Name: Múltiplex del Cytokine Perfil de esplenocitos de ratón estimulados utilizando una plataforma basada en grano de cytometric del inmunoensayo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprende a cuantificar múltiples citocinas simultáneamente en sobrenadantes de esplenocitos de ratón estimulados mediante un inmunoensayo multiplex basado en perlas y citometría de flujo.

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Los autores quisieran agradecer las contribuciones de los inmuno-ensayos y equipo de desarrollo de producto para el desarrollo del ensayo. Además, nos gustaría agradecer a Vigene Tech, Inc. por su colaboración en el diseño de los paquetes de software de análisis de datos.

todos los experimentos con animales se realizaron según las recomendaciones de NIH contenidas dentro de la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio y fue aprobados por el IACUC en BioLegend.
 <img alt="Diagrama de flujo de trabajo del ensayo de cultivo celular; pasos de unión de anticuerpos, ciclos de lavado y configuración de citometría de flujo." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> figura 1: Resumen de procedimiento de ensayo de placa de filtro. El protocolo para realizar el análisis utilizando placas de filtro se representa como un diagrama que representa los componentes del ensayo clave y pasos de incubación. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig1large.jpg" target="_blank"> haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
 1. preparación de muestras biológicas Nota: el sitio anatómico elegido y el volumen de la colección de la sangre queda a criterio de cada investigador individual y no afectará el resultado del análisis. Sin embargo, una vez que se obtienen, las muestras deben ser manipuladas según los pasos descritos a continuación.
<ol><li>Preparación de las muestras de suero <ol><li>recoger el volumen de sangre en tubo de la colección preferida y dejar que coagule durante al menos 30 min.</li>
		<li>Centrifugar la muestra durante 10 min a 1.000 x g a temperatura ambiente.</li>
		<li>Quitar el suero y análisis inmediato o alícuota en tubos de microcentrífuga de polipropileno y almacenar las muestras en ≤ -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Preparación de las muestras de Plasma <ol><li>recoger el volumen de la sangre con ácido etilendiaminotetracético (EDTA) revestido de tubos de sangre.</li>
		<li>Centrifugar por 10 min a 1.000 x g a temperatura ambiente dentro de 30 minutos de colección de.</li>
		<li>Eliminar plasma y ensayo inmediatamente o alícuota en tubos de microcentrífuga de polipropileno y almacenar las muestras en ≤ -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Preparación de muestras sobrenadante de cultivo de tejidos <ol><li>Centrifugue la muestra durante 10 min a 1.500 x g a 4 ° C para eliminar las células y desechos.</li>
		<li>Recoger sobrenadante y análisis inmediato o alícuota en tubos de microcentrífuga de polipropileno y almacenar en el ≤ -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Deshielo de congelar muestras biológicas <ol><li>descongelar completamente cualquier muestras biológicas previamente congeladas en hielo y agitar brevemente antes de su uso. Evitar congelaciones y descongelaciones más de 2. 
		Nota: Las muestras utilizadas en este protocolo se obtuvieron mediante cultivo de esplenocitos de ratón BALB/c (1 x 10 6 células a 37 ° C + 5% CO 2 en diversas condiciones: sin estimular, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 μg/mL revestido de placa) + αCD28 (1 μg/mL solubilidad), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). Sobrenadantes de cultivo fueron recogidos después de 48 h y procesado como se describe en la sección 1.3.</li>
	</ol></li></ol> 2. Preparación del reactivo <ol><li>Preparation of Pre-mixed Antibody-Immobilized perlas <ol><li>someter a ultrasonido premezclados granos botella por 1 min en un baño sonicador a temperatura ambiente y luego vortex 30 antes de s a utilizar. Si no se dispone de ningún baño sonicador, aumentar el tiempo de vórtice a 1 min</li>
	</ol></li> <li>Preparación del tampón de lavado <ol><li>traer 20 x Wash Buffer (x 20 PBS con 1% Tween-20) suministrado con el kit a temperatura ambiente y agitar para poner todas las sales en solución.</li>
		<li>Diluir 25 mL de 20 x Wash Buffer con 475 mL de agua desionizada. Porción no utilizada de almacén entre 2 ° C y 8 ° C hasta por un mes.</li>
	</ol></li> <li>Preparación de la matriz B (para el uso con muestras de Plasma y suero) <ol><li>añadir 5,0 mL de la solución de ensayo (PBS con 1% BSA) el juego de la botella que contiene el liofilizado matriz B. permitir por lo menos 15 min para reconst completa itution, entonces vortex para mezclar bien. B restos de matriz reconstituido puede almacenarse en ≤-70 ° C hasta por un mes.</li>
	</ol></li></ol> 3. Preparación estándar Nota: cada analito en este panel tiene una superior concentración estándar de 10.000 pg/mL.
<ol><li>Añadir 250 μl de tampón de ensayo para reconstituir el liofilizado ratón de Cytokine estándar cóctel. Mezclar por Vortex brevemente y dejar el frasco permanezca a temperatura ambiente durante 10 minutos</li>
	<li>Transferir el cóctel estándar a un tubo de microcentrífuga de polipropileno etiquetado " C7 ". Esto se utilizará como estándar arriba.</li>
	<li>Etiqueta de 6 tubos de microcentrífuga de polipropileno como C6, C5, C4, C3, C2 y C1.</li>
	<li>Añadir 75 μl de tampón de ensayo para cada uno de estos tubos.</li>
	<li>De transferencia 25 μl del C7 estándar superior al tubo de C6 y mezcla bien con un vórtex. Este será el estándar C6.</li>
	<li>Continuar realizando serie punta de 1:4 diluciones utilizando una nueva pipeta para que cada tubo añadir 25 μl del estándar anterior a la 75 μl de tampón de ensayo en el tubo estándar más bajo siguiente seguido de Vortex para obtener normas C5, C4, C3 , C2 y C1. Usar el tampón de ensayo como el estándar de 0 pg/mL (C0).</li>
</ol> 4. Dilución de la muestra Nota: experiencias piloto preliminares con este ensayo de diluciones múltiples pueden ser necesarias para determinar el factor de dilución más apropiado para un conjunto particular de muestras biológicas. Un factor de dilución adecuado produce cálculos de concentración de la muestra que se encuentran dentro de los límites de la curva estándar. Los pasos siguientes se significan como directrices y tenga que determinarse empíricamente según tipo de muestra.
<ol><li>Diluir suero o plasma de 2 muestras con tampón de ensayo (e.g. diluir 50 μl de muestra con 50 μl de tampón de ensayo) en tubos de microcentrífuga de polipropileno. 
