Name: Medición de Influenza neutralizando las respuestas del anticuerpo al virus a (H3N2) en suero humano por microneutralización ensayos utilizando células de MDCK-SIAT1 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 9 s
Description: Aprende a medir anticuerpos neutralizantes contra el virus H3N2 en suero humano mediante ensayos de microneutralización con células MDCK-SIAT1. Este método evalúa la inmunidad postvacunal.

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Agradecemos a Dr. Xiuhua Lu, Dr. Feng Liu y Sra. Ashley Burroughs de la división de Influenza de los CDC para su revisión crítica y la asistencia en la preparación de este manuscrito. Agradecemos al Dr. Adrian Reber de la división de Influenza de los CDC para su asistencia en la preparación de los gráficos de la figura 3. Por último, agradecemos a Dr. M. Matrosovich, Marburg, Alemania para proporcionar las células MDCK-SIAT1.

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</ol>

Los autores no divulgan ningún conflicto de interés. Los resultados y conclusiones en esta publicación son las de los autores y no representan necesariamente las opiniones de los centros para el Control y prevención y la Agencia de financiación.

El ensayo de MN es uno de los principales análisis utilizados para serología influenza para detectar respuestas de anticuerpos después de la infección por influenza o vacunación. Títulos generados a partir de ensayos de MN se utilizan a menudo como el resultado primario de muchos estudios de seroepidemiología de la influenza. Análisis de MN son también ampliamente utilizados para sero diagnóstico y la evaluación de la inmunogenicidad de la vacuna. Se han realizado estudios internacionales inter-laboratorio para comparar ...

