Un método conveniente para la extracción y análisis con cromatografía líquida de alta presión de los neurotransmisores catecolaminas y sus metabolitos

El objetivo general de este procedimiento es determinar tres neurotransmisores monoamínicos y dos de sus metabolitos en la orina del lactante simultáneamente mediante una cómoda extracción en fase sólida acoplada a una cromatografía líquida de alta presión con detección electroquímica. Este método puede predecir y determinar compuestos objetivo inestables en una muestra completa con una operación fácil en poco tiempo. Sus ejemplos se pueden prelimpiar fácilmente mediante un quórum de cara sólida empaquetado en fibra estrecha, y los analitos de la muestra se pueden enriquecer, disolver y detectar fácilmente en un sistema de detección electroquímica.

La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando nos dimos cuenta de que la extracción y el análisis de los neurotransmisores catecolaminas en fluidos biológicos son fundamentales para evaluar la función resistente y las enfermedades relacionadas. Las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque se debe evitar la exposición a la luz y el tiempo previo al tratamiento debe ser lo más corto posible. Para demostrar el procedimiento, tenemos a Lanlan Wei y Qing Han, dos estudiantes de doctorado de nuestro laboratorio.

Para comenzar, prepare dos miligramos por mililitro de solución madre de solución de DPBA disolviendo dos miligramos del compuesto en un mililitro de agua destilada. Guarde la solución en la oscuridad a cuatro grados centígrados. Al preparar los diluyentes de analito, tenga en cuenta que la estructura química y las propiedades de las catecolaminas son inestables y, como se descomponen fácilmente, el proceso de preparación de los diluyentes debe ser muy rápido y se debe evitar la exposición a la luz solar fina.

Pesa 1,0 miligramos de norepinefrina, epinefrina, dopamina, MHPG, DOPAC y DHBA estándar interno en tubos de microcentrífuga separados de 1,5 mililitros. Agregue 1.0 mililitros de agua destilada para disolver cada uno de los compuestos, excepto la epinefrina, que debe disolverse en una solución de ácido clorhídrico de 0.01 moles por litro. Oscilar los patrones preparados en la oscuridad a alta velocidad hasta que los analitos se disuelvan por completo.

Estas son las reservas primarias y pueden almacenarse a menos 20 grados centígrados durante varias semanas. Para preparar las existencias de analitos secundarios de norepinefrina, epinefrina, dopamina, DOPAC y MHPG, transfiera cinco microlitros de cada reserva de analito primario a 4.975 microlitros de agua destilada en tubos de centrífuga separados de cinco mililitros. Prepare estas soluciones frescas diariamente y almacene las soluciones en la oscuridad a cuatro grados centígrados hasta su uso.

En el caso del DHBA, transfiera cinco microlitros de material primario a 4.995 microlitros de agua destilada en un tubo de centrífuga de cinco mililitros y guárdelo en la oscuridad por separado a cuatro grados centígrados. Realice diluciones adicionales con el material de analito secundario para crear una curva estándar. Guarde las soluciones en la oscuridad a cuatro grados centígrados y prepárelas frescas todos los días.

A continuación, pruebe el voltaje óptimo del detector ECD, utilizando la culata estándar con la concentración adecuada. Varíe el voltaje para encontrar un valor en el que los analitos tengan la mejor apariencia de pico. Para preparar 10 mililitros de solvente eluyente, use 5,5 mililitros de agua destilada, luego agregue 1,5 mililitros de acetonitrilo y tres mililitros de ácido fosfórico, gota a gota, en el agua.

Para preparar la fase móvil, mida los componentes enumerados en el protocolo de texto en una botella limpia de un litro. Agregue 40 mililitros de acetonitrilo y agua destilada a 1,000 mililitros. Agite y vibre ultrasónicamente durante 15 minutos hasta que la materia de la solución se disuelva por completo.

Usando un medidor de pH con un electrodo de vidrio, ajuste el valor de pH de la fase móvil a 4.21 con una solución saturada de hidróxido de sodio. Filtre la fase móvil con una membrana microporosa de fluoruro de polivinilideno de 0,45 micras y un dispositivo de succión al vacío para eliminar las impurezas. Utilice la vibración ultrasónica durante 15 minutos para desgasificar la fase móvil cada vez antes de su uso.

A continuación, vórtice y centrifugar las muestras urinarias a 1.510 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente para eliminar la mayor parte de las interferencias de partículas. Reúna los sobrenadantes y deseche el sedimento para realizar más experimentos. Para extraer los analitos de manera efectiva, proceda a la extracción en fase sólida de fibra empaquetada, o pretratamiento PFSPE, inmediatamente después de la centrifugación.

