Análisis de la inmunofluorescencia de Whole-mount cuantitativa de las poblaciones progenitoras cardiacas en embriones de ratón

El objetivo general de este método es evaluar cuantitativamente la localización y distribución de las células progenitoras cardíacas durante la organogénesis cardíaca. Este método puede ayudar a responder respuestas clave en el campo del desarrollo cardíaco al permitirnos observar la localización de las poblaciones de progenitores cardíacos durante el desarrollo embrionario normal. Las principales ventajas de esta técnica son que las imágenes volumétricas pueden proporcionar información cuantitativa sobre la dinámica a nivel de tejido y que la línea de análisis puede automatizarse para mejorar la reproducibilidad.

Aunque este método proporciona información sobre la organogénesis cardíaca temprana, también se puede aplicar al estudio general de la embriogénesis temprana o a la morfogénesis de otros órganos de interés. En la mañana del octavo día embrionario, desinfecte el abdomen de la rata embarazada con etanol al 70% y haga una incisión abdominal a través de la piel y la pared del cuerpo. Comenzando por encima de un oviducto, diseccione cuidadosamente la grasa a lo largo del costado del útero hasta el cuello uterino.

Haga una incisión a través del cuello uterino y continúe hasta el extremo superior del otro corte del oviducto para liberar todo el útero. Lave el exceso de sangre del útero en un plato de 10 centímetros que contenga PBS fresco y corte el mesometrio entre cada deciduom. Transfiera los embriones a un plato de seis centímetros que contenga PBS fresco bajo un microscopio de disección y use pinzas finas número cinco para extraer el tejido uterino del tejido decidual.

A continuación, corte con cuidado la punta de la mitad embrionaria del decimio para revelar los embriones, pellizcando el decimio para empujar y extraer con cuidado el primer embrión. Diseccionar la mayor cantidad posible de tejido embrionario adicional sin dañar la morfología del animal y utilizar una pipeta de transferencia para colocar el embrión en un tubo de 1,5 mililitros que contenga PBS fresco en hielo. Cuando se hayan cosechado todos los embriones, aspire el PBS de cada tubo y enjuague los embriones con PBS fresco.

Después de aspirar completamente el PBS de cada tubo, fije los embriones en paraformaldehído al 4% durante una hora a temperatura ambiente, seguido de tres lavados con PBS fresco, luego almacene los embriones a cuatro grados centígrados. Comience reemplazando el PBS con un mililitro de tampón de bloqueo para una incubación de cuatro horas a temperatura ambiente. Al final de la incubación, reemplace el tampón de bloqueo con la mezcla de anticuerpos primarios adecuada y un tampón de bloqueo diluido para una incubación nocturna a cuatro grados centígrados.

A la mañana siguiente, aspirar el exceso de anticuerpo y lavar los embriones tres veces durante una hora por lavado en 0,1%Triton en PBS. Después del tercer lavado, agregue la mezcla de anticuerpos secundarios apropiada a los embriones para una incubación de tres horas a temperatura ambiente, seguida de tres lavados como se acaba de demostrar. A continuación, contratiñe los embriones con DAPI en PBS durante 10 minutos, seguidos de dos lavados de cinco minutos, luego suspenda lentamente los embriones en un medio de montaje anti-decoloración permitiendo que los embriones se equilibren durante al menos una hora con movimientos suaves periódicos para ayudar a que las muestras caigan en la solución.

Antes de montar los embriones, haga dos pilas paralelas de cinco a seis capas de cinta adhesiva doble a una distancia de 15 a 20 milímetros en un portaobjetos de microscopio por embrión y coloque una gota de 15 microlitros de medio antidecoloración en cada portaobjetos entre las pilas de cintas. Transfiera cuidadosamente un embrión en cada gota y use un microscopio de disección y pinzas finas para colocar los embriones con sus lados anteriores hacia afuera del portaobjetos y con su eje corporal alineado con el eje largo de los portaobjetos. Para colocar los cubreobjetos, primero apoye un lado del vaso en una pila de cinta adhesiva doble y use pinzas para bajar suavemente el cubreobjetos hasta que entre en contacto con la otra pila de cintas.