Virus de la influenza siguen causan morbilidad y mortalidad en la población cada año. HA es la principal glicoproteína superficial del virus de la gripe. Anticuerpos neutralizantes contra HA son el principal mecanismo inmunológico que se correlaciona con la protección de la gripe infección1,2. Ensayos de hemoaglutinación inhibición (HI) y ensayos de MN son dos métodos ampliamente utilizados para medir las respuestas del anticuerpo en el suero humano después de la infección o la vacunación de la gripe3. El ensayo HI mide inhibición de anticuerpos de la hemoaglutinación virus de glóbulos rojos y es considerado un ensayo de suplente. A diferencia de los HI, el ensayo de MN puede medir directamente los niveles de anticuerpos en sueros humanos que neutralizan la infección por influenza en cultivos celulares. Células MDCK se utilizan a menudo en el aislamiento del virus influenza y ensayos de MN4.
Virus de la gripe sufren constantemente deriva antigénica y cambio, adquisición de mutaciones en proteínas HA que pueden alterar la especificidad de Unión receptor de virus. Desde 2014, nuevos clústeres de H3N2 emergieron y continuaron circulando hasta la temporada actual. La mayoría de estos virus pertenece al grupo genético 3C.2a y 3C.3a basado en el análisis filogenético de las proteínas HA. Muchos de los virus circulantes de la 3C.2a habían reducido la capacidad de hemagglutinate de glóbulos rojos y por lo tanto no pueden ser caracterizados por ensayos de HI5. Ensayos de neutralización deben utilizarse para medir las respuestas de anticuerpos para estos virus que no hemagglutinate6. Además, los estudios han demostrado que estos virus a (H3N2) contemporáneos han alterado propiedades de enlace del receptor en comparación con anteriores a (H3N2) virus y tienden a acumular cultura adaptada mutaciones y polimorfismo cuando pasados en célula en vitro las culturas7,8,9. En comparación con las células MDCK convencionales, MDCK-SIAT1 es una línea de células desarrollada por Matrosovich et al. a través de la transfección estable de células MDCK con cDNA humano α2, 6-sialtransferase (SIAT1). Esta línea celular expresa cantidades crecientes de α2, moléculas de galactosa 6-siálicos y disminución de α2, moléculas de ácido 3-siálicos que el padre de las células MDCK10. Las células de MDCK-SIAT1 han demostrado para mejorar el nivel de aislamiento de virus a (H3N2) en comparación con las células MDCK11. Recientemente, Lin et al. informó que para recién emergidas 3C.2a y 3C.3a humana a (H3N2) virus de la influenza, más fieles réplicas de virus e infectividad de virus mejor fueron alcanzados cuando los virus eran cultivadas en líneas de células MDCK-SIAT1 en comparación con las células MDCK7. Así, las células de MDCK-SIAT1 son los más adecuadas en MN ensayos para caracterizar las respuestas del anticuerpo a los recientes grupos de virus a (H3N2).
Aquí se describe un ensayo de MN con células MDCK-SIAT1 para medir respuestas del anticuerpo a contemporáneo 3C.2a y 3C.3a a (H3N2) virus en suero humano. Virus cultivados en huevos o en las células pueden usarse en este ensayo. Suero inactivado por calor que contiene anticuerpos neutralizantes es primero en serie diluido, luego se incubó con 100 TCID50/bien de influenza a (H3N2) para permitir que los anticuerpos en los sueros para enlazar con el virus. Células MDCK-SIAT1 se añade a la mezcla de anticuerpo del virus y se incuba durante 18-20 h a 37 ° C, 5% CO2 para permitir que el virus a (H3N2) infectar las células MDCK-SIAT1 y replicar. Después de la incubación durante la noche, las placas son fijos y la cantidad de virus en cada pozo es cuantificada por un ELISA utilizando anticuerpos monoclonales de anti-influenza A NP. La detección de NP indica la presencia de infección por el virus y la ausencia de anticuerpos neutralizantes. Título de anticuerpos de neutralización se define como el recíproco de la dilución de suero más alta que proporciona ≥ 50% de inhibición de la infectividad del virus.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Medio Eagle modificado (DMEM) con alta glucosa Life</td><td>Science</td><td>11965</td><td>Un componente crítico de cultivo de células estériles, propagación de virus y medios diluyentes de virus</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Hyclone</td><td>SH30070.03</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA) Fracción V, libre de protasa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3117332001</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Ciencias de la vida</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio</td><td>Ciencias de la vida</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Genética G-418 sal de disulfato &nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1720-5G&nbsp; &nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Life Science</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina</td><td>Life Science</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>VWR</td><td>67-64-1</td><td>Utilizado a una concentración del 80%</td></tr><tr><td>Tampón de fosfato-citrato con perborato de sodio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLBF2806V</td><td></td></tr><tr><td>O-fenilendiamina Dihidrocloruro tableta</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>SLBQ1086V 1 tableta por 100 ml de agua de grado de cultivo celular</td></tr><tr><td>Ácido sulfúrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A510-P500</td><td>Usado Concentración final de 0,5 M</td></tr><tr><td>Etanol, desnaturalizado, 4L</td><td>VWR</td><td>EM-AX0422-3</td><td>Utilizado a una concentración del 70%</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Ciencias de la Vida</td><td></td><td></td>1748048</tr><tr><td>RDE II "Seiken"</td><td>Denka Seiken</td><td>370013</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Anti-NP ratón monoclonal Ab</td><td>Millipore pool</td><td>MAB 8257 MAB 8258</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ratón IgG HRP&nbsp;</td><td>KPL</td><td>074-1802</td><td></td></tr><tr><td>Placas de fondo plano de 96 pocillos</td><td>Thermo Scientific</td><td>3455</td><td></td></tr><tr><td>Lector de placas</td><td>Dispositivo molecular</td><td>Spectromax 384 plus</td><td></td></tr><tr><td>Matraz de cultivo celular 162 cm2/Vent Cap Corning</td><td>/VWR</td><td>3151</td><td></td></tr></tbody></table>

medición de influenza neutralizando las respuestas del anticuerpo al virus a (h3n2) en suero humano por microneutralización ensayos utilizando células de mdck-siat1

Measuring Influenza Neutralizing Antibody Responses to A(H3N2) Viruses in Human Sera by Microneutralization Assays Using MDCK-SIAT1 Cells

