducibility.
- Enables screening of compounds or genetic perturbations affecting mRNA stability.
- Supports platform reuse for comparative studies across cell states or conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns transcript decay signatures with disease-relevant cellular states for translational biomarker discovery.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by tracking regulatory mechanisms.
- De-risks advancement decisions by confirming mechanistic relevance of candidate targets.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and preclinical validation, providing a reusable capability for transcriptomic analysis.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating transcript decay as a regulatory variable.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative decay rate outputs for assay development.
- Analytics: Enables statistical comparison of decay rates between proliferating and quiescent states.
- Translational Research: Connects decay rate changes to disease-relevant cellular phenotypes.
- Enterprise Reuse: Offers a standardized workflow adaptable to diverse cell models and conditions.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene regulation studies.
- Operational Value: Provides standardized, reproducible, and scalable transcript decay measurements.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and enhances capital efficiency by clarifying regulatory mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with validated regulatory profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, RNA extraction, and quantitative transcript analysis.
- Needs access to instrumentation for qPCR, microarray, or RNA sequencing.
- Demands rigorous cross-team standardization of sample handling and time-point collection.
- Adaptable to various cell types but may require optimization for different biological systems.
- Limited by Actinomycin D toxicity, restricting the time course for decay measurement.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
0:38
ActD Time Course
2:13
Isolation of Total RNA from Phenol-guanidine Isothiocyanate Solution Lysate
5:16
Analysis of Transcript Abundance
6:02
Results: Clear Contrast in Transcript Decay Between Proliferating and Quiescent Fibroblasts
6:28
Conclusion
