Name: Whole-mount y coloración de silicuas y órganos flor de Arabidopsis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprende técnicas de disección de flores y silicuas de Arabidopsis con tinción de montaje total para estudiar el desarrollo reproductivo. Este método permite analizar mutantes y factores ambientales en biología vegetal.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue financiado por la Universidad de Zurich, un IEF Marie Curie Grant (grant no. TransEpigen-254797 a A.H.), una beca avanzada del Consejo Europeo de investigación (no de la concesión. Medea-250358 a U.G.) y un proyecto de investigación y desarrollo tecnológico (grant MecanX a U.G.) de SystemsX.ch, la iniciativa Suiza en biología de sistemas.

1. flor y fijación de silicua
<ol><li>Flores de la cosecha y silicuas de plantas sincronizan en la inauguración de la primera flor. Nota: Bajo las condiciones experimentales utilizadas aquí, plantas Inicio floración aproximadamente 21 días después del trasplante de las placas de Murashige y Skoog (MS) al suelo. Semillas estratificadas durante 3 – 4 días a 4 ° C y germinado/cultivadas en placas de MS de 22 ° C/16 h luz y 18 ° C/8 h oscurezca durante 8 a 10 días, antes de transplantar las plántulas en suelo rico en nutrientes en macetas bajo las mismas condiciones (figura 1). El número de repeticiones depende del objetivo específico de investigación, pero se recomienda un mínimo de 5 inflorescencias (a partir de 5 plantas individuales) para cada tratamiento. Si las flores son la unidad experimental, se recomienda un mínimo de 10 flores por repetición.</li>
	<li>Cortar las inflorescencias o flores (Figura 1E-H) con unas tijeras pequeñas (por ejemplo, tijeras) y colóquelos inmediatamente en un tubo de microcentrífuga (para fijación de flor inflorescencia única) o en un tubo cónico (para fijaciones colectivas) que contiene recién hecho de Carnoy metanol/ácido acético y fijadores FPA50 (dependiendo de la aplicación, vea abajo) en el hielo. Nota: Las muestras deben estar completamente sumergidas en el fijador.</li>
	<li>Dejar el tejido en el fijador durante 4 horas hasta toda la noche a 4 ° C. Nota: Infiltración de vacío puede utilizarse para acelerar la penetración del fijador en el tejido, pero esto puede ser perjudicial a la preservación de la estructura del tejido. Los autores no implementan infiltración vacío.</li>
	<li>Retirar el fijador, agregar suficiente etanol 70% para cubrir las muestras y volver a 4 ° C durante al menos 24 h; las muestras pueden permanecer indefinidamente en esta solución. Después de extraer el etanol, proceder de inmediato al siguiente paso; disección, o claro de SDS.</li>
</ol>2. disección bajo el estereomicroscopio
<ol><li>Puesto recién hecho etanol al 70% en vidrio de relojero a una placa Petri pequeña de apoyo.</li>
	<li>
La inflorescencia, flor/silicua en este recién hechas fijador y disecar bajo el estereomicroscopio con fórceps y una jeringa con una aguja.
	<ol>
<li>Use vidrio o dispositivo similar que permite que las muestras de estar totalmente cubierto con etanol (recomendado) para la disección de las inflorescencias y desgarrando órganos florales de las flores maduras (sépalos, pétalos y estambres puede ser diseccionado en esta etapa un relojero ) para evitar el riesgo de secar muestras.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diseccionar silicuas y pequeños capullos en una diapositiva como se describe a continuación.
	<ol>
<li>Dejar a un lado vidrio de relojero con muestras previamente procesadas y utilice una diapositiva normal para la disección final.</li>
		<li>La muestra de interés hacia la diapositiva y agregar 10 μl de etanol al 70% fresco. Trabajar con rapidez en la disección final y añadir 10 μl de etanol, si es necesario, para mantener la muestra húmeda sin el líquido excesivo.</li>
		<li>Para soltar los granos de polen de los estambres, consulte el paso 5.1. Para la disección de los carpelos y los óvulos, siga el procedimiento descrito en la figura 2. Este procedimiento se aplica a todas las etapas de desarrollo del carpelo, incluyendo la etapa de desarrollo de silicuas verdes. Nota: No agregue etanol si hay suficiente remanente de etanol de mover las muestras; disección de muestras muy pequeñas es mucho más fácil en una cantidad mínima de líquido. Mantenga sólo los órganos de interés (sépalos, pétalos, estambres, carpelos, óvulos, semillas o granos de polen) en la diapositiva. Este procedimiento asegurará un espesor uniforme entre el portaobjetos y cubreobjetos, correspondiente al espesor del órgano objeto de examen, resultando en una mayor homogeneidad y así eficacia para exámenes microscópicos (mayor número de ejemplares de blanco en el mismo plano focal).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Use un pequeño trozo de papel secante para absorber y eliminar tanto etanol como sea posible. Proceder rápidamente al siguiente paso (sección 3, 4 o 6) antes de la muestra se seca a cabo.</li>
</ol>3. a base de hidrato de cloral claro y tinción combinada de claro
Nota: Se obtienen mejores resultados de limpieza base de hidrato de cloral con FPA50 fijada material.
<ol><li>Lugar 20 μl de solución de limpieza (hidrato de cloral/glicerol, modificado medio de Hoyer, 4½ de Herr o soluciones de IKI-4½ de Herr) en la diapositiva del rodamiento de la muestra. Con un par de jeringas con agujas hypodermal, coloque los especímenes reduciendo el espacio entre ellos, y los bancos donde el órgano de interés se enfrenta hacia abajo. Eliminar cualquier burbuja de aire restante usando la aguja.</li>