Anticuerpos neutralizantes contra la hemaglutinina (HA) del virus de la gripe se consideran el principal mecanismo inmunológico que se correlaciona con la protección de las infecciones gripales. Ensayos de microneutralización (MN) se utilizan a menudo para medir respuestas de anticuerpos neutralizantes en sueros humanos después de la vacunación contra la influenza o infección. Células de riñón canino Madine Darby (MDCK) son el sustrato de células utilizadas para los ensayos de MN. Sin embargo, circula la influenza a (H3N2) 3C.2a y 3C.3a han adquirido el virus alterado especificidad de unión del receptor. La línea de células MDCK-SIAT1 con fracciones mayor α-2,6 galactosa siálicos en la superficie ha demostrado para proporcionar la mayor infectividad y repeticiones más fieles que las células MDCK convencionales para estos virus a (H3N2) contemporáneos. Aquí, describimos un ensayo de MN con células MDCK-SIAT1 que ha sido optimizado para cuantificar los títulos de anticuerpos neutralizantes a estos virus (H3N2) contemporáneos. En este protocolo, suero inactivado por calor que contiene anticuerpos neutralizantes es primero en serie diluido, luego se incubó con 100 TCID50/de virus de la influenza a (H3N2) para permitir que los anticuerpos en los sueros para enlazar a los virus. Células MDCK-SIAT1 se añade a la mezcla de anticuerpo del virus y se incuba durante 18-20 h a 37 ° C, 5% CO2 para permitir a (H3N2) virus infectar las células MDCK-SIAT1. Después de la incubación durante la noche, se fijan las placas y la cantidad de virus en cada bien es cuantificada por un análisis enzima-ligado del inmunosorbente (ELISA) utilizando anti-influenza A anticuerpos monoclonales de nucleoproteína (NP). Título de anticuerpos de neutralización se define como el recíproco de la dilución de suero más alta que proporciona ≥50% de inhibición de la infectividad del virus.

Determinación de la infectividad de las cepas de virus es el primer paso en el ensayo de MN. La figura 2 ilustra el diseño de la placa para determinar el TCID50 de las cepas de virus. De las poblaciones de virus con infectividad desconocido, el virus puede titularse de múltiples diluciones previas, por ejemplo tanto 10-2 y 10-3, para capturar la mejor curva de valoración para calcular la capacidad infectiva del virus. La canti...

Anticuerpos neutralizantes de la gripe se correlacionan con la protección de las infecciones gripales. Ensayos de microneutralización medir anticuerpos neutralizantes en sueros humanos y se utilizan a menudo para serología humana de influenza. Se describe un ensayo de microneutralización con células MDCK-SIAT1 para medir títulos de anticuerpos neutralizantes a contemporáneos 3C.2a 3C.3a a (H3N2) virus y después de la vacunación contra la influenza o infección.

Medición de Influenza neutralizando las respuestas del anticuerpo al virus a (H3N2) en suero humano por microneutralización ensayos utilizando células de MDCK-SIAT1

Neutralizing antibodies against hemagglutinin (HA) of influenza viruses are considered the main immune mechanism that correlates with protection for ...

El objetivo general de este ensayo de microneutralización es medir las respuestas de anticuerpos neutralizantes a los virus de la influenza H3N2 contemporáneos en sueros humanos utilizando células MDCK-SIAT1. Este método se puede utilizar para responder preguntas clave para evaluar la inmunidad a la influenza. Por ejemplo, puede determinar si la vacunación contra la influenza induce suficientes respuestas de anticuerpos neutralizantes a los virus H3N2 en circulación para prevenir la infección.La principal ventaja de esta técnica es que utiliza células MDCK-SIAT1 y ensayos de microneutralización para detectar respuestas de anticuerpos a grupos antigénicos reiniciados de virus de la influenza H3N2. Las existencias de virus deben propagarse a títulos altamente infecciosos antes de su uso en ensayos de microneutralización. Comience este procedimiento con la propagación de los virus AH3N2 en las células MDCK-SIAT1, como se detalla en el protocolo de texto.El primer día, descongele un vial de virus a temperatura ambiente e inmediatamente coloque el virus en hielo. Para probar el virus en dos diluciones iniciales diferentes, primero agregue 100 microlitros de virus a 99 mililitros de dilu

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Inmunología e Infección

Este video muestra ensayos de microneutralización para medir anticuerpos neutralizantes utilizando células de riñón canino Madin-Darby que sobreexpresan ácido siálico ligado a α2,6 en sueros humanos. Este ensayo se utiliza a menudo para la serología humana de la...

Un ensayo de microneutralización para medir los títulos de anticuerpos neutralizantes en el suero humano

Este video muestra el ensayo de microneutralización basado en imágenes para analizar las relaciones antigénicas entre los virus de la influenza A y B. Proporciona una forma cuantitativa y visual de evaluar la eficacia de los anticuerpos u otros tratamientos en la prevención de la infección viral.

Análisis de la relación antigénica entre virus mediante un ensayo de microneutralización basado en imágenes

Este video muestra una técnica para generar variantes de escape de anticuerpos monoclonales neutralizantes contra el virus de la influenza. La suspensión del virus neutralizado por anticuerpos se inyecta en huevos de gallina embrionados para propagar variantes de escape de forma selectiva. Esto da como resultado una población de virus predominantemente de variantes de escape, confirmada a través de un ensayo de hemaglutinación.