Para activar las nanofibras, presione 100 microlitros de metanol y 100 microlitros de agua secuencialmente a través de la columna PFSPE usando una jeringa de cinco mililitros de manera lenta y gota. La muestra de orina debe mezclarse con una solución de DPPA para mejorar su hidrofobicidad y ayudar a que las catecolaminas y metabolitos se absorban en las fibras. La solución DHBA también debe agregarse como estándar interno.

Mezcle 100 microlitros de muestra de orina con 100 microlitros de dos miligramos por mililitro de solución de DPBA y 30 microlitros de 100 nanogramos por mililitro de solución estándar interna de DHBA en un tubo Eppendorf de 0,5 mililitros. A continuación, presione la solución de muestra mezclada a través de la columna PFSPE con una jeringa de plástico de tipo gas de cinco mililitros utilizando la fuerza de la presión del aire. Lixiviar la columna tres veces usando una jeringa de plástico de tipo gas de cinco mililitros para cargar 100 microlitros de la solución DPBA en la columna SPE y empujar la solución lentamente a través del cartucho con presión de aire.

Este paso de enjuague es necesario porque la solución de DPBA puede eliminar las impurezas mientras se retienen los analitos, mejorando así la sensibilidad y la selectividad de los analitos. A continuación, cargue 50 microlitros del eluyente en la columna PFSPE y empújelo a través de la columna, recogiendo el eluido con un tubo Eppendorf de 0,5 mililitros. Encienda el desgasificador de HPLC para desgasificar el aire del sistema.

Antes de los análisis de muestras, el sistema debe funcionar durante más de 0,5 horas con la fase móvil para equilibrar y reducir el ruido de referencia. Tome una muestra de 20 microlitros del eluido utilizando un muestreador automático y, a continuación, inyéctelo en el sistema ECD de HPLC. Cuando se completen las carreras, apague la celda del detector mediante la interfaz del detector.

No apague la celda con el interruptor en la parte posterior del detector, ya que esto podría dañar el instrumento. Cambie manualmente la composición de la fase móvil a 10% de metanol y 90% de agua. Después de funcionar durante al menos 30 minutos, cambie manualmente la fase móvil a metanol de grado HPLC.

Haga funcionar el sistema durante unos 15 minutos para protegerlo en metanol. Si no se ejecuta este paso siguiendo el tiempo de funcionamiento recomendado, se podrían dañar la columna y el detector. Apague el flujo y, a continuación, apague el desgasificador.

Proceda al análisis de catecolaminas como se describe en el protocolo de texto. El cromatograma de una muestra de agua enriquecida con los objetivos y el patrón interno se muestra sin extracción. Bajo la condición de HPLC en el protocolo, los cinco picos objetivo del método PFSPE están bien separados y son significativamente más altos que los extraídos por un cartucho comercial de ácido fenilborónico.

Además, el pico de DOPAC no apareció en el resultado de la extracción del cartucho de PBA, lo que indica que la columna de PBA no era capaz de extraer DOPAC. Cuando se extrajo la muestra de orina, el método PFSPE no solo pudo extraer los objetivos con una buena identificación de picos, sino que también pudo eliminar la mayor parte de la interferencia en la orina. Las curvas de calibración se construyeron para cada compuesto trazando la relación del área de pico, mostrando una buena linealidad con baja concentración.

Para la validación con muestras de orina reales, se analizaron las muestras de orina de 28 lactantes de alto riesgo y 22 lactantes sanos. Si bien algunas catecolaminas no fueron significativamente diferentes entre los grupos de alto riesgo y los sanos, los lactantes de alto riesgo tenían cantidades más altas del metabolito MHPG que el grupo de control. Por lo tanto, el nivel de MHPG urinario puede ser un marcador potencial para la identificación temprana de lactantes de alto riesgo.

Una vez dominada, esta técnica se puede hacer en minutos. Al intentar el procedimiento, es importante recordar preparar las cenizas frescas, operar con rapidez y evitar la exposición a la luz solar directa. La adición de solución de ácido difenilborato en las etapas de absorción y enjuague también es crítica.

Después de este procedimiento, se mide la falta de terminación de catecolaminas y metabolitos en plasma o líquido cefalorraquídeo. Alsliver se puede realizar con el fin de determinar la universalidad de este protocolo en las pruebas de los otros fluidos biológicos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores estudiaran la relación entre los déficits del neurodesarrollo y el nivel de catecolaminas urinarias en muestras de niños.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar el método de extracción en fase sólida con figuras nair y un dispositivo simple, el DPBA de residuos corporativos de fibulones aéreos PCE PS puede ayudar a limpiar los neurotransmisores de catecolaminas en las muestras de orina. Esta técnica se extiende hacia el diagnóstico precoz de la cassis con riesgo de daño cerebral en lactantes. Debido a que el análisis comparativo reveló diferencias anormales en la MHPG unaria de los niños con autismo, lo que indica que los metabolitos de las catecolaminas podrían ser importantes marcadores candidatos.