	<li>Bajar lateralmente un cubreobjetos y colocarlo, presionando muy suavemente suavemente y espere hasta que la solución claro llena el espacio entre. Añadir solución de compensación mínima, si es necesario, para llenar todo el espacio bajo el cubreobjetos.</li>
	<li>Coloque el portaobjetos sobre un soporte deslizante y dejarlo bajo la campana. Proceder a observaciones microscópicas después de al menos 4 h y durante los siguientes días 4 – 5.</li>
</ol>4. combinado Alexander tinción y claro 4½ de Herr de anteras
Nota: El protocolo original de Alexander se basa en la liberación de los granos de polen en la diapositiva antes de la tinción. Un eficiente y más informativo, modificado Alexander coloración y procedimiento de despejo son la tinción de granos de polen maduros dentro de las anteras maduras pero no dehiscente.
<ol><li>Elegir capullos recién cosechados que se van a abrir con anteras no dehiscente. Nota: No tome más jóvenes capullos porque Alexander manchas está diseñado para los granos de polen maduros y no mancha eficientemente los granos de polen inmaduros. Se recomienda un mínimo de 5 flores por tratamiento de inflorescencias y diversas plantas.</li>
	<li>Preparar una placa de 96 pocillos con solución de suficiente Alexander sumergir un brote de flor. Exponer las anteras quitando los sépalos y pétalos y sumergirlos en solución de Alexander. Mantener las muestras bajo la campana para 1-3 h.</li>
	<li>Reemplazar la solución de Alejandro con la solución 4½ de Herr y coloque la placa multi-bien debajo de la campana para una incubación durante la noche.</li>
	<li>Con unas pinzas, mueva suavemente los botones florales despejados hacia una nueva diapositiva. Puesto que puede ocurrir algún remanente de la solución de Alejandro, utilice un papel secante para quitar tanta solución claro como sea posible.</li>
	<li>Diseccionar los estambres y quitar todos los otros tejidos. Siga los pasos en la sección 3 con solución 4½ de Herr.</li>
</ol>5. eliminación de la exina de los granos de polen
Nota: Recomendamos usar fijador de Carnoy para tinción DAPI.
<ol><li>Siga los procedimientos de disección y fijación que se describe en las secciones 1 y 2. Por ahora, uno debe tener de uno a muchos estambres en la diapositiva dentro de una mínima cantidad de etanol al 70%.</li>
	<li>Utilice un papel secante para quitar exceso etanol y añadir 5-10 μl de la solución DAPI. Utilizando un par de jeringas con agujas, liberar los granos de polen dentro de esa pequeña cantidad de solución (por ejemplo, uso una jeringa para inmovilizar el estambre y el otro para liberar los granos de polen). Si la solución se seca, agregue otro 5 μl de DAPI.</li>
	<li>Quitar toda la suciedad del estambre es un paso crítico, que sólo los granos de polen quedan entre el portaobjetos y el cubreobjetos.</li>
	<li>Coloque un cubreobjetos sobre la diapositiva del rodamiento de la muestra bajando hacia los lados y añadir la mínima cantidad de solución DAPI que llenan el espacio. Coloque el dedo índice sobre el cubreobjetos, y sin aplastamiento muy mucho hacer un rápido y firme y corto movimiento de deslizamiento. Nota: Para medir la fuerza necesaria y la amplitud del movimiento deslizante, este paso debe realizarse varias veces, comprobar los resultados cada vez que bajo el microscopio.</li>
	<li>Agregar solución DAPI si es necesario y mejorar el portaobjetos en una caja húmeda en la oscuridad a 4 ° C por 15 min a 1 h. proceder a observar las muestras con fluorescencia de campo amplio o microscopía confocal en 24 h. tratar de combinar este procedimiento con el SDS claro para comprobar si otro lugar momentos pueden obtenerse.</li>
</ol>6. sodio dodecil sulfato (SDS) de claro
Nota: Según el órgano floral a analizar y habilidades del investigador para disecar los especímenes muy suaves y pequeño, el tratamiento de SDS puede realizarse ya sea antes (para investigadores experimentados) o después de la disección paso (por menos los investigadores) en ácido acético en metanol fijada material.
<ol><li>Usar vidrio de relojero, un portaobjetos cóncavo o un tubo de microcentrífuga para incubar muestras disecadas o no disecado en 0.2 N NaOH solución durante la noche a temperatura ambiente y 1% SDS.</li>
	<li>Manejar con cuidado porque la muestra es muy suave y tiene un aspecto transparente. Enjuague varias veces con agua. Nota: Remanente de la solución de SDS podrían conducir a la precipitación al añadir la solución de tinción, por ejemplo, azul de anilina.</li>
	<li>Para muestras no disecados, siga el procedimiento de disección que se describe en la sección 2, utilizar agua en lugar de etanol al 70%. Después de disecar el tejido deseado, retire cualquier restos y residuos y cualquier exceso de agua con un papel secante, luego añadir 20-40 μl de solución de tinción y continúe con el paso 6.5.</li>
	<li>Para las muestras disecadas, cuidadosamente mover la muestra de la solución de lavado y colóquela en un portaobjetos limpio y añadir 20-40 μl de solución de tinción.</li>
	<li>Coloque suavemente un cubreobjetos sobre el portaobjetos bajando hacia los lados. Tenga cuidado de no para aplastar la preparación. Si el tejido es muy suave, lugar cualquiera delgada separador entre el portaobjetos y el cubreobjetos en sus esquinas(por ejemplo, cinta o un cubreobjetos roto), dejando un espacio de cámara como entre portaobjetos y cubreobjetos, tal que el cubreobjetos no triturar a la muestra.</li>
	<li>Coloque todas las diapositivas dentro de una caja húmeda, cubrir con papel de aluminio y coloque en 4 ° C durante por lo menos 1 h. proceder a observar a la muestra con fluorescencia de campo amplio o microscopía confocal en 24 h.</li>
</ol>

<ol><li>Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/374027a0">The origin and early diversification of angiosperms.</a> Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).</li>
<li>Friedman, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+meaning+of+Darwin%27s+%27abominable+mystery%27%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">The meaning of Darwin's 'abominable mystery'.</a> Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).</li>
<li>Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+search+of+the+first+flower%3A+A+Jurassic+angiosperm%2C+Archaefructus%2C+from+Northeast+China%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In search of the first flower: A Jurassic angiosperm, Archaefructus, from Northeast China.</a> Science. 282 (5394), 1692-1695 (1998).</li>
<li>Mulcahy, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rise+of+the+angiosperms%3A+a+genecological+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The rise of the angiosperms: a genecological factor.</a> Science. 206 (4414), 20-23 (1979).</li>
<li>Friedman, W. E., Moore, R. C., Purugganan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+plant+development%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">The evolution of plant development.</a> Am J Bot. 91 (10), 1726-1741 (2004).</li>
<li>Endress, P. K. Angiosperm floral evolution: morphological developmental framework. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0065229606440015">Advances in botanical research Volume 44: Developmental genetics of the flower</a>. Soltis, D., Soltis, P., Leebens-Mack, J. , Academic Press. 1-61 (2006).</li>
<li>Alvarez-Buylla, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flower+development%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Flower development.</a> Arabidopsis Book. 8, 30127(2010).</li>
<li>Beddington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+security%3A+contributions+from+science+to+a+new+and+greener+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Food security: contributions from science to a new and greener revolution.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 365 (1537), 61-71 (2010).</li>
<li>Godfray, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Food+security%3A+The+challenge+of+feeding+9+billion+people%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Food security: The challenge of feeding 9 billion people.</a> Science. 327 (5967), 812-818 (2010).</li>
<li>Burkle, L. A., Alarcón, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+future+of+plant-pollinator+diversity%3A+understanding+interaction+networks+across+time%2C+space%2C+and+global+change%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Bot%22%5BJournal%5D)">The future of plant-pollinator diversity: understanding interaction networks across time, space, and global change.</a> Am J Bot. 98 (3), 528-538 (2011).</li>
<li>Meyerowitz, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+and+molecular+model+for+flower+development+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Suppl%22%5BJournal%5D)">A genetic and molecular model for flower development in Arabidopsis thaliana.</a> Dev Suppl. 1, 157-167 (1991).</li>
<li>Hafidh, S., Fíla, J., Honys, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male+gametophyte+development+and+function+in+angiosperms%3A+a+general+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Reprod%22%5BJournal%5D)">Male gametophyte development and function in angiosperms: a general concept.</a> Plant Reprod. 29 (1-2), 31-51 (2016).</li>
<li>Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+germline+formation%3A+common+concepts+and+developmental+flexibility+in+sexual+and+asexual+reproduction%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Plant germline formation: common concepts and developmental flexibility in sexual and asexual reproduction.</a> Development. 142 (2), 229-241 (2015).</li>
<li>Sprunck, S., Dresselhaus, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+cell+fusions+during+double+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Three cell fusions during double fertilization.</a> Cell. 161 (4), 708-709 (2015).</li>
<li>Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertilization+mechanisms+in+flowering+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Fertilization mechanisms in flowering plants.</a> Curr Biol. 26 (3), R125-R139 (2016).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+flower+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early flower development in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).</li>
<li>Roeder, A. H., Yanofsky, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fruit+development+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">Fruit development in Arabidopsis.</a> Arabidopsis Book. 4, e0075(2006).</li>
<li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale%2C+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Scale, a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).</li>
<li>Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SeeDB.+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">SeeDB. a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).</li>
<li>Susaki, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-brain+imaging+with+single-cell+resolution+using+chemical+cocktails+and+computational+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis.</a> Cell. 157 (3), 726-739 (2014).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Yang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+phenotyping+within+transparent+intact+tissue+through+whole-body+clearing%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing.</a> Cell. 158 (4), 945-958 (2014).</li>
<li>Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nmeth.2481">CLARITY for mapping the nervous system.</a> Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).</li>
<li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ACT-PRESTO%3A+rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+%283D%29+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">ACT-PRESTO: rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Sci Rep. 6, 18631(2016).</li>
<li>Endress, P. K. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2995533">Evolution and floral diversity: the phylogenetic surroundings of Arabidopsis and Antirrhinum.</a> Int J Plant Sci. 153 (3, Part 2), S106-S122 (1992).</li>
<li>Reyes-Olalde, J. I., Zuñiga-Mayo, V. M., Chávez Montes, R. A., Marsch-Martínez, N., de Folter, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inside+the+gynoecium%3A+at+the+carpel+margin%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">Inside the gynoecium: at the carpel margin.</a> Trends Plant Sci. 18 (11), 644-655 (2013).</li>
<li>Hill, J. P., Lord, E. M. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/b89-375#.WhXEGbQ-dZ0">Floral development in Arabidopsis thaliana: a comparison of the wild type and the homeotic pistillata mutant.</a> Can J Bot. 67 (10), 2922-2936 (1989).</li>
<li>Sessions, R. A., Zambryski, P. C. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7789281">Arabidopsis gynoecium structure in the wild type and in ettin mutants.</a> Development. 121 (5), 1519-1532 (1995).</li>
<li>Schneitz, K., Hülskamp, M., Pruitt, R. E. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1046/j.1365-313X.1995.07050731.x/abstract">Wild-type ovule development in Arabidopsis thaliana: a light microscope study of cleared whole-mount tissue.</a> Plant J. 7 (5), 731-749 (1995).</li>
<li>Sundberg, E., Ferrándiz, C. Gynoecium patterning in Arabidopsis: a basic plan behind a complex structure. <a target="_blank" href="https://books.google.com/books?hl=en&lr=&id=pzu4SVKg1PcC&oi=fnd&pg=PA35&dq=Sundberg,+E+%22Annual+Plant+Reviews%22&ots=G8KcTeYQ7v&sig=KxClSALK76vqi5_xDvnDOlhXfg4#v=onepage&q=Sundberg%2C%20E%20%22Annual%20Plant%20Reviews%22&f=false">Annual Plant Reviews Volume 38: Fruit Development and Seed Dispersal</a>. Østergaard, L. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 35-69 (2009).</li>
<li>Meinke, D. W. <a target="_blank" href="http://cshmonographs.org/index.php/monographs/article/view/3103">10 seed development in Arabidopsis thaliana.</a> Cold Spring Harbor Monograph Archive. 27, 253-295 (1994).</li>
<li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeigel%2C+D+%22Arabidopsis%3A+a+laboratory+manual%22">Arabidopsis: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring Harbour, N.Y. (2002).</li>
<li>Herr, J. M. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2441475">A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms.</a> Am J Bot. 58 (8), 785-790 (1971).</li>
<li>Alexander, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+stain+for+pollen+fungi%2C+yeast+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Stain+Technol%22%5BJournal%5D)">A versatile stain for pollen fungi, yeast and bacteria.</a> Stain Technol. 55 (1), 13-18 (1980).</li>
<li>Herr, J. M. Jr <a target="_blank" href="http://www.jstor.org/stable/24334877">Applications of a new clearing technique for the investigation of vascular plant morphology.</a> J Elisha Mitchell Sci Soc Chapel Hill N C. 88 (3), 137-143 (1972).</li>
<li>Herr, J. M. Clearing techniques for the study of vascular plant tissues in whole structures and thick sections. <a target="_blank" href="http://www.ableweb.org/volumes/vol-5/5-herr.pdf">Tested studies for laboratory teaching. Proceedings of the Fifth Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE)</a>. Goldman, C. A., Hauta, P. L., O'Donnell, M. A., Andrews, S. E., van der Heiden, R. 5, Toronto, Ontario, Canada. 63-84 (1993).</li>
<li>Colcombet, J., Boisson-Dernier, A., Ros-Palau, R., Vera, C. E., Schroeder, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arabidopsis+somatic+embryogenesis+receptor+kinases1+and+2+are+essential+for+tapetum+development+and+microspore+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Arabidopsis somatic embryogenesis receptor kinases1 and 2 are essential for tapetum development and microspore maturation.</a> Plant Cell. 17 (12), 3350-3361 (2005).</li>
<li>Heslop-Harrison, J., Heslop-Harrison, Y., Shivanna, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evaluation+of+pollen+quality+and+a+further+appraisal+of+the+fluorochromatic+%28FCR%29+test+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Theor+Appl+Genet%22%5BJournal%5D)">The evaluation of pollen quality and a further appraisal of the fluorochromatic (FCR) test procedure.</a> Theor Appl Genet. 67 (4), 367-379 (1984).</li>
<li>Stone, J. L., Thomson, J. D., Dent-Acosta, S. J. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2446073">Assessment of pollen viability in handpollination experiments: A review.</a> Amer J Bot. 82 (9), 1186-1197 (1995).</li>
<li>Dafni, A., Firmage, D. <a target="_blank" href="https://link.springer.com/article/10.1007/BF00984098">Pollen viability and longevity: practical, ecological and evolutionary implications.</a> Plant Syst Evol. 222 (1-4), 113-132 (2000).</li>
<li>Lora, J., Testillano, P. S., Risueño, M. C., Hormaza, J. I., Herrero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pollen+development+in+Annona+cherimola+Mill.+%28Annonaceae%29.+Implications+for+the+evolution+of+aggregated+pollen%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Pollen development in Annona cherimola Mill. (Annonaceae). Implications for the evolution of aggregated pollen.</a> BMC Plant Biol. 9, 129(2009).</li>
<li>Ross, K. J., Fransz, P., Jones, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+light+microscopic+atlas+of+meiosis+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Chromosome+Res%22%5BJournal%5D)">A light microscopic atlas of meiosis in Arabidopsis thaliana.</a> Chromosome Res. 4 (7), 507-516 (1996).</li>
<li>Park, S. K., Howden, R., Twell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+thaliana+gametophytic+mutation+gemini+pollen1+disrupts+microspore+polarity%2C+division+asymmetry+and+pollen+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis thaliana gametophytic mutation gemini pollen1 disrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate.</a> Development. 125 (19), 3789-3799 (1998).</li>
<li>Haseloff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+botanical+techniques+for+new+microscopes%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">Old botanical techniques for new microscopes.</a> BioTechniques. 34 (6), 1174-1182 (2003).</li>
<li>Truernit, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+whole-mount+imaging+of+three-dimensional+tissue+organization+and+gene+expression+enables+the+study+of+phloem+development+and+structure+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis.</a> Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).</li>
<li>Hedhly, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starch+turnover+and+metabolism+during+flower+and+early+embryo+development%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development.</a> Plant Physiol. 172 (4), 2388-2402 (2016).</li>
<li>Crane, C. F., Carman, J. G. <a target="_blank" href="https://www.jstor.org/stable/2443827?seq=1#page_scan_tab_contents">Mechanisms of apomixis in Elymus rectisetus from eastern Australia and New Zealand.</a> Am J Bot. 74 (4), 477-496 (1987).</li>
<li>Young, B. A., Sherwood, R. T., Bashaw, E. C. <a target="_blank" href="http://www.nrcresearchpress.com/doi/abs/10.1139/b79-204">Cleared-pistil and thick-sectioning techniques for detecting aposporous apomixis in grasses.</a> Can J Bot. 57 (15), 1668-1672 (1979).</li>
<li>Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ClearSee%3A+a+rapid+optical+clearing+reagent+for+whole-plant+fluorescence+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging.</a> Development. 142, 4168-4179 (2015).</li>
<li>Warner, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+clearing+technique+for+plant+tissues+allowing+deep+imaging+and+compatible+with+Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Phys%22%5BJournal%5D)">An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with Fluorescence Microscopy.</a> Plant Phys. 166, 1684-1687 (2014).</li>
<li>Hasegawa, J., Sakamoto, Y., Nakagami, S., Aida, M., Sawa, S., Matsunaga, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+imaging+of+plant+organs+using+a+simple+and+rapid+transparency+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique.</a> Plant Cell Physiol. 57 (3), 462-472 (2016).</li>
<li>Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Versatile+Optical+Clearing+Protocol+for+Deep+Tissue+Imaging+of+Fluorescent+Proteins+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A Versatile Optical Clearing Protocol for Deep Tissue Imaging of Fluorescent Proteins in Arabidopsis thaliana.</a> PLoS ONE. 11 (8), e0161107(2016).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La existencia de muchos brotes de flor en una inflorescencia simple de Arabidopsis, que abarca todas las etapas del desarrollo flor, ofrece una oportunidad única para estudios tendientes a caracterizar un efecto de un tratamiento o una característica del desarrollo al mismo tiempo a través de las diferentes etapas de desarrollo de la flor. Un punto de referencia entre diferentes plantas individuales es la apertura de la primera flor de la inflorescencia principal. Las plantas son tratadas de tal manera que se si...

Flores están definiendo entre los más importantes órganos de las angiospermas. Plantas con flores aparecieron hace unos 90 millones años1y tan rápido que su aparición rápida fue descrito como un "misterio abominable" por Charles Darwin2. El interés de los investigadores de planta en el desarrollo de la flor son diverso. Algunas investigaciones se ha centrado en comprender el origen evolutivo de la flor como un todo, o la evolución de características anatómicas, estructurales y funcionales de flores3,4,5,6 . La alta variación en forma floral y estructura, así como los modos de reproducción sexual y asexual, confiando en ellos, hacer la flor una estructura altamente compleja. Esto ha llevado a diversos esfuerzos por caracterizar las anatomía y características estructurales de los órganos florales, técnicas de luz y electrónica microscópica que podría combinarse con la investigación genética y molecular7. Además, como fuente de frutos y semillas, las flores son de suma importancia para la nutrición humana y animal. Por lo tanto, la caracterización del desarrollo de la flor y la fruta tiene muchas implicaciones para la investigación aplicada, incluyendo la seguridad alimentaria de una población humana creciente y las estrategias de conservación ecológica en un cambiante ambiente8 , 9 , 10.
Desarrollo de la flor en Arabidopsis comienza con la inducción floral y la transformación de lo meristemo vegetativo a un meristemo de la inflorescencia (grupo de flores). Primordios de flores se inician lateralmente en el flanco de la inflorescencia meristem11. Los primordios de órganos florales forman progresivamente en verticilos concéntricos desde el exterior al centro de la flor y eventualmente convierten en sépalos, pétalos, estambres y carpelos7. Estos órganos florales cumplen protección nutritiva, distinta y funcional (por ejemplo, atracción de polinizadores) papeles en diferentes especies de plantas, con los órganos sexuales, sostener el desarrollo de los gametofitos masculinos y femeninos, respectivamente12 , 13. los gametofitos, a su vez, cada uno distinguen un par de hombre (espermatozoides) y los gametos femeninos (óvulo y célula central), que se unen con doble fertilización para formar la próxima generación, el zigoto y el endosperma primario, un soporte de tejido terminal la desarrollo del embrión14,15. Apoyo al desarrollo de frutos y semillas el crecimiento, maduración y conservación del embrión y, eventualmente, su dispersión. Se ha realizado una amplia investigación para caracterizar el desarrollo flor y embriones de diversas especies, especialmente en la especie modelo Arabidopsis7,16,17.
Primeros análisis microscópicos del desarrollo de la flor se basaron en la observación técnicas tal como parafina o incrustación de resina y seccionamiento, combinación con la luz o la microscopía electrónica y procesamiento de las muestras requiere mucho tiempo. Estas técnicas microscópicas tradicionales fueron utilizadas a menudo en combinación con las investigaciones genéticas moleculares, como el análisis microscópicos de mutantes, la localización del ARN mediante hibridación en situ o la inmuno detección de proteínas. Recientes avances en microscopía de fluorescencia confocal y de amplio campo, en análisis de imagen asistido por ordenador 3D de estado de la técnica y el refinamiento continuo de los métodos moleculares que pueden utilizarse en muestras mínimamente procesadas, todo Monte, ha llevado a la necesidad de técnicas de procesamiento de muestra eficiente y mínimo que son preferentemente susceptibles de análisis cuantitativos. En los últimos años ha realizado progresos significativos en el desarrollo de técnicas claro espécimen animal montaje en conjunto. Procesar la muestra transparente mediante reactivos de urea o azúcar-base acuosa (p. ej., escala, SeeDB, cúbico)18,19,20, o eliminando selectivamente lípidos (usando el detergente SDS) después de inclusión de muestras en hidrogeles estables; la eliminación de lípidos puede lograr ya sea por difusión pasiva (p. ej., modificado claridad protocolo21, pacto-PARS-llantas22) o activamente por electroforesis (original claridad protocolo23 y24de la ley-PRESTO). Alentado por este progreso rápido, algunas técnicas derivadas también están surgiendo para su uso en las plantas.
En este trabajo métodos centrado en el modelo de Arabidopsis, describimos el procedimiento para la adecuada disección de capullos, flores y jóvenes silicuas y claro de todo Monte muestras para coloración diversa y procedimientos de observación mediante clásico o un método reciente de compensación basada en la SDS. Se dan ejemplos para almidón, Callosa y la coloración de la cromatina. Aunque estos procedimientos pueden necesitar más mejoras y adaptaciones cuando se utiliza con otras especies, esperamos se fijaron la etapa para la investigación adicional sobre estos métodos simples pero fundamentales que son el punto de partida de muchos proyectos de investigación.

<table><tbody><tr><td><fuerte>Reactivos y materiales</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Scharlau</td><td>ET00102500</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Acético</td><td>Applichem</td><td>A3686,2500</td><td>100% Grado de biología molecular</td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sigma-Aldrich 320099</td><td></td><td>Grado de biología molecular</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Scharlau</td><td>ME03062500</td><td></td></tr><tr><td>Solución de formaldehído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1635</td><td></td></tr><tr><td>Ácido propiónico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>81910-250 ml</td><td></td></tr><tr><td>Hidrato de cloral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15307</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Roth</td><td>3783.1</td><td></td></tr><tr><td>Goma arábiga</td><td>Fluka</td><td>51198</td><td></td></tr><tr><td>Ácido láctico</td><td>Fluka</td><td>69773</td><td></td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>77607-250ML</td><td>Utilizamos fenol líquido (use la densidad para encontrar el volumen requerido para su solución)</td></tr><tr><td>Aceite de clavo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8392-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Xileno</td><td>Roth</td><td>4436.1</td><td></td></tr><tr><td>Yodo</td><td>Fluka</td><td>57665</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de potasio</td><td>Merck</td><td>5043</td><td></td></tr><tr><td>Malaquita</td><td>Verde Fluka</td><td>63160</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fucsina</td><td>Fluka</td><td>84600</td><td></td></tr><tr><td>Naranja G</td><td>Sigma</td><td>7252</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771</td><td>Grado de Biología Molecular</td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71690</td><td></td></tr><tr><td>Di-Hidrógeno Fosfato de Sodio</td><td>Applichem</td><td>A1047,1000</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de Sodio Dibásico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9763-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>04347</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Applichem</td><td>A2937,1000</td><td></td></tr><tr><td>Calcofluor</td><td>Sigma</td><td>F6259</td><td>Abrillantador fluorescente 28</td></tr><tr><td>Auramine</td><td>Chroma</td><td>10120</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td>tóxico</td></tr><tr><td>Triton-X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Azul anilina</td><td>Merck</td><td>1275</td><td></td></tr><tr><td>MS medium</td><td>Carolina</td><td>19-57030</td><td></td></tr><tr><td>Sustrato rico en nutrientes</td><td>Einheitserde</td><td>ED73</td><td></td></tr><tr><td>Vidrio</td><td></td><td></td> de relojero <td>Sin marca específica</td></tr><tr><td>Tubos de centrífuga falcon de 15 ml VWR</td><td></td><td>62406-200</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas Dumond</td><td>Actimed</td><td>0208-5SPSF-PS</td><td></td></tr><tr><td>Pinza</td><td>DUMONT BIOLOGY</td><td>0108-5</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa</td><td>BD</td><td>BD Plastipak 300013</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>Aguja de preparación</td><td>BD</td><td>BD Microlance 304000</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio</td><td>Thermo Scientific</td><td>10143562CE</td> bordes <td>cortados</td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Thermo Scientific</td><td>DV40008</td><td></td></tr><tr><td>Caja</td><td></td><td></td> húmeda <td>Una caja de plástico con toalla de papel húmeda y soportes deslizantes en el interior</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Solutions</strong</td>><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fijadores</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Fijador <td></td><td></td><td>de Carnoy (Farmer)</td><td>Etanol absoluto : ácido acético glacial, 3:1 (ml:ml)</td></tr><tr><td>Metanol/ácido</td><td></td><td></td> acético <td>50 % (v/v) metanol, 10 % (v/v) ácido acético glacial en agua desionizada</td></tr><tr><td>Fijador</td><td></td><td></td> FPA50 <td>Formalina, ácido propiónico, etanol al 50%; 5:5:90 (ml:ml:ml)</td></tr><tr><td><fuerte>Soluciones de aclarado</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hidrato de cloral/glicerol</td><td></td><td></td><td>Hidrato de cloral : glicerol : agua, 8:1:2 (g:ml:ml). Se puede utilizar para todas las etapas de desarrollo de las flores y para el desarrollo de silicio con microscopía DIC. El mejor fijador es la goma arábiga a base de formalina FPA50</td></tr><tr><td>Modified Hoyer</td><td></td><td></td><td>7,5 g, hidrato de cloral 100 g, glicerol 5 ml, agua 30 ml. Se puede utilizar para todas las etapas de desarrollo de las flores y para el desarrollo de silicio con microscopía DIC. El mejor fijador es el fluido</td></tr><tr><td></td><td></td> limpiador a base de formalina FPA50<td>Herr's 4&frac12;</td><td>ácido láctico, hidrato de cloral, cristales de fenol, aceite de clavo, xileno; 2:2:2:2:1, en peso. Se puede utilizar para todas las etapas de desarrollo de las flores (especialmente para el desarrollo de los estambres) y para el desarrollo de la silícula con microscopía DIC. El mejor fijador es la</td></tr><tr>solución <td></td><td></td> FPA50<td>SDS/NaOH</td> a base de formalina<td>: Mezclar-diluir la SDS y la solución madre de NaOH a 1% SDS / 0,2 N NaOH (dilución 10x). Para todas las etapas de desarrollo de la flor y la silicona. El mejor fijador es el fijador de ácido metano/acético; También se pueden utilizar los otros dos fijadores. Se puede combinar con calcofluor, auramina, DAPI y solución de tinción con azul de anilina.</td></tr><tr>Solución <td></td><td></td><td>madre SDS</td><td>10 % (p/v) de dodecil sulfato de sodio. Disuelva 10 g de dodecil sulfato de sodio en 80 ml de agua desionizada y haga hasta 100 ml con agua desionizada.</td></tr><tr>Solución <td></td><td></td><td>madre de NaOH</td><td>2 N Solución de NaOH: disolver 4 g de NaOH en 40 ml de agua desionizada y enrasar hasta 100 ml con agua desionizada</td></tr><tr><td><fuerte>Soluciones combinadas de limpieza y tinción</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Herr's IKI-4&frac12;</td><td></td><td></td><td>A un estándar 4&frac12; (9 g en total) añadir: 100 mg de yodo, 500 mg de yoduro de potasio. Esta solución de limpieza se puede utilizar para todas las etapas de desarrollo de las flores y para el desarrollo de la silicona, ya sea para aumentar el contraste o para caracterizar la dinámica del almidón. Utilice FPA50 para el análisis estructural y el fijador de Carnoy para el análisis cuantitativo del almidón.</td></tr><tr><td>Etanol de tinción</td><td></td><td></td> Alexander <td>95% 10 ml, verde de malaquita (1 % en EtOH al 95 %) 1 ml, ácido fucsina (1 % en ddH2O) 5 ml, naranja G (1% en ddH2O) 0,5 ml, fenol 5 g, hidrato de cloral 5 g, ácido acético glacial 2 ml, glicerol 25 ml . Este aclarado/tinción solo o en combinación con el 4&frac12 de Herr; La solución se puede utilizar para evaluar el aborto del polen en flores con granos de polen maduros y tricelulares. Se utiliza en material no fijo recién cortado.</td></tr><tr><td><Soluciones >tinción fuertes</solución ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>calcofluor</td><td></td><td></td><td>fuerte Calcofluor 0,007% en agua (g:ml). Originalmente se utilizaba como blanqueador óptico. Se puede utilizar para teñir celulosa, polisacáridos carboxilados y calosa en las paredes celulares. Se utiliza con frecuencia para teñir la tina del grano de polen. Los tres fijadores se pueden utilizar con esta solución.</td></tr><tr><td>Solución de</td><td></td><td></td><td>auramina Auramina 0,01% en agua (g:ml). Este tinte fluorescente lipofílico se puede utilizar para teñir cutículas, cutina y exina, entre otros. Los tres fijadores se pueden utilizar con esta solución</td></tr><tr>Mezcla <td></td><td></td><td>de calcofluor y auramina</td><td>Solución de auramina : Solución de calcofluor, 3:1. Se puede utilizar para una tinción combinada con ambas soluciones. Se pueden ensayar otras proporciones manteniendo una menor proporción de calcofluor con respecto a la auramina.</td></tr><tr><td>Solución</td><td></td><td></td><td>DAPI DAPI 0,4 ug/ml, tampón de fosfato sódico 0,1 M (pH 7), Triton-X-100 al 0,1%, EDTA al 1 mM. Esta solución se puede utilizar para teñir las diseminaciones de los cromosomas durante la meiosis masculina y femenina, y los núcleos celulares de cualquier tejido. Se utiliza con frecuencia para estudiar el desarrollo del grano de polen. El Carnoy y el metanol/ácido acético son los mejores fijadores para esta solución. Los fijadores a base de formaldehído, como FPA50, pueden interferir con la tinción. Excitación en el UV y emisión máxima alrededor de 461 nm.</td></tr><tr><td>Tampón de fosfato de sodio (0,1 M)</td><td></td><td></td><td>Receptor de protones: 0,2 M Na2HPO4, donante de protones: 0,2 M NaH2PO4, relación donante de protones / receptor de protones: 1,364 ( para un pH 7)</td></tr><tr>Solución <td></td><td></td> de <td>azul de anilina</td><td>0,1% (p/v) azul de anilina, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glicerol. Esta solución se puede utilizar para teñir calosa y celulosa de muchas etapas de desarrollo (por ejemplo, deposición de calosa en teradas macho y hembra, tapones de calosa en tubos polínicos). Excitación en el UV y emisión máxima alrededor de 455. También se puede excitar a 514 nm con emisión en rojo para la tinción del contenido celular.</td></tr></tbody></table>

whole-mount y coloración de silicuas y órganos flor de arabidopsis

Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques

Debido a sus formidables herramientas para los estudios genéticos moleculares, thaliana de Arabidopsis es una de las especies más destacadas del modelo en biología de plantas y, especialmente, en la biología reproductiva de plantas. Sin embargo, planta anatómica, morfológica y análisis ultraestructurales implican tradicionalmente lentos incrustar y seccionamiento procedimientos para campo brillante, análisis y microscopia electrónica. Recientes avances en la microscopía de fluorescencia confocal 3D asistido por ordenador microscópicos análisis de estado de la técnica y el refinamiento continuo de técnicas moleculares para ser utilizado en muestras mínimamente procesadas, todo Monte, ha llevado a una mayor demanda de desarrollo de técnicas de procesamiento de muestra eficiente y mínimo. En este protocolo, describen técnicas para disecar correctamente flores de Arabidopsis y silicuas, claro técnicas básicas y algunos procedimientos de tinción para montaje todo observaciones de estructuras reproductivas.

Arabidopsis pertenece a la familia Brassicacea, teniendo las inflorescencias con flores bisexuales dispuestas en un corimbo (figura 1). Cada flor tiene 4 sépalos, cuatro pétalos, seis estambres (cuatro largos y dos cortos) y un Gineceo sincárpico de dos congénitamente carpelos (Figura 1F-H) dispuestos en cuatro verticilos concéntricos25,26. A...

En este protocolo, describimos las técnicas para la adecuada disección de flores de Arabidopsis y silicuas, algunas técnicas de compensación básica y seleccionado procedimientos de observaciones del conjunto de montaje de estructuras reproductivas de tinción.

Whole-mount y coloración de silicuas y órganos flor de Arabidopsis

Due to its formidable tools for molecular genetic studies, Arabidopsis thaliana is one of the most prominent model species in plant biology and, ...

Este protocolo describe cómo diseccionar correctamente los botones florales, las flores y las silicuas jóvenes. Y el posterior desbroce de montaje completo para diversas técnicas de tinción y observación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la producción de plantas sexuales.Por ejemplo, un análisis de mutantes constantes o cualquier fallo inducido por el entorno y la experimentación en el desarrollo y la función de las flores. La principal ventaja de esta técnica es que permite un cribado fácil y rápido de muchas etapas de desarrollo simultáneamente. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de disección de órganos florales son difíciles de aprender porque requieren conocimientos previos de la anatomía de las flores y habilidades de disección.Para empezar, utiliza unas tijeras pequeñas para quitar las flores de las plantas sincronizadas. Y colocarlos inmediatamente en tubos de microcentrífuga individuales, que contienen un fijador adecuado. A continuación, retire el fijador y agregue suficiente 70% de etanol para cubrir completamente las muestras.Vuelva a colocar las muestras a cuatro grados centígrados durante al menos 24 horas. A continuación, llene un vaso de relojero con etanol al 70% recién hecho y colóquelo en una pequeña placa de Petri como soporte. A continuación, coloque la inflorescencia en el vaso del relojero y asegúrese de que esté totalmente cubierta por el etanol.Con unas pinzas y una jeringa equipada con una aguja, diseccione la flor bajo el microscopio estereoscópico desgarrando los sépalos, los pétalos y el estambre. A continuación, coloque el vaso del relojero a un lado y utilice un portaobjetos de cristal para la disección final. Mueva la muestra para deslizarla y agregue 10 microlitros de etanol al 70% recién hecho.Haz cortes a cada lado del carpiano, girándolo según sea necesario. A continuación, retire suavemente las válvulas para exponer los óvulos. Haga una pequeña incisión afilada para separar la mitad del tejido transmisor del receptáculo y use pinzas y una aguja para separar las dos mitades.Eliminar el estilo del estigma y el pedúnculo con cortes afilados. Con las pinzas y la aguja, voltee suavemente y coloque los óvulos aún adheridos para obtener dos filas paralelas. Use un pedazo pequeño de papel secante para eliminar el etanol de la muestra en el portaobjetos de vidrio.Luego agregue 20 microlitros de solución limpiadora al portaobjetos. Usando un par de jeringas con agujas hipodérmicas, coloque las muestras y elimine las burbujas de aire restantes. A continuación, coloque suavemente un cubreobjetos en el portaobjetos y espere hasta que la solución de aclarado llene el espacio entre el cubreobjetos y la muestra.Coloque la corredera en un soporte de corredera y déjela debajo de la campana extractora. Así que vamos a ver los botones florales recién cosechados que están a punto de abrirse con anteras no dehiscentes. A continuación, prepare una placa de 96 pocillos con suficiente solución Alexander para sumergir completamente los botones florales.Retire los sépalos y pétalos para exponer las anteras y sumérjalos en la solución de Alexander. Deje que la placa se asiente debajo de la campana extractora durante una a tres horas. A continuación, sustituya la solución Alexander por la solución de cuatro y medio de Herr e incube la placa bajo la campana extractora durante la noche.Al día siguiente, use fórceps para mover con cuidado los brotes limpios a un nuevo portaobjetos. A continuación, diseccione los estambres y extraiga todos los demás tejidos de las muestras. A continuación, proceda con el aclarado a base de hidrato de cloral y el aclarado combinado con la solución de cuatro y medio de Herr.Primero mueva la flor del vidrio del relojero a la corredera y use un papel secante para eliminar el exceso de etanol. Agregue de cinco a 10 microlitros de solución DAPI. Con dos jeringas con agujas hipodérmicas, diseccione los estambres y extraiga todos los demás órganos florales.A continuación, libere los granos de polen en la solución DAPI. Retire todos los residuos del estambre del portaobjetos asegurándose de que solo queden los granos de polen en el portaobjetos. La eliminación de todos los restos de estambres del portaobjetos es el paso más crítico para la eliminación de la exina.Solo se deben dejar granos de polen entre el portaobjetos y el cubreobjetos. A continuación, coloque un cubreobjetos en el portaobjetos del cojinete de la muestra y añada la cantidad mínima de solución DAPI necesaria para llenar el espacio entre el portaobjetos y el portaobjetos. Coloque un dedo índice suavemente sobre el cubreobjetos y haga un movimiento rápido y corto de deslizamiento.Coloque el portaobjetos en una caja humana en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante al menos 15 minutos. A continuación, observe el portaobjetos bajo fluorescencia de campo amplio o microscopía confocal dentro de las 24 horas. Mueva la muestra diseccionada del vidrio del relojero a una placa de vidrio con cavidades llenas de SDS al 1% y una solución de hidróxido de sodio al 0,2.Incubar durante la noche a temperatura ambiente. La solución de hidróxido de sodio SDS eliminará rápidamente las muestras, haciéndolas parecer transparentes en unos pocos minutos. Enjuague cuidadosamente la muestra con agua y colóquela en un portaobjetos limpio.Luego agregue de 20 a 40 microlitros de solución de tinción al portaobjetos. Dependiendo del órgano floral a analizar y de las habilidades del investigador, este tratamiento de DS se puede llevar a cabo antes, para los investigadores experimentados, o después de la etapa de disección para los investigadores menos experimentados. A continuación, coloque un cubreobjetos en la corredera teniendo cuidado de no aplastar la preparación.A continuación, coloque todos los portaobjetos preparados en una caja humana cubierta con papel de aluminio e incube a cuatro grados centígrados durante una hora. Finalmente, observe el espécimen bajo fluorescencia de campo amplio o microscopía confocal. Después del procedimiento de disección, descrito en el protocolo, se eliminan los tejidos innecesarios que podrían dificultar las observaciones y se obtienen imágenes más detalladas.Dependiendo del objetivo, la tinción con hidrato de cloral se puede utilizar para caracterizar el desarrollo temprano de la flor a nivel de todo el botón floral, la meiosis y la génesis de la micro-gomedalla en la antera, el desarrollo temprano del óvulo y la especificación de la célula madre de la megaspora, el desarrollo femenino go-medicificado o incluso la invasión del tubo polínico de la rejilla central. La combinación de la tinción de Alexander y el aclarado de cuatro y medio de Herr permite evaluar el aborto polínico dentro de un lóculo dado o de una antera en su conjunto. Mientras que los granos de polen viables muestran un citoplasma rojo, los abortados muestran un citoplasma vacío y, finalmente, tienen una forma irregular y están totalmente aplastados.La eliminación de la exina da como resultado una mayor intensidad de tinción de los núcleos y mayores detalles de la organización de la cromatina. El uso de una limpieza de hidróxido de sodio SDS antes de la tinción hizo que la inflorescencia fuera transparente. Y resultó en una mayor tinción de calosa dentro de los tejidos florales.Reveló acumulaciones de callosa generalmente difíciles de ver. Como la capa de calosa que separa la célula generativa de la célula vegetativa. Incluso cuando los granos de polen todavía estaban contenidos dentro de la antera.Una vez dominadas, estas técnicas se pueden realizar en menos de 48 horas, si se realizan correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que los resultados dependen en gran medida de una buena preparación de la muestra, como el uso del fijador adecuado, la realización de la disección correctamente y el aislamiento del tejido de interés en el portaobjetos.

whole-mount-clearing-staining-arabidopsis-flower-organs

Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

La composición de la pared celular de la planta varía según el tipo de tejido y puede incluir lignina, celulosa, hemicelulosas y pectina. Se han desarrollado varias técnicas de tinción para visualizar las diferencias a nivel de tipo de célula. Este artículo es una recopilación de las técnicas de tinción de pared celular más utilizadas.

La tinción histoquímica de<em&gt; Arabidopsis thaliana</em&gt; Celda Secundaria Elements Pared

Ofrecemos aquí un protocolo eficiente y confiable para la inmunotinción, hibridación in situ fluorescente, la tinción de ADN seguido por cuantitativos, imágenes de alta resolución en óvulos de Arabidopsis thaliana todo el montaje. Este método fue utilizado con éxito para analizar modificaciones de la cromatina nuclear y de la arquitectura.

Un método eficaz para Cuantitativo, Análisis de celda única de la cromatina modificación y Arquitectura Nuclear en Todo el montaje en Óvulos<em&gt; Arabidopsis</em

La celulosa cristalina es un componente importante de la pared celular de la planta. Sin embargo, su cuantificación a una resolución celular es técnicamente desafiante.  Aquí, reportamos el uso de la tecnología de luz polarizada y secciones transversales de raíces para obtener información de la composición de la pared celular a una resolución espacio-temporal.

Alta resolución Cuantificación de celulosa cristalina acumulación en<em&gt; Arabidopsis</em&gt; Las raíces para monitorear la célula específica de tejido de pared Modificaciones

imagen confocal en vivo ofrece biólogos con una poderosa herramienta para estudiar el desarrollo. A continuación, presentamos un protocolo detallado para la imagen confocal en vivo de flores en desarrollo de Arabidopsis.

Vivir Imagen confocal de desarrollo de Arabidopsis Flores

Este protocolo describe un método para la observación de embriogénesis en Arabidopsis vía separación de óvulo, seguido por la inspección de la formación de patrones de embrión bajo un microscopio.

Un método para la caracterización de embriogénesis en Arabidopsis

Divulgamos un método sencillo y versátil para realizar fluorescente live-proyección de imagen de hojas de Arabidopsis thaliana durante un período prolongado de tiempo. Utilizamos una planta Arabidopsis transgénica expresando un gen reportero fluorescente bajo el control de un promotor de inmunidad como un ejemplo para obtener comprensión espaciotemporal de inmunorespuestas de la planta.

Un método versátil para el montaje de Arabidopsis las hojas para la proyección de imagen de Time-lapse Intravital

Aquí, describimos la generación y aplicación de un conjunto de transgénicas de Arabidopsis thaliana líneas de expresión inducible, tejidos específicos que en los tres principales meristemos, el meristemo apical de brote, el meristemo apical de raíz y el cambium.

Inducibles, expresión de específicas del tipo celular en Arabidopsis thaliana mediada a través de LhGR Trans-activación

Aquí, se describe un método para hacer que los tejidos vegetales sean transparentes mientras se mantiene la estabilidad de las proteínas fluorescentes. Esta técnica facilita la obtención de imágenes profundas de tejidos vegetales despejados sin seccionamiento físico.

Limpieza óptica de tejidos vegetales para imágenes de fluorescencia

El presente protocolo describe un método optimizado para la observación histológica de agallas inducidas por Plasmodiophora brassicae. Las secciones de vibratomo de los hipocótilos se eliminan antes de las imágenes de fluorescencia para estudiar la participación de factores de transcripción y fitohormonas durante la progresión de la enfermedad. Este protocolo supera las limitaciones de incrustación de resina, permitiendo la visualización en planta de proteínas fluorescentes.

Combinación de microscopía de limpieza y fluorescencia para visualizar cambios en la expresión génica y respuestas fisiológicas a Plasmodiophora brassicae

Aquí, describimos una mejora del método semi-in vitro (SIV) para observar la guía y recepción del tubo polínico en Arabidopsis thaliana, lo que aumenta la receptividad de los óvulos. El método SIV cum septum de alto rendimiento puede combinarse con líneas marcadoras de gametofitos y biosensores codificados genéticamente para monitorear el proceso dinámico de fertilización.

Imágenes en vivo de la recepción del tubo polínico de Arabidopsis y la doble fertilización utilizando el método semi-in vitro cum septum

Aquí se describe un método mejorado para medir los perfiles de hidratación del polen en Arabidopsis thaliana . El nuevo método ofrece una resolución más alta, no es invasivo y es altamente reproducible. El protocolo representa una nueva herramienta para una disección más fina de los procesos que regulan las primeras etapas de la polinización.

Un bioensayo de hidratación de polen in vivo de grano único de alta resolución para Arabidopsis thaliana

Aprende técnicas de disección de flores y silicuas de Arabidopsis con tinción de montaje total para estudiar el desarrollo reproductivo. Este método permite analizar mutantes y factores ambientales en biología vegetal.

Whole-mount y coloración de silicuas y órganos flor de Arabidopsis

Explorar más videos