Generación de variantes de escape del virus de la influenza contra anticuerpos neutralizantes

Este video muestra un ensayo que mide los títulos de anticuerpos inhibidores de la neuraminidasa (NA) de la influenza en una muestra de suero. Se añade una muestra de suero que contiene anticuerpos contra el NA a una placa de micropocillos recubierta de fetuina. Al agregar el virus, los anticuerpos evitan que el NA viral escinda la fetina y exponga su fracción de galactosa. A continuación, se añade una lectina conjugada con peroxidasa, que se une a la galactosa expuesta. El título de...

Un ensayo para medir los títulos de anticuerpos de inhibición de la neuraminidasa de la influenza

Este video muestra un ensayo de inmunofluorescencia diseñado para medir la neutralización del Citomegalovirus Humano (HCMV). Los anticuerpos específicos del virus se mezclan con el virus y se incuban con células de fibroblastos humanos. Los anticuerpos neutralizan el virus, haciéndolo incapaz de infectar las células huésped, mientras que los virus no neutralizados infectan las células. Después de la incubación, el grado de neutralización se determina cuantificando las células infectadas por el...

Un método de inmunofluorescencia para medir la neutralización del citomegalovirus humano

Describimos el ensayo de lectina ligado a enzimas (ELLA) para medir los títulos de anticuerpos inhibidores de la neuraminidasa (NA) de la influenza en sueros. El ensayo utiliza aglutinina de cacahuete para cuantificar los residuos de galactosa que se vuelven accesibles cuando la NA elimina el ácido siálico de las placas de 96 pocillos recubiertas de fetuina.

La medición de la influenza neuraminidasa inhibición títulos de anticuerpos mediante un ensayo de lectina ligado a enzimas

Este estudio describe una   -Imagen basado ensayo de micro-neutralización para analizar las relaciones antigénicas entre los virus. El protocolo emplea un escáner de superficie plana y tiene cuatro pasos, incluyendo la titulación, la cuantificación de titulación, neutralización, y la cuantificación de neutralización. El ensayo funciona bien con pdm09 corriente que circula la gripe A (H1N1), A (H3N2), virus A y B.

Optimización de un ensayo cuantitativo micro-neutralización

Los protocolos presentados describen cómo realizar un ensayo de inhibición de hemaglutinación para cuantificar los títulos de anticuerpos específicos de la gripe de las muestras de suero de los receptores de la vacuna de influenza. El primer ensayo determina las concentraciones óptimas de antígeno viral por hemaglutinación. El segundo ensayo cuantifica los títulos de anticuerpos específicos de la gripe por inhibición de la hemaglutinación.

Un ensayo de hemaglutinación optimizado inhibición (HI) para cuantificar los títulos de anticuerpos específicos de la gripe

Virus de la gripe A (gripe) son importantes patógenos respiratorios humanos. Para entender la patogenicidad de gripe y realizar ensayos preclínicos de vacunas nuevos enfoques, modelos animales, imitar la fisiología humana se requieren. Aquí, describimos las técnicas para evaluar el IAV patogenia, respuesta humoral y eficacia de la vacuna utilizando un modelo murino de infección.

Estudios de Virus de influenza A en un modelo murino de infección

Se describe un método por el cual identificamos residuos críticos necesarios para la Unión de humanos o murinos anticuerpos monoclonales dirigidos a la hemaglutinina viral del virus de la gripe A. El protocolo puede ser adaptado a otras glicoproteínas de superficie del virus y sus correspondientes anticuerpos neutralizantes.

Generación de variantes de Escape de neutralizar anticuerpos Monoclonal del Virus de la Influenza

Aquí describimos un protocolo para el empaquetado de pseudovirus y la medición de la actividad neutralizante de anticuerpos.

Preparación de virus de la influenza aviar H5 pseudotipificados con el método de transfección de fosfato de calcio y medición de la actividad neutralizante de anticuerpos

Aprende a medir anticuerpos neutralizantes contra el virus H3N2 en suero humano mediante ensayos de microneutralización con células MDCK-SIAT1. Este método evalúa la inmunidad postvacunal.

Medición de Influenza neutralizando las respuestas del anticuerpo al virus a (H3N2) en suero humano por microneutralización ensayos utilizando células de MDCK-SIAT1 (Video) | JoVE Journal

Medición de Influenza neutralizando las respuestas del anticuerpo al virus a (H3N2) en suero humano por microneutralización ensayos utilizando células de MDCK-SIAT1

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