	Nota: Si necesita más dilución de la muestra, diluciones deben hacerse con matriz B en vez de tampón de ensayo para asegurar una medición precisa. Agregar las muestras de suero o plasma sin dilución resultarán en la precisión de análisis bajo y pueden obstruir la placa del filtro. Matriz B se compone de suero de ratón combinados agotado de objetivos análisis endógeno. Se utiliza como una muestra de suero o plasma diluyente para evitar efectos de matriz, que se saben que la sensibilidad analítica del efecto de inmunoensayos.</li>
	<li>Prueba de muestras sobrenadante de cultivo sin dilución de la célula. 
	Nota: Los niveles del analito pueden variar mucho de muestra a muestra. Si es necesario, diluir las muestras sobrenadante usando una preparación fresca de su correspondiente medio de cultivo celular o tampón de ensayo.</li>
</ol> 5. Procedimiento de ensayo Nota: el ensayo puede realizarse en placas de filtro de polipropileno, tubos de micro FACS o microplacas de fondo V. El procedimiento de ensayo de placa de filtro se recomienda debido a muestras de buena consistencia, ensayo de robustez y facilidad de manejo. Este procedimiento requiere una unidad de filtración de vacío para el lavado (proporcionado por el usuario final).
<ol><li>Permita que todos los reactivos a temperatura ambiente (20-25 ° C) antes de uso.</li>
	<li>Conjunto de la placa del filtro en una cubierta de placa invertida en todo momento durante los pasos de la instalación e incubación de la prueba, para que la parte inferior de la placa no toque ninguna superficie ya que puede ocasionar fugas.</li>
	<li>Mantener la placa en posición vertical durante el procedimiento de ensayo completo, incluyendo los pasos de lavado, para evitar perder granos.</li>
	<li>Mantener la placa en el oscuro o envuelto con papel de aluminio para todos los pasos de incubación.</li>
	<li>Ejecutar todos los estándares y las muestras como duplicados, dispuestos en la placa en un orden secuencial.</li>
	<li>Humedezca previamente la placa del filtro mediante la adición de 100 μl de 1 x de tampón de lavado para cada bien y dejar reposar 1 min a temperatura ambiente (si está usando microplacas filtro de fondo).</li>
	<li>Volumen de buffer de quitar mediante el uso de los colectores de vacío (5-10 s). No exceda 10 " Hg de vacío. Lavado de exceso de Blot Almacenador intermediario de la parte inferior de la placa presionando la placa en una pila de toallas de papel limpias. Coloque el plato encima de la cubierta de la placa invertida. 
	Nota: Los pasos 5.1-5.2 pueden omitirse si se realiza el ensayo con un V-microplacas o micro FACS tubos.</li>
	<li>Para muestras sobrenadante de cultivo de células, añadir 25 μl de tampón de ensayo a todos los pocillos. Añadir 25 μl de cada estándar a los pozos estándar. Añada 25 μl de cada muestra en los pocillos de la muestra.</li>
	<li>Para la medición de muestras de suero o plasma, añada 25 μl de la matriz B en los pozos estándar. Añada 25 μl de tampón de ensayo a los pocillos de la muestra. Añadir 25 μl de cada estándar a los pozos estándar. Añada 25 μl de cada suero diluido o muestra de plasma a los pocillos de la muestra.</li>
	<li>Vortex mezclados granos para 30 s. Añadir 25 μl de granos mezclados en cada pocillo, sacudiendo la botella grano intermitentemente para evitar el asentamiento del grano. El volumen final debe ser 75 μL en cada pocillo después de la adición de granos de.</li>
	<li>Selle la placa con un sellador de placas. Envuelva toda la placa, incluyendo la cubierta de la placa invertida, con papel de aluminio. Colocar la placa sobre un agitador de placa, fijarlo y agitar a aproximadamente 500 rpm durante 2 h a temperatura ambiente. Para evitar fugas, no aplique presión positiva el sellador de placa.</li>
	<li>Sin invertir, colocar la placa en el colector de vacío y aplique vacío como antes y añadir 200 μL de 1 x de tampón de lavado para cada bien.</li>
	<li>Sacar el contenido de los pocillos de la placa de ensayo de filtración de vacío. Secar el tampón de lavado de exceso de la parte inferior de la placa con una almohadilla absorbente o toallas de papel. Repita este paso una vez más. 
	Nota: Si el ensayo se realiza utilizando un FACS V fondo microplacas o micro tubos saltar pasos 5.12 y 5.13. En su lugar centrifugar la placa a 1.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente, luego retire el sobrenadante con una pipeta multicanal.</li>
	<li>Añadir 25 μl de anticuerpos de detección (consulte la tabla de materiales) a cada pocillo.</li>
	<li>Selle la placa con un sellador de placas frescas. Envolver toda la placa, incluyendo la cubierta de la placa invertida, con papel de aluminio.</li>
	<li>Colocar la placa sobre un agitador de placa y agitar a aproximadamente 500 rpm durante 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Sin aspirar, añadir 25 μl del reactivo de SA-PE directamente a cada pocillo. No dilución del reactivo es necesario.</li>
	<li>Selle la placa con un sellador de placas frescas. Envolver toda la placa, incluyendo la cubierta de la placa invertida, con papel de aluminio.</li>
	<li>Colocar la placa sobre un agitador de placa y agitar a aproximadamente 500 rpm por 30 min a temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita el paso anterior 5.13.</li>
	<li>Añadir 200 μL de 1 x de tampón de lavado para cada pozo. Vuelva a suspender las cuentas en un agitador de placa durante 1 minuto</li>
	<li>Utilizando una pipeta multicanal, transferir muestras de la placa de filtro a los tubos para leer las muestras en un citómetro de flujo FACS. 
	Nota: Volumen de muestra puede aumentarse de 200 μl a 300 μL añadiendo un extra de 100 μl de 1 x de tampón de lavado a cada tubo para evitar que la muestra de funcionamiento en seco. Si es necesarias muestras pueden ser almacenadas a 4 ° C protegido de la luz y analizados al día siguiente. Sin embargo, almacenamiento prolongado de la muestra puede llevar a la menor señal.</li>
</ol> 6. Configuración de citómetro de flujo Nota: para generar datos fiables, el citómetro de flujo debe configurarse correctamente antes de adquisición de datos. Este proceso varía para los usuarios individuales en algunos relación dependiendo de la configuración del instrumento particular que el ensayo se realiza en. Un proceso de instalación generalizada para un citómetro capaz de medir PE y APC y equipado con ambos un 488 y 633 nm láser se analiza más adelante.
<ol><li>Poner en marcha el flujo citómetro y adquisición de software según el fabricante ' instrucciones suministradas con el instrumento de.</li>
	<li>Crear una trama de punto con FSC (forward scatter) en el eje x y el SSC (dispersión de lado) para el eje y. Establece FSC y SSC en modo linear.</li>
	<li>Crear una segunda trama de punto con el PE en el eje x y el APC para el eje y. Este terreno debe configurarse como un modo de visualización basado en el registro de.</li>
	<li>Vortex el frasco de granos crudos incluidos en el kit de 30 s para volver a suspender las cuentas. Estos granos contienen un colorante interno de APC y se componen de dos poblaciones de tamaño.</li>
	<li>Transfiera 400 μL de los granos crudos a un tubo nuevo de FACS.</li>
	<li>Ajustar la velocidad de flujo citómetro de flujo a baja.</li>
	<li>Ejecutar los granos crudos, cuidadosamente ajustar la ganancia y la tensión de FSC y SSC para ambas poblaciones de tamaño de estos granos son visiblemente separadas y fáciles de puerta.</li>
	<li>Ajustar el umbral de la FSC para excluir los eventos no deseados (es decir, burbujas de aire o desechos).</li>
	<li>Parcela en el FSC y SSC, dibujar una puerta que incluye todas las poblaciones de grano. 
	Nota: Los granos crudos contienen dos poblaciones de tamaño de los granos, el más pequeño " un granos de " y el más grande " grano B " regiones.</li>
	<li>Mostrar las poblaciones de grano cerrado de la parcela FSC y SSC en la segunda trama de punto con PE en el eje x y el APC para el eje y.</li>
	<li>Ajustar la tensión de la PMT para el canal de fluorescencia de APC para que la señal APC para todas las poblaciones del grano tiene una intensidad de fluorescencia media (IMF) que se encuentra entre 1 x 10 1 y 5 x 10 3.</li>
	<li>Vortex el frasco de configuración PE cuentas por 30 s para volver a suspender las cuentas.</li>
	<li>Cuentas de transferencia 400 μL del PE a un tubo nuevo de FACS.</li>
	<li>Tubo de perlas de reemplazar los granos crudos del tubo desde el citómetro de flujo con el PE.</li>
	<li>Ajustar la tensión del tubo (PMT) fotomultiplicador para el PE fluorescencia canal ajuste para que la IMF de las cuentas PE cae entre el rango específico del lote encontrado aparece en el frasco de cuentas PE. 
	Nota: Las cuentas de instalación PE contienen granos del tamaño de una población (" cuentas de un " solamente).</li>
</ol> 7. Adquisición de datos Nota: los procedimientos exactos asociados a la adquisición de datos en un instrumento dado pueden variar y dependen en el citómetro ' Especificaciones de configuración de s y el software de interfaz utilizado. Las siguientes instrucciones por lo tanto, se pretenden destacar los pasos requeridos en el análisis sin importar el citómetro empleado en el análisis.
<ol><li>Verificar el citómetro de flujo se encuentra aún a la baja.</li>
	<li>Establece el número de eventos de grano adquirido a cerca de 300 por analito. Para un 13-plex panel esto equivale a adquirir 3.900 eventos combinada de ambas poblaciones de tamaño de grano (granos de A + B).</li>
	<li>Vortex cada muestra 5 s antes del análisis.</li>
	<li>Leer las muestras. Al leer las muestras, fijar el citómetro de flujo para el modo de configuración primero y espere hasta que se estabiliza la población de grano antes de cambiar al modo de adquisición.</li>
	<li>Usar nombres simples con numeración consecutiva para archivos de datos para facilitar el análisis de datos.</li>
	<li>Exportar sólo los eventos cerrados (A + B grano regiones) en lugar de total de eventos.</li>
	<li>Almacenar todos los archivos de FCS en la misma carpeta para cada ensayo. Si ejecuta ensayos múltiples, crear una carpeta independiente para cada ensayo.</li>
</ol> &lt; clase p= "jove_title" &gt; 8. Proceder al análisis de datos Nota: los archivos de la FCS generados en el citómetro de flujo deben ser analizados usando el software de análisis de datos, que puede descargarse gratis 14.
<ol><li>Instalar el software de análisis de datos en un PC.</li>
	<li>Transferir todos los archivos de ensayo FCS a la computadora que contiene el software de análisis.</li>
	<li>Conecte el dongle de clave de licencia (incluido en el kit) en un puerto USB del ordenador.</li>
	<li>Iniciar el software de análisis de datos.</li>
	<li>Haga clic en el azul " agregar archivos " botón situado en la parte superior de la pantalla.</li>
	<li>Vaya a la carpeta que contiene los archivos de la FCS de la prueba en el pop-up ventana que aparece.</li>
	<li>Haga clic en y arrastre todos los archivos de ensayo FCS del emergente ventana a la pantalla de software. Todos los archivos ahora deben aparecer en una lista de.</li>
	<li>Haga clic en el verde " siguiente " botón en la parte inferior derecha de la pantalla. Haga clic y mantenga pulsado para arrastrar el pequeño curva estándar azul botones (C7 a C0) a sus correspondientes archivos de FCS de la lista para definir la curva estándar.</li>
	<li>Haga clic en el verde " siguiente " botón en la parte inferior derecha de la pantalla para abrir el bloquea pop up ventana.</li>
	<li>En el lado izquierdo de la ventana bloquea escriba los nombres de ambos el A y regiones de grano B análisis objetivos de analito y su ID de asociado del grano (que se encuentra en el manual suministrado con el ensayo) en orden ascendente.</li>
	<li>Seleccionar la herramienta bloquea desde la parte superior de la pop-up ventana y utilizarlo para dibujar 2 puertas en la parcela FSC y SSC, alrededor de los granos de A y un segundo alrededor de los granos de B.</li>
	<li>Revisar la APC vs PE scatter diagramas que aparecen a continuación de la trama FSC y SSC que aparecen. Habrá 6 bandas de analito en las cuentas de A (diagrama izquierdo) y 7 bandas de analito en las cuentas de B (diagrama derecho). 
	Nota: Gates puede redibujarse manualmente seleccionando la herramienta de borrador en la parte superior y haga clic en para eliminar una determinada puerta. La herramienta bloquea puede luego ser seleccionada y aplicar manualmente una puerta a la región de banda deseada.</li>
	<li>Haga clic en el verde " OK " botón para cerrar ventana emergente bloquea y volver a la lista de archivos FCS.</li>
	<li>Definir cualquier diluciones que fueron hechas a las muestras biológicas por derecho haga clic en un archivo determinado, seleccionando " dilución doble " en el menú y entrada el valor correcto.</li>
	<li>Haga clic en el verde " ejecutar " en la parte inferior derecha de la pantalla para generar las curvas estándar para el análisis y calcular las concentraciones de las muestras biológicas desconocidas.</li>
</ol>

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</ol>

Los autores son empleados de BioLegend, que fabrica los reactivos descritos en este manuscrito. Vigene Tech, Inc. desarrolló el software de análisis de datos LEGENDplex que se utiliza para analizar los datos generados por el ensayo descrito en este manuscrito.

Puede proporcionar el formato de ensayo descrito en el presente Protocolo robusta cuantificación de perfiles mediador soluble en muestras biológicas que al experimentador tiene técnica de buen laboratorio y cumple con el protocolo recomendado.
Hay varios pasos fundamentales que deben seguirse para garantizar resultados confiables. En primer lugar, las normas recombinantes se debe reconstituir en tampon de ensayo el tiempo completo recomendado y después sólo diluida en tubos de polipropileno. Tubos de poliestireno pueden promover la adherencia de las proteínas en la pared de los tubos, que pueden conducir a las señales de baja cuando se genera la curva estándar. En segundo lugar, agitando durante los pasos de incubación adecuada es fundamental. Sin agitación adecuada, las características de unión de los granos de ensayo pueden ser seriamente obstaculizadas. Además, el lavado apropiado entre los pasos de incubación también se requiere. El experimentador debe asegurarse de que exceso reactivos se extraen de los pozos antes de comenzar el siguiente paso en el protocolo. Configuración de instrumentos para el citómetro de flujo utilizado para cuestionar las cuentas de ensayo debe optimizarse así. En particular, valores de PMT se deben ajustar para asegurar la separación adecuada del grano y amplio rango dinámico de las curvas estándar. Finalmente, justo antes de que se analizan en el citómetro, granos debe agitarse para asegurar la suspensión adecuada y para evitar la formación de agregados que pueden sesgar los resultados.
Potencialmente, este protocolo puede ser modificado para analizar homogenados de tejido, así como los tipos de muestra en este manuscrito, siempre y cuando el investigador está dispuesto a optimizar su Protocolo de lisis antes de realizar ensayos de placa grande, completo. La técnica real por supuesto variará dependiendo del tipo de tejido; sin embargo, en general el protocolo debe usar un tampón de pH neutro que contiene concentraciones fisiológicas de sales iónicas, ningunos productos químicos desnaturalización y preferiblemente sin detergentes. Si se debe usar detergente, concentraciones de detergente no iónico deben mantenerse a un mínimo (por ejemplo, no más del 1%). El búfer debe contener también inhibidores de la proteasa suficiente para evitar la degradación proteolítica de proteínas de la blanco. Sin importar el protocolo de lisis utilizado, los preparativos finales deben centrifugarse para retirar las partículas antes del análisis.
En cuanto a limitaciones del análisis, las concentraciones de analito objetivos tipos de muestra biológica pueden variar mucho. Para cuantificar adecuadamente las concentraciones de analito, debe caer dentro de los valores superior e inferior de la curva estándar. Extrapolación de los valores de la curva no es necesariamente confiable y no se recomienda. Los investigadores por lo tanto deben optimizar las diluciones de las muestras de concretas en experiencias piloto antes de ejecutar un análisis completo de la placa. Además, la cuidadosa preparación de las muestras biológicas a ensayarse es fundamental para el éxito de este formato de ensayo. Las muestras lipémicas, hemolizadas o contienen residuos de proteínas afectan las interacciones de anticuerpos de antígenos que definen el principio fundamental de este inmunoensayo y hacer que los resultados no interpretables.
Este análisis es importante con respecto a los métodos existentes de cuantificación por varias razones. Cuando se ejecuta correctamente, el formato de ensayo puede cuantificar hasta 13 analitos de una muestra usando volúmenes mucho más pequeños que sería necesario analizar la muestra utilizando tradicionales ensayos de ELISA. Este formato de ensayo también no requiere instrumentación dedicada para llevar a cabo. Esto es una ventaja en comparación con otros inmunoensayos basados en grano disponibles en el mercado como el ensayo se puede ejecutar utilizando cualquier número de citómetros de flujo utilizado.
Investigación científica sobre el papel había jugado por citoquinas y factores secretados redes en salud y la enfermedad se está expandiendo. El formato de ensayo descrito en este manuscrito puede ser una herramienta valiosa para los investigadores tratando de entender estos fenómenos complejos y multifacéticos. Programas activos de investigación biomédica están comenzando a explorar el papel de las redes de citocinas en no sólo áreas generalizadas tales como inflamación6, sino también en el contexto de Estados de enfermedad específica como la aterosclerosis, el cáncer y la neuroinflamación 1516,de,17. Sin duda, investigación seguirá creciendo en estas áreas como la búsqueda de nuevas terapias tratar estas condiciones crónicas se expande. La necesidad de cuantificación precisa y fiable de los mediadores solubles asociada a estas enfermedades seguirá siendo una prioridad de investigación crítica.

En su papel como moléculas de señalización solubles, citocinas median los procesos altamente coordinados y multifactoriales que regulan las respuestas inmunológicas de host. Se expresan en todas las fases del proceso inflamatorio, de iniciación a la resolución y regular una red de interacción compleja que incluye su propia síntesis y la de sus receptores celulares1. Esta red de comunicación se acoda con una complejidad que va más allá de las relaciones sinérgicas o antagónicas que puedan existir entre los componentes individuales. De hecho, muchas citocinas son conocidos a compartir funciones redundantes o por lo menos parcialmente superpuestos2,3.
Enfoques de Biología de sistemas integrados que cuantifican simultáneamente múltiples analitos del cytokine actualmente ofrecen una comprensión cada vez más amplia de la cytokinomes único que orquestar la respuesta inmune subyacente enfermedad de múltiples Estados4,5. Estos Estados de enfermedad van desde inflamación generalizada y cáncer, las afecciones neuro-degenerativas, enfermedades cardiovasculares6,7,8,9.
Tales redes de citoquinas pueden ser interrogados con eficacia usando inmunoensayos basados en grano LEGENDplex. Estos ensayos se basan en el mismo principio que el sándwich genitals del ensayo (ELISA) y utilizan microesferas codificada de la fluorescencia con anticuerpos de captura covalentemente Unidos a su superficie. Estos anticuerpos se inmovilizan en superficies mucho menores que los requeridos por los formatos tradicionales de ELISA. Esto permite que dichos ensayos se realizará con mucho menos volumen de la muestra, mientras que al mismo tiempo reducir no vinculante y proporcionando multiplexado análisis de varios analitos.
El ensayo descrito en el presente Protocolo utiliza esta tecnología para cuantificar hasta 13 objetivos simultáneamente. Datos de este ensayo pueden obtenerse usando una amplia variedad de citómetros de flujo comúnmente disponibles y a diferencia de otros ensayos disponibles no requieren el uso de instrumentación para análisis específicos dedicado. Con un creciente catálogo de analito validado paneles, estos ensayos se han utilizado en varios proyectos de investigación biomédica10,11,de12,13.
Para demostrar la facilidad y utilidad del formato de ensayo, en este experimento que utilizamos un panel de citoquinas helper T de ratón para cuantificar 13 separar las concentraciones de citoquinas de sobrenadantes de cultivo de tejidos obtenidos de esplenocitos de ratón cultivadas bajo múltiples condiciones estimulantes. Además de sobrenadantes de cultivo de tejidos, este ensayo también se puede realizar utilizando muestras de suero o plasma.

<table><tbody><tr><td>Centrífuga Allegra 6R con adaptador de portador MICROPLUS Beckman</td><td>Coulter</td><td>366816</td><td>Para los ensayos LEGENDplex se ejecuta en microtubos, placa de 96 pocillos con fondo en V o U (opcional)</td></tr><tr><td>LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel</td><td>BioLegend</td><td>740005</td><td>Multiplex Immunoassay (13-plex)</td></tr><tr><td>Anti-ratón CD3 y épsilon; anticuerpo</td><td>BioLegend</td><td>100314</td><td>Clon 145-2C11, bajo contenido en endotoxinas, formato libre de azidas</td></tr><tr><td>Anticuerpo CD28 antiratón</td><td>BioLegend</td><td></td><td>102112 Clone 37.51, bajo contenido de endotoxinas, formato libre de azidas Bomba de</td></tr><tr><td>vacío</td><td>EMD Millipore</td><td>WP6111560</td><td>Para ensayos LEGENDplex con placas filtrantes (recomendado)</td></tr><tr><td>Colector de vacío</td><td>EMD Millipore</td><td>MSVMHTS00</td><td>Para ensayos LEGENDplex con placas filtrantes (recomendado)</td></tr><tr><td>Depósitos de reactivos desechables estériles</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-130</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Tubos MicroFACS de polipropileno</td><td>Fisher Scientific</td><td>11-842-90</td><td>Para los ensayos LEGENDEplex se realizan en microtubos, placa de 96 pocillos con fondo en V o U (opcional)</td></tr><tr><td>Kit de pipetas</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-388-100</td><td>Cuatro tamaños de pipeta (0,2-2 y micro; L, 2-20 y micro; L, 20-200 y micro; L, 100-1000 y micro; L)</td></tr> <tr><td>Pipeta multicanal</td><td>Fisher Scientific</td><td>FA10011G</td><td>capaz de dispensar 5 &mu; L a 200 &mu; L</td></tr><tr><td>Agitador de microplacas</td><td>Fisher Scientific</td><td>88880023</td><td>O equivalente</td></tr><tr><td>Microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>75002410</td><td>O</td></tr><tr><td>tubos FACS</td> equivalentes <td>Fisher Scientific</td><td>NC9885747</td><td>12 x 75 mm fondo redondo</td></tr><tr><td>PMA (Forbol 12-miristato 13-acetato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisacárido (LPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L-8274</td><td>Escherichia coli O26:B6</td></tr><tr><td>Ionomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0634</td><td></td></tr><tr><td>Branson B200 Limpiador ultrasónico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z305359</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z666505</td><td>1,5 mL Citómetro</td></tr><tr><td>de flujo</td><td>Varios</td><td>Varios</td><td>Citómetro equipado con un solo láser (488 nm azul) o dos láseres (488 nm azul o 532 nm verde + 633 nm rojo) capaces de leer longitudes de onda de emisión a 575 nm y 660 nm</td></tr><tr><td>Placa de polipropileno de 96 pocillos</td><td>VWR</td><td>82050-662</td><td>Para los ensayos LEGENDplex se ejecuta en microtubos, placa de 96 pocillos con fondo en V o U (opcional)</td></tr></tbody></table>

múltiplex del cytokine perfil de esplenocitos de ratón estimulados utilizando una plataforma basada en grano de cytometric del inmunoensayo

Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform

Los inmunoensayos basados en grano emplean el mismo principio básico como inmunoensayo de sándwich. Captura de cuentas, que se pueden distinguir por el tamaño y la intensidad de fluorescencia interna allophycocyanin (APC), se conjugan para anticuerpos específicos para un analito determinado. A continuación, un panel seleccionado de captura definido conjuntos de grano se incuba con una muestra biológica que contenga los analitos específicos de los anticuerpos de captura. Se añade un anticuerpo de detección biotinilado cóctel, que conduce a la formación de bocadillos de grano-analito-detección anticuerpo de captura.
Por último, se añade estreptavidina-ficoeritrina (PE-SA), que se une a los anticuerpos de detección biotinilado, proporcionando intensidades de la señal fluorescente en proporción a la cantidad de analito límite. El PE fluorescente señal de regiones específicas del analito granos se cuantifica mediante citometría de flujo y las concentraciones de analitos particular se determinan usando software de análisis de datos y la curva estándar generada en el ensayo.
En este experimento, utilizamos un panel ratón T helper citoquinas simultáneamente cuantificar la concentración de 13 objetivos separados del cytokine en sobrenadantes de cultivo de tejidos de esplenocitos de ratón cultivadas bajo diferentes condiciones de estimulación.

Este protocolo muestra cómo se puede utilizar una plataforma basada en grano de inmunoensayo para cuantificar simultáneamente perfiles del cytokine de muestras biológicas mediante un citómetro de flujo. Las muestras biológicas utilizadas en este ejemplo fueron sobrenadantes de cultivo celular de esplenocitos de ratón que habían sido previamente incubados bajo varias condiciones de activación, aunque el formato de ensayo también ha sido validado para su uso con muestras de suero o plasma.
Datos generados por el ensayo se utilizan para construir curvas estándar para todos los analitos en el panel multiplexado. El software de análisis de datos clasifica cada analito particular basado en un tamaño único del grano y la intensidad de la APC y cuantifica a través de un reportero de PE. Los rangos dinámicos, así como la sensibilidad del ensayo se demostró cuando se grafica en una escala log-log en la figura 2A. El software utiliza el análisis de datos y un algoritmo de ajuste curva de 5 parámetros para calcular con precisión no sólo las concentraciones de analitos en usuario proporcionado muestras biológicas pero también los límites de detección en el extremo alto y bajo de todas las curvas estándar (tabla 1 ). El formato descrito en el presente Protocolo también proporciona precisión de ensayo altamente robusto. En la figura 2B y 2C se presentan datos que representan la variabilidad intraensayo de cada analito. Dos concentraciones de proteína estándar independiente (alta y baja) fueron analizadas en un ensayo con 16 repeticiones para cada muestra. Figura 2 y 2D representan la variabilidad interensayo de analitos de tres ensayos independientes. Como con los experimentos de precisión inter-ensayo, altas y bajas concentraciones estándar se analizaron 3 réplicas en cada uno de los experimentos independientes. Mínima variabilidad en la concentración calculada de proteínas objetivo es claramente visible.
Para demostrar la utilidad de análisis cytometric basados en grano en interrogar a perfiles de expresión de citoquinas, esplenocitos de ratón fueron incubados bajo varias condiciones de activación. Además de un control sin estimular, las células también se incubaron con anticuerpos anti-CD3/anti-CD28, o forbol 12-miristato 13-acetato, LPS y ionomycin. Sobrenadantes de cultivo celular se recolectaron 48 h más tarde y ensayado mediante el panel de citoquinas helper T de ratón. Los resultados de la cuantificación de este experimento están representados en la figura 3 y el efecto de las condiciones de estimulación sobre las concentraciones de citoquinas está claramente delineado.
Los resultados descritos anteriormente son típicos, como el experimentador tiene técnica de laboratorio buena y sigue el protocolo de ensayo proporcionado. Fuentes de error en este formato de análisis pueden surgir de desviaciones en los tiempos de incubación, volúmenes de reactivo, se lava, o de la incorrecta configuración de PMT en el citómetro de flujo utilizado para analizar las muestras. En la Figura 4A una dispersión de un ensayo exitoso muestra 2 poblaciones distintas de grano que están claramente definidas. Esto puede compararse a Figura 4B, donde han llevado mala adherencia lavado y Protocolo a agregados de grano que difuminan las dos poblaciones. Además, según lo evidenciado por los escombros en el cuadrante izquierdo inferior, citómetro total eventos fueron exportados para análisis más bien que el formato preferido de sucesos de barrio cerrados. Citómetro apropiado configurar es fundamental para generar datos fiables en este ensayo. De PMT correcta figura 4 configuración permite la resolución de cada uno de los 6 analitos en el canal de clasificación de APC. Incorrecta configuración de PMT dará como resultado datos similares a la presentada en la figura 4 , donde el canal APC tiene poblaciones de grano con intensidades superpuestas de clasificación. Esto invalidará el ensayo ya que será imposible calcular las concentraciones de analito sin poblaciones claramente definidas de granos de ensayo.
<img alt="Linealidad y variabilidad de la cuantificación de citocinas; Gráficos; Análisis de variabilidad intra/interensayo." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2: rangos de la curva estándar y precisión intraensayo. (A) una curva estándar representativa mediante el panel de Mouse T helper citoquinas. Una curva estándar se debe ejecutar con cada ensayo. (B-C) Precisión inter-ensayo. Se analizaron dos muestras con diferentes concentraciones de proteínas de la blanco (alta y baja) en un ensayo con 16 repeticiones para cada muestra. Los datos se representan como la media + desviación estándar. (D-E) Precisión inter-ensayo. Se analizaron dos muestras con diferentes concentraciones de proteínas de la blanco (alta y baja) en tres ensayos independientes con 3 repeticiones para cada muestra. Los datos se representan como la media + desviación estándar. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Gráfico de barras de los niveles de citoquinas (pg/mL) en pruebas de inmunoestimulación: CD3/CD28, LPS, PMA+Iono." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3: cuantificación de resultados representante. Esplenocitos de ratón (1 x 106 células) fueron cultivadas a 37 ° C + 5% CO2 en diversas condiciones: sin estimular, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 μg/mL revestido de placa) + αCD28 (1 μg/mL solubilidad), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). Sobrenadantes de cultivo fueron recogidos después de 48 h luego cuantificaron mediante el panel de citoquinas helper T de ratón. Perfiles de expresión diferencial de citocinas en respuesta a las condiciones de estimulación son claramente visibles. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Gráficos de citometría de flujo que muestran SSC vs. FSC y APC vs. PE, ilustrando el análisis de la población celular." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56440/56440fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4: resultados de éxito vs ensayos fracasados. (A) pruebas acertados tendrán poblaciones de distinto grano para las poblaciones de microesfera. (B) ensayos fracasados tendrán separación de la población pobre, agregados de grano y demasiados eventos recogidos. (C) pruebas acertados han definido claramente intensidades en el canal de fluorescencia de clasificación que son fáciles de puerta y cuantificar. (D) ensayos infructuosos habrán mal separado y clasificación de intensidades que se superponen varias poblaciones de grano, haciendo difícil la cuantificación. Muchos de estos errores pueden evitarse a través del cuidado de adhesión al Protocolo de ensayo. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56440/56440fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td colspan="3">Curva estándar</td>
			<td colspan="2">Sensibilidad (pg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analito</td>
			<td>Fórmula de ajuste</td>
			<td>CV</td>
			<td>R2</td>
			<td>Min.</td>
			<td>Max.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-Γ</td>
			<td>5-P.log(4.43, 14.40, 0.54, 9.11, 0.01)</td>
			<td>1.77%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.1</td>
			<td>18105.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-5</td>
			<td>5-P.log(4.36, 12.68, 0.64, 5.73, 0.36)</td>
			<td>1.32%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>14514.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TNF-Α</td>
			<td>5-P.log(4.36, 11.63, 0.79, 5.45, 0.37)</td>
			<td>1.48%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>1.9</td>
			<td>20109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-2</td>
			<td>5-P.log(4.46, 12.62, 0.78, 5.07, 0.34)</td>
			<td>1,34%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>25109.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-6</td>
			<td>5-P.log(4.58, 11.66, 0.64, 5.77, 0.37)</td>
			</tr></tbody></table>TD&gt;1.70%
			<td>0.99</td>
			<td>2.0</td>
			<td>7022.0</td>
		
		<tr>
			<td>IL-4</td>
			<td>5-P.log(4.27, 12.23, 0.62, 5.72, 0.36)</td>
			<td>1.36%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>13273.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-10</td>
			<td>5-P.log(4.67, 11.65, 1.20, 6.28, 0.61)</td>
			<td>1.81%</td>
			<td>0.99</td>
			<td>2.2</td>
			<td>5190.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-9</td>
			<td>5-P.log(4.32, 13.86, 0.86, 5.90, 0.45)</td>
			<td>1.82%</td>
			<td>1</td>
			<td>1.9</td>
			<td>12602.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17A</td>
			<td>5-P.log(4.06, 14.03, 0.47, 6.52, 0.32)</td>
			<td>0.99%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>12285.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-17F</td>
			<td>5-P.log(4.52, 12.15, 0.61, 5.52, 0.34)</td>
			<td>0,92%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>14841.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-21</td>
			<td>5-P.log(4.90, 8.03, 1.77, 4.74, 1.11)</td>
			<td>0,79%</td>
			<td>1</td>
			<td>9.0</td>
			<td>12943.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-22</td>
			<td>5-P.log(4.57, 12.56, 0.63, 6.06, 0.39)</td>
			<td>1.16%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.0</td>
			<td>6408.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IL-13</td>
			<td>5-P.log(4.40, 11.44, 0.22, 3.19, 1.45)</td>
			<td>1.11%</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
			<td>16728.0</td>
		</tr>
	

Tabla 1: ajuste de curvas estándar y sensibilidad del ensayo. El software de análisis de datos se utilizó para generar curvas estándar para todos los analitos en el ensayo multiplex. Este análisis completamente automatizado aplica una robusta 5 parámetro ajuste de la curva algoritmo a las normas de la serie de dilución de ensayo y también fue usado para definir la sensibilidad del ensayo con los límites teóricos de detección.

Este protocolo describe la cuantificación de múltiples citoquinas objetivos simultáneamente en sobrenadantes de cultivo de tejidos de esplenocitos de ratón estimulados usando grano multiplex inmunoensayo basado en la plataforma y un citómetro de flujo.

Múltiplex del Cytokine Perfil de esplenocitos de ratón estimulados utilizando una plataforma basada en grano de cytometric del inmunoensayo

Bead-based immunoassays employ the same basic principle as sandwich immunoassays. Capture beads, which can be differentiated by size and internal ...

El objetivo general de este protocolo es cuantificar múltiples dianas de citocinas simultáneamente en sobrenadantes de cultivo de tejidos recogidos de esplenocitos de ratón estimulados utilizando un inmunoensayo múltiple basado en perlas y un citómetro de flujo. Este método se puede utilizar para responder a preguntas clave en el campo de la inmunología, como por ejemplo, ¿cuáles son los perfiles únicos de citocinas que orquestan la respuesta inmunitaria en el contexto de estados de enfermedad específicos? La principal ventaja de esta técnica es que la cuantificación simultánea de múltiples anélidos se puede realizar utilizando volúmenes de muestra mucho menores que los formatos ELISA tradicionales, al tiempo que se reduce la unión inespecífica.Nicholas Johnsen, investigador asociado de nuestro equipo de desarrollo de productos, demostrará el procedimiento. Comience este procedimiento con la preparación de la muestra biológica como se describe en el protocolo de texto. Para preparar las perlas premezcladas inmovilizadas con anticuerpos, sonique el frasco de perlas premezcladas durante un minuto en un baño de sonicador a temperatura ambiente.A continuación, agite el vórtice durante 30 segundos antes de usar. Si no se dispone de un baño de sonicador, aumente el tiempo de vórtice a un minuto. Para la preparación estándar, agregue 250 microlitros de tampón de ensayo para reconstituir el cóctel estándar de citocinas Th de ratón liofilizado.Mezcle mediante un breve vórtice y deje reposar el vial a temperatura ambiente durante 10 minutos. Transfiera el cóctel estándar a un tubo de microcentrífuga de polipropileno etiquetado como C7. Esto se utilizará como el estándar superior. Etiquete seis tubos de microcentrífuga de polipropileno como C1 a C6. Agregue 75 microlitros de tampón de ensayo a cada uno de estos tubos.A continuación, transfiera 25 microlitros del estándar superior, C7, al tubo C6 y mezcle bien mediante vórtice. Este será el estándar C6. Continúe realizando diluciones en serie de una a cuatro, utilizando una nueva punta de pipeta para cada tubo para agregar 25 microlitros del estándar anterior a los 75 microlitros de tampón de ensayo en el siguiente tubo estándar más bajo.Siga cada adición por vórtice. Utilice el tampón de ensayo como estándar de cero picogramos por mililitro. Para realizar el ensayo, deje que todos los reactivos se calienten a temperatura ambiente antes de usarlos.En esta demostración se utilizan placas de filtro de polipropileno. Es absolutamente esencial que la placa se mantenga en posición vertical durante todo el procedimiento de ensayo, incluidos los pasos de lavado, para evitar perder las perlas. Humedece previamente el papel de filtro añadiendo 100 microlitros de tampón de lavado 1X a cada pocillo y deja reposar las placas durante un minuto a temperatura ambiente.Retire el volumen del tampón utilizando el colector de vacío. Seque el exceso de tampón de lavado de la parte inferior de la placa presionando la placa sobre una pila de toallas de papel limpias. Luego, coloque la placa encima de la cubierta de la placa invertida.Para muestras de sobrenadante de cultivo celular, agregue 25 microlitros de tampón de ensayo a todos los pocillos. Agregue 25 microlitros de cada patrón a los pocillos estándar. Finalmente, agregue 25 microlitros de cada muestra a los pocillos de muestra.Agita las cuentas mezcladas durante 30 segundos. Luego, agregue 25 microlitros de las cuentas mezcladas a cada pocillo, agitando la botella de cuentas de forma intermitente para evitar que se asienten. Selle la placa con un sellador de placas.Una vez sellado, envuelva toda la placa, incluida la cubierta de la placa invertida, con papel de aluminio. Coloque la placa en un agitador de placas, asegúrela y agite a aproximadamente 500 RPM durante dos horas a temperatura ambiente. Sin invertir, coloque la placa en el colector de vacío y aplique el vacío como antes.Luego, agregue 200 microlitros de tampón de lavado 1X a cada pocillo. Retire el contenido de los pocillos de la placa de ensayo mediante filtración al vacío. Seque el exceso de tampón de lavado de la parte inferior de la placa con una almohadilla absorbente o toallas de papel antes de repetir este paso una vez más.A continuación, agregue 25 microlitros de anticuerpos de detección a cada pocillo. Después de sellar la placa con un sellador de placas nueva, envuelva toda la placa, incluida la cubierta de la placa invertida, con papel de aluminio. Coloque la placa en un agitador de placas y agite a aproximadamente 500 RPM durante una hora a temperatura ambiente.Sin aspirar, agregue 25 microlitros de reactivo de ficoeritrina estreptavidina directamente a cada pocillo. Selle y envuelva el plato como antes. Luego, coloque la placa en un agitador de placas y agite a aproximadamente 500 RPM durante 30 minutos a temperatura ambiente.Después de repetir el paso de filtración al vacío dos veces, agregue 200 microlitros de tampón de lavado 1X a cada pocillo. Vuelva a suspender las cuentas en un agitador de platos durante un minuto. Con una pipeta multicanal, transfiera las muestras de la placa filtrante a los tubos FACS para leer las muestras en un citómetro de flujo.Ponga en marcha el citómetro de flujo y el software de adquisición de acuerdo con las instrucciones del fabricante proporcionadas con el instrumento. Cree un diagrama de puntos con dispersión hacia adelante en el eje X y dispersión lateral para el eje Y. Establezca la dispersión hacia adelante y la dispersión lateral en el modo lineal.Agite el frasco de cuentas crudas incluido en el kit durante 30 segundos para volver a suspender las cuentas. Transfiera 400 microlitros de las cuentas crudas a un nuevo tubo FACS. Ajuste el caudal del citómetro de flujo a bajo.Ejecute las cuentas en bruto, ajustando cuidadosamente la ganancia y el voltaje para la dispersión directa y la dispersión lateral, de modo que las poblaciones de ambos tamaños de estas cuentas estén visiblemente separadas y sean fáciles de controlar. Ajuste el umbral de dispersión directa para excluir eventos no deseados. En el diagrama de dispersión directa frente a dispersión lateral, dibuje una puerta que incluya todas las poblaciones de cuentas.Visualice las poblaciones de cuentas compuertas del diagrama de dispersión frontal frente a dispersión lateral en el segundo diagrama de puntos con PE en el eje X y APC para el eje Y. Ajuste el voltaje PMT para el canal de fluorescencia APC de modo que la señal APC para todas las poblaciones de perlas tenga una intensidad de fluorescencia mediana, o MFI, que se encuentre entre 10 y 5.000. A continuación, agite el vial de perlas de configuración de PE durante 30 segundos para volver a suspender las perlas.Transfiera 400 microlitros de las perlas de PE resuspendidas a un nuevo tubo FACS. Reemplace el tubo de perlas crudas en el citómetro de flujo con el tubo de perlas de PE. Ajuste el voltaje del tubo fotomultiplicador para la configuración del canal de fluorescencia de PE de modo que el MFI de las perlas de PE se encuentre entre el rango específico del lote que se encuentra en el vial de perlas de PE.Para realizar la adquisición de datos, establezca el número de eventos de cordón que se van a adquirir en aproximadamente 300 por anolito. Agite cada muestra durante cinco segundos antes del análisis. A continuación, lea los ejemplos.Al leer las muestras, primero configure el citómetro de flujo en el modo de configuración y espere hasta que se estabilice la población de perlas antes de cambiar al modo de adquisición. Exporte solo los eventos cerrados en lugar de los eventos totales antes de realizar el análisis de datos como se describe en el protocolo de texto. Se generaron curvas estándar representativas para los anolitos objetivo utilizando el panel de citocinas auxiliares T del ratón.Los ensayos ejecutados correctamente demostrarán curvas con amplios rangos dinámicos, como se muestra aquí. Se deben ejecutar curvas estándar cada vez que se realiza el ensayo. Los esplenocitos de ratón se cultivaron en diversas condiciones durante 48 horas.Se recolectaron sobrenadantes de cultivo y luego se cuantificaron las concentraciones de 13 objetivos utilizando el panel de citocinas auxiliares T de ratón. Los perfiles diferenciales de expresión de citocinas, en respuesta a las condiciones de estimulación, son claramente visibles. Una vez dominada, el trabajo de laboratorio de esta técnica puede completarse en menos de cinco horas y media si se realiza correctamente.Los tiempos de adquisición de datos y análisis posteriores variarán en función del número de muestras. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo emplear este protocolo, cuantificar las concentraciones de anolitos en muestras biológicas mediante un inmunoensayo citométrico basado en perlas. Esto incluye la preparación del reactivo, los pasos de incubación y la configuración del citómetro de flujo para la adquisición de datos.

multiplex-cytokine-profiling-stimulated-mouse-splenocytes-using

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este procedimiento describe la detección y aislamiento de los leucocitos de ratón TH17 que secretan activamente IL-17 a la estimulación.

Detección y aislamiento de células viables Ratón T IL-17 Secretoras

Este video muestra un inmunoensayo múltiple basado en perlas para cuantificar múltiples objetivos de citocinas en una muestra. Se utiliza una mezcla de distintas microesferas conjugadas con anticuerpos específicos de citocinas para unirse a las citocinas presentes en la muestra. Los reporteros marcados con estreptavidina se inmovilizan en las citocinas unidas mediante anticuerpos de detección biotinilados. La citometría de flujo identifica las citocinas unidas en función de los tamaños únicos y...

Un inmunoensayo múltiple basado en perlas para cuantificar múltiples dianas citocinas

Presentamos en el estudio actual un ensayo basado en fluorescencia novela usando linfocitos derivados de un ratón transgénico. Este ensayo es adecuado para la selección de alto rendimiento (HTS) de moléculas pequeñas dotados de la capacidad de cualquiera de inhibición o promoción de la activación de linfocitos.

Una de linfocitos ensayo basado en la fluorescencia adecuado para el cribado de alto rendimiento de pequeñas moléculas

Análisis de la película del rasgón citoquinas ayuda en el estudio de varias enfermedades oculares. Ensayos multiplexores grano base son sencillas y sensibles y permiten el análisis de múltiples objetivos en muestras con pequeños volúmenes. Aquí se describe un protocolo para rasgar película del cytokine perfilar un uso grano base ensayo múltiple.

Perla base ensayo Multiplex para el análisis de perfiles de Cytokine de lágrima

Aquí describimos un enfoque proteómico unicelular para evaluar inmunológico fenotípico y funcional (inducción de citocinas intracelulares) alteraciones en las muestras de sangre periférica, analizadas mediante citometría de masas.

Análisis unicelular de Immunophenotype y producción de citoquinas en sangre periférica por citometría de masas

El uso de reactivos de referencia para el ensayo de liberación de citocinas permite obtener perfiles de seguridad in vitro más reproducibles y estandarizados de los anticuerpos monoclonales inmunoterapéuticos. En este artículo describimos cómo se pueden utilizar los ensayos de liberación de citocinas junto con un panel de reactivos de referencia para predecir la seguridad de algunos anticuerpos monoclonales terapéuticos.

Uso de reactivos de referencia para confirmar la solidez de los ensayos de liberación de citocinas para la predicción de la seguridad de los anticuerpos monoclonales

El protocolo describe una plataforma microfluídica avanzada para medir cuantitativamente la dinámica de secreción de citocinas de células mononucleares individuales de sangre periférica humana. La plataforma mide hasta tres citocinas en paralelo (IL-6, TNFα e IL-1β) para cada célula individual estimulada con lipopolisacárido como ejemplo.

Enfoque microfluídico para resolver la secreción simultánea y secuencial de citocinas de células polifuncionales individuales 

Los inmunoensayos basados en sangre total proporcionan una herramienta fácil y eficiente en recursos para analizar la inmunidad específica del antígeno con fines de diagnóstico e investigación. Este artículo proporciona un protocolo optimizado basado en sangre total con coestimulación dual para un análisis exhaustivo de la inmunidad del huésped a patógenos fúngicos y virales, incluida una versión de bajo volumen para pacientes pediátricos y animales pequeños.

Ensayo de sangre total con coestimulación dual para el análisis específico de antígenos de la inmunidad del huésped a patógenos fúngicos y virales

Este informe describe un protocolo automatizado para ensayos de inmunofluorescencia múltiple (mIF) en un tintor de portaobjetos automatizado. Demuestra la alta reproducibilidad de la proteómica espacial en autotinciones tisulares estándar de alto rendimiento y generadores de imágenes de fluorescencia de portaobjetos completos, lo que es ideal para ensayos mIF personalizados en un gran número de portaobjetos de tejido en investigación traslacional.

Ensayos de inmunofluorescencia multiplex automatizados de alto rendimiento para la investigación traslacional

Desarrollamos un protocolo que es rápido, sensible y reproducible para el perfil de expresión génica de patógenos durante una infección.

Perfiles de expresión génica de los microbios Infección de Uso de una Plataforma Digital Bar-codificación

Aprende a cuantificar múltiples citocinas simultáneamente en sobrenadantes de esplenocitos de ratón estimulados mediante un inmunoensayo multiplex basado en perlas y citometría de flujo.

Múltiplex del Cytokine Perfil de esplenocitos de ratón estimulados utilizando una plataforma basada en grano de cytometric del inmunoensayo (Video) | JoVE Journal

Múltiplex del Cytokine Perfil de esplenocitos de ratón estimulados utilizando una plataforma basada en grano de cytometric del inmunoensayo

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