Es particularmente importante colocar y montar cuidadosamente los embriones. Los embriones que no se colocan correctamente serán mucho más difíciles de visualizar y pueden requerir un procesamiento adicional para obtener buenos datos cuantificables. Utilice una pipeta para añadir medio antidecoloración adicional entre el portaobjetos y el cubreobjetos para evitar que la muestra se seque durante la obtención de imágenes y seleccione el objetivo de aumento más alto disponible que permita capturar toda la región de la media luna cardíaca en un campo de visión.

A continuación, configure los parámetros de imagen utilizando las mejores prácticas de imagen estándar y utilice las tasas de muestreo de Nyquist para determinar las dimensiones de vóxel XYZ de cada embrión. Para analizar las imágenes de embriones, cargue los conjuntos de datos de imágenes sin procesar en el software de análisis de imágenes adecuado y abra el primer archivo en la vista de sobrepaso. Los datos se cargarán en una vista 3D en el modo de proyección de máxima intensidad.

Abra la ventana de ajuste de la pantalla y seleccione solo el canal de referencia. Ajuste el umbral de la imagen según sea necesario. Si la relación señal/ruido es demasiado baja para la segmentación, ajuste la gamma.

Seguir las mejores prácticas durante la adquisición de imágenes es fundamental para obtener datos adecuados y dependerá de la configuración de microscopía específica utilizada. Si se necesitan ajustes en la gamma, estas imágenes no deben utilizarse para comparar intensidades de fluorescencia. Utilice el cuadro de diálogo del algoritmo de superficie para crear una nueva superficie para el canal de referencia y marque la casilla de interés solo origen de segmento.

Ajuste la región del cuadro delimitador para que contenga la región de interés delineada por la mancha de referencia y seleccione el canal de referencia en el menú desplegable del canal de origen. Establezca el suavizado a la mitad del tamaño del vóxel Z y utilice los controles deslizantes de umbral para ajustar el límite inferior a su intensidad absoluta para garantizar que la superficie no se extienda más allá de la señal del canal. Filtre los objetos por vóxel, número o volumen, rechazando cualquier objeto de fondo que el algoritmo pueda haber generado y finalice el algoritmo.

A continuación, seleccione la superficie recién creada y elija la función de conjunto de máscaras en la ventana de edición. Seleccione el canal experimental de interés teniendo cuidado de que la casilla de verificación Duplicar canal antes de aplicar la máscara esté seleccionada y seleccione el canal de máscara solo en la ventana de ajuste de la pantalla. A continuación, cree una nueva superficie como se acaba de demostrar.

Para obtener los datos volumétricos con cada superficie seleccionada, abra la subpestaña de detalles en la pestaña de estadísticas y seleccione los valores promedio en el menú desplegable. El volumen total de la superficie se encontrará en la columna de suma de la tabla generada. Aquí, se muestra un embrión embrionario de ratón de 8,25 días con células progenitoras cardiovasculares ventriculares GFP positivas marcadas con un anticuerpo anti-media luna cardíaca como se acaba de demostrar.

Después de seleccionar el canal de referencia para el tejido teñido, la intensidad y la gamma se ajustan antes de comenzar el algoritmo de creación de superficies. Se selecciona la región de interés y se elige el nivel de detalle de la superficie. La superficie inicial se umbraliza para incluir todas las señales verdaderas de la superficie.

A continuación, se realiza el filtrado para eliminar pequeños fragmentos de fondo y obtener una superficie de referencia final. Al seleccionar la superficie de referencia, el canal de comparación se puede duplicar y enmascarar. La intensidad y la gamma de este canal se ajustan antes de generar una segunda superficie a través de la misma secuencia de pasos.

A continuación, el volumen total de cada superficie se calcula automáticamente y se puede comparar tanto cuantitativa como visualmente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la calidad de los embriones disecados, la eficiencia de los anticuerpos, la orientación del montaje y la configuración de las imágenes afectan la calidad de los datos finales. Además de este proceso de análisis cuantitativo, se pueden realizar otros métodos, como la deconvolución, para obtener datos cualitativos adicionales.

Después de su desarrollo, esta tecnología allanó el camino para que los investigadores en desarrollo cardíaco exploraran la dinámica de nuevas poblaciones de progenitores cardíacos durante la embriogénesis temprana.