Múltiplex del Cytokine Perfil de esplenocitos de ratón estimulados utilizando una plataforma basada en grano de cytometric del inmunoensayo

El objetivo general de este protocolo es cuantificar múltiples dianas de citocinas simultáneamente en sobrenadantes de cultivo de tejidos recogidos de esplenocitos de ratón estimulados utilizando un inmunoensayo múltiple basado en perlas y un citómetro de flujo. Este método se puede utilizar para responder a preguntas clave en el campo de la inmunología, como por ejemplo, ¿cuáles son los perfiles únicos de citocinas que orquestan la respuesta inmunitaria en el contexto de estados de enfermedad específicos? La principal ventaja de esta técnica es que la cuantificación simultánea de múltiples anélidos se puede realizar utilizando volúmenes de muestra mucho menores que los formatos ELISA tradicionales, al tiempo que se reduce la unión inespecífica.

Nicholas Johnsen, investigador asociado de nuestro equipo de desarrollo de productos, demostrará el procedimiento. Comience este procedimiento con la preparación de la muestra biológica como se describe en el protocolo de texto. Para preparar las perlas premezcladas inmovilizadas con anticuerpos, sonique el frasco de perlas premezcladas durante un minuto en un baño de sonicador a temperatura ambiente.

A continuación, agite el vórtice durante 30 segundos antes de usar. Si no se dispone de un baño de sonicador, aumente el tiempo de vórtice a un minuto. Para la preparación estándar, agregue 250 microlitros de tampón de ensayo para reconstituir el cóctel estándar de citocinas Th de ratón liofilizado.

Mezcle mediante un breve vórtice y deje reposar el vial a temperatura ambiente durante 10 minutos. Transfiera el cóctel estándar a un tubo de microcentrífuga de polipropileno etiquetado como C7. Esto se utilizará como el estándar superior. Etiquete seis tubos de microcentrífuga de polipropileno como C1 a C6. Agregue 75 microlitros de tampón de ensayo a cada uno de estos tubos.

A continuación, transfiera 25 microlitros del estándar superior, C7, al tubo C6 y mezcle bien mediante vórtice. Este será el estándar C6. Continúe realizando diluciones en serie de una a cuatro, utilizando una nueva punta de pipeta para cada tubo para agregar 25 microlitros del estándar anterior a los 75 microlitros de tampón de ensayo en el siguiente tubo estándar más bajo.

Siga cada adición por vórtice. Utilice el tampón de ensayo como estándar de cero picogramos por mililitro. Para realizar el ensayo, deje que todos los reactivos se calienten a temperatura ambiente antes de usarlos.

En esta demostración se utilizan placas de filtro de polipropileno. Es absolutamente esencial que la placa se mantenga en posición vertical durante todo el procedimiento de ensayo, incluidos los pasos de lavado, para evitar perder las perlas. Humedece previamente el papel de filtro añadiendo 100 microlitros de tampón de lavado 1X a cada pocillo y deja reposar las placas durante un minuto a temperatura ambiente.

Retire el volumen del tampón utilizando el colector de vacío. Seque el exceso de tampón de lavado de la parte inferior de la placa presionando la placa sobre una pila de toallas de papel limpias. Luego, coloque la placa encima de la cubierta de la placa invertida.

Para muestras de sobrenadante de cultivo celular, agregue 25 microlitros de tampón de ensayo a todos los pocillos. Agregue 25 microlitros de cada patrón a los pocillos estándar. Finalmente, agregue 25 microlitros de cada muestra a los pocillos de muestra.

Agita las cuentas mezcladas durante 30 segundos. Luego, agregue 25 microlitros de las cuentas mezcladas a cada pocillo, agitando la botella de cuentas de forma intermitente para evitar que se asienten. Selle la placa con un sellador de placas.

Una vez sellado, envuelva toda la placa, incluida la cubierta de la placa invertida, con papel de aluminio. Coloque la placa en un agitador de placas, asegúrela y agite a aproximadamente 500 RPM durante dos horas a temperatura ambiente. Sin invertir, coloque la placa en el colector de vacío y aplique el vacío como antes.

Luego, agregue 200 microlitros de tampón de lavado 1X a cada pocillo. Retire el contenido de los pocillos de la placa de ensayo mediante filtración al vacío. Seque el exceso de tampón de lavado de la parte inferior de la placa con una almohadilla absorbente o toallas de papel antes de repetir este paso una vez más.

A continuación, agregue 25 microlitros de anticuerpos de detección a cada pocillo. Después de sellar la placa con un sellador de placas nueva, envuelva toda la placa, incluida la cubierta de la placa invertida, con papel de aluminio. Coloque la placa en un agitador de placas y agite a aproximadamente 500 RPM durante una hora a temperatura ambiente.

Sin aspirar, agregue 25 microlitros de reactivo de ficoeritrina estreptavidina directamente a cada pocillo. Selle y envuelva el plato como antes. Luego, coloque la placa en un agitador de placas y agite a aproximadamente 500 RPM durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Después de repetir el paso de filtración al vacío dos veces, agregue 200 microlitros de tampón de lavado 1X a cada pocillo. Vuelva a suspender las cuentas en un agitador de platos durante un minuto. Con una pipeta multicanal, transfiera las muestras de la placa filtrante a los tubos FACS para leer las muestras en un citómetro de flujo.

Ponga en marcha el citómetro de flujo y el software de adquisición de acuerdo con las instrucciones del fabricante proporcionadas con el instrumento. Cree un diagrama de puntos con dispersión hacia adelante en el eje X y dispersión lateral para el eje Y. Establezca la dispersión hacia adelante y la dispersión lateral en el modo lineal.

Agite el frasco de cuentas crudas incluido en el kit durante 30 segundos para volver a suspender las cuentas. Transfiera 400 microlitros de las cuentas crudas a un nuevo tubo FACS. Ajuste el caudal del citómetro de flujo a bajo.

Ejecute las cuentas en bruto, ajustando cuidadosamente la ganancia y el voltaje para la dispersión directa y la dispersión lateral, de modo que las poblaciones de ambos tamaños de estas cuentas estén visiblemente separadas y sean fáciles de controlar. Ajuste el umbral de dispersión directa para excluir eventos no deseados. En el diagrama de dispersión directa frente a dispersión lateral, dibuje una puerta que incluya todas las poblaciones de cuentas.

Visualice las poblaciones de cuentas compuertas del diagrama de dispersión frontal frente a dispersión lateral en el segundo diagrama de puntos con PE en el eje X y APC para el eje Y. Ajuste el voltaje PMT para el canal de fluorescencia APC de modo que la señal APC para todas las poblaciones de perlas tenga una intensidad de fluorescencia mediana, o MFI, que se encuentre entre 10 y 5.000. A continuación, agite el vial de perlas de configuración de PE durante 30 segundos para volver a suspender las perlas.

Transfiera 400 microlitros de las perlas de PE resuspendidas a un nuevo tubo FACS. Reemplace el tubo de perlas crudas en el citómetro de flujo con el tubo de perlas de PE. Ajuste el voltaje del tubo fotomultiplicador para la configuración del canal de fluorescencia de PE de modo que el MFI de las perlas de PE se encuentre entre el rango específico del lote que se encuentra en el vial de perlas de PE.

Para realizar la adquisición de datos, establezca el número de eventos de cordón que se van a adquirir en aproximadamente 300 por anolito. Agite cada muestra durante cinco segundos antes del análisis. A continuación, lea los ejemplos.

Al leer las muestras, primero configure el citómetro de flujo en el modo de configuración y espere hasta que se estabilice la población de perlas antes de cambiar al modo de adquisición. Exporte solo los eventos cerrados en lugar de los eventos totales antes de realizar el análisis de datos como se describe en el protocolo de texto. Se generaron curvas estándar representativas para los anolitos objetivo utilizando el panel de citocinas auxiliares T del ratón.

Los ensayos ejecutados correctamente demostrarán curvas con amplios rangos dinámicos, como se muestra aquí. Se deben ejecutar curvas estándar cada vez que se realiza el ensayo. Los esplenocitos de ratón se cultivaron en diversas condiciones durante 48 horas.

Se recolectaron sobrenadantes de cultivo y luego se cuantificaron las concentraciones de 13 objetivos utilizando el panel de citocinas auxiliares T de ratón. Los perfiles diferenciales de expresión de citocinas, en respuesta a las condiciones de estimulación, son claramente visibles. Una vez dominada, el trabajo de laboratorio de esta técnica puede completarse en menos de cinco horas y media si se realiza correctamente.

Los tiempos de adquisición de datos y análisis posteriores variarán en función del número de muestras. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo emplear este protocolo, cuantificar las concentraciones de anolitos en muestras biológicas mediante un inmunoensayo citométrico basado en perlas. Esto incluye la preparación del reactivo, los pasos de incubación y la configuración del citómetro de flujo para la adquisición